JPS6017513B2 - 固定化酵素反応方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はポリイオンコンプレツクスに固定化された酵素
または菌体を用いて酵素反応を行なう方法に関するもの
である。

詳しくは酵素または酵素活性を有する菌体をポリカチオ
ンポリマーとポリアニオンポリマーとから形成されるポ
リィオンコンプレックスに吸着固定化せしめた水不溶性
の酵素活性物質を用いて酵素反応を行なう方法に関する
ものであり、このようなポリイオンコンプレツクスを利
用した酵素固定化方法についての報告例は今まで知られ
ていない。近年酵素または菌体の固定化に関して、固定
化技術の開発、固定化された水不綾性の酵素活性物質を
用いての酵素反応プ。

セスの開発には自覚しいものがある。従来の酵素反応が
水熔性の酵素を用い、酵素は１回ごとに使い捨てされて
きたのに対し、固定化酵素プロセスでは、酵素が長時間
反復使用できる上に、反応方式をバッチ法から連続法に
変えることが可能になったため反応を極めて効率的、経
済的に行なえると云う利点がある。然しながら、固定化
酵素に関する従来の膨大な報告に比し、実際に工業化さ
れた技術の例は、わずか数例に過ぎない。その理由とし
て、従来報告されている固定化方法が繁雑であり実際的
でなかったり、固定化に手間をかけた割に寿命が短いた
め固定化の利点がない等、工業的に実施する場合には多
くの問題点があった。また、従来の方法はある酵素系に
適用可能な方法も他の系には適用できないと云うものが
多かった。従って固定化の工程が簡単であり、しかも汎
用性のある固定化技術の開発が待望されている。本発明
者は、か）る要求に適応した新しい固定化技術を関発す
べく鋭意研究を重ねた結果本発明に到達した。本発明は
ポリカチオンポリマ−とポリアニオンポリマーとから形
成される水不熔性のポリィオンコンプレツクスに吸着固
定化された酵素または菌体を用いることを特徴とする酵
素反応方法に関するものである。

従来からポリマーイオンと酵素たん白または菌体との相
互作用についてはよく知られている。

例えば不落・性のポリマーイオンであるイオン交換樹脂
に酵素を吸着せしめることもその１例と云える。水溶性
のポリマーイオンと酵素たん白がコンプレックスを形成
しある場合には、水不溶性になって沈澱することを利用
して酵素の分離・精製の手段に用いられることも知られ
ている。また菌体の懸濁液にポリエチレンィミンのよう
なポリマーイオンを添加して、菌体を凝集沈澱せしめる
ことも知られている。しかしながら、酵素または菌体と
ポリマーイオンが相互作用しても必ずしも凝集沈澱する
とは限らず、また例え沈澱したとしても固定化酵素剤と
して使用するに通さないような形態であることが多い。

水に不溶性の架橋されたポリマーイオンであるイオン交
モ期間脂に酵素を吸着担特せしめる方法は、ある場合に
はすぐれた方法であるが多くの場合、吸着された酵素が
脱離し易いと云う欠点がある。本発明者は、ポリマーイ
オンと酵素または菌体の相互作用に着目すると共に従来
知られているような上述の諸法の欠陥を克服した新しい
固定化方法として、ポリカチオンポリマーとポリアニオ
ンポリマーとから形成されるポリイオンコンプレツクス
に酵素または酵素活性を有する菌体を固定化する方法を
開発し、本発明を完成するに至った。

水溶性のポリカチオンポリマーとポリアニオンポリマ−
とから水不溶性のポリィオンコンプレックスが形成され
ることは知られていたが、本発明者は水溶液中からポリ
ィオンコンプレックスが生成、沈澱する際に、酵素また
は菌体が共存する時ポリィオンコンプレックスに酵素ま
たは菌体が効率よく吸着固定化され、このものが固定化
酵素剤として使用できることを見出した。このようなポ
リィオンコンプレックスに酵素または酵素活性を有する
菌体を吸着固定化せしめた不溶性酵素活性物質を使用し
て酵素反応を行なうことは従来全く知られていない新規
な方法である。

また本発明者は、ある場合にはあらかじめ、ポリ力チオ
ンポリマ−とポリアニオンポリマーとからポリィオンコ
ンプレックスを形成せしめた後、水性媒体中で酵素また
は酵素活性を有する菌体と接触せしめる方法によっても
酵素または菌体をポリィオンコンプレックスに吸着固定
化させることができ、このものが固定化酵素剤として使
用できることも見出した。本発明方法は固定化の操作が
極めて簡便であると云う利点がある他、適用範囲が極め
て広い汎用性のある固定化方法であることも特徴の一つ
である。本発明において固定化の対象となる酵素または
酵素活性を有する菌体の態様としては菌体培養液、洗浄
菌体、菌体破砕物、粗酵素抽出液、粗製酵素、精製酵素
等があげられる。

また、本発明は、任意の酵素もしくは酵素活性を有する
菌体（細菌、放線菌、酵母、カビ等）を用いる酵素反応
に適用できる。本発明に使用できる酵素としては、例え
ば、グルコースィソメラーゼ、ィンベルターゼ、グルコ
アミラーゼ、Ｑーアミラーゼ、Ｐ−アミラーゼ、プルラ
ナーゼ、セルラーゼ、キモトリプシン、パパイン、リパ
ーゼ、アミノアシラーゼ、シスヱポキシコハク酸ハイド
ロラーゼ、フマラーゼ、アス／ぐルターゼ、アス／ぐラ
ギ１ナーゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ、パーオキシダー
ゼ、Ｌーアミノ酸オキシターゼ、グルタチオンレダクタ
−ゼ等があげられる。また酵素活性を有する菌体として
は、例えばアルカリゲネス、バチルス、ミクロコツカス
、ブレビバクテリウム、コリネバクテリウム、アルスロ
バクター、ノカルデイア、ストレプトマイセス、ベニシ
リウム、サツカロミセス等の属に属する菌体があげられ
る。本発明において用いられるポリマーイオンとしては
、ポリスチレンスルホン酸、ポリ硫酸ピニル、リグニン
スルホン酸等の強酸性の水溶性ポリアニオン、ポリグル
タミン酸、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、ァルギ
ン酸等の弱酸性の水溶性ポリアニオン、ポリビニルベン
ジルトリメチルアンモニウム塩、ポリビニルーＮーメチ
ルピリジニウム塩等の強塩基型水溶性ポリカチオン、ポ
リビニルピリジン、ポリエチレンイミン、ポリリジン等
の弱塩基型水溶性ポリカチオン等があげられる。

また水不溶性の架橋高分子イオンである通常のカチオン
交換樹脂、ァニオン交換樹脂を本発明においてポリィオ
ンコンプレツクスを形成する一方のポリマーイオン成分
として用いることもできる。上記のような有機性のポリ
マーイオンの他縮合ケイ酸塩等の無機性ポリアニオンポ
リマ−を用いることも可能でありその一例として水ガラ
スをあげることができる。本発明においては、使用する
ポリカチオンポリマ−、ポリアニオンポリマ−の組合せ
の少くとも一方が、水瀞性のポリマーイオンであること
が本発明方法を実施する際の好ましい条件である。

ポリマーイオンとして実際にどのような組合せを用いる
かは、固定化すべき酵素または酵素活性を有する菌体に
より、又条件により適宜選択するが、例えば水溶性のポ
リマーイオン同士の組合せの場合には、一般に強酸型の
ポリアニオンと強塩基型のポリカチオンの組合せの時に
、得られる酵素活性を有するポリィオンコンプレックス
が取り扱い易い等の利点がある。本発明において、酵素
または酵素活性を有する菌体を含有するポリィオンコン
プレックスを調製する際の条件について以下に説明する
。

酵素または酵素活性を有する菌体を含む水性媒体中にポ
リマ−イオンを添加し、いまら〈濃伴した後、先に添加
したポリマーイオンと反対の荷電を有するポリマーイオ
ンを添加すればよい。ポリカチオンポリマ−とポリアニ
オンポリマーの添加順序については、固定化の対象とな
る酵素または酵素活性を有する菌体によって異なり、添
加順序により得られる間定イ技酵素剤の活性が影響を受
ける場合もあり無関係の場合もある。上記のようにあら
かじめ酵素または酵素活性を有する菌体をポリマーイオ
ンの一方と接触させた後に、反対荷電のポリマ−イオン
を添加する方法はより好ましい方法であるが、別にポリ
カチオンポリマーとポリアニオンボリマーとからポリイ
オンコンプレックスを生成せしめた後に、これを酵素ま
たは酵素活性を有する菌体と水性媒体中で接触せしめる
ことにより、酵素または菌体をポリィオンコンプレツク
スに吸着固定化せしめる方法をとることもできる。

本発明において使用するポリマーイオンの量は、生成す
るポリィオンコンプレックスの重量が、固定化すべき酵
素または酵素活性を有する菌体と同量もしくは同量以上
であることが望ましい。

使用するポリカチオンポＩＪマ−とポリアニオンポリマ
ーの量的な関係については水瀞性の強塩基性、強酸性ポ
リマーイオン同志の場合は、イオン当量が１対１である
ように選べばよいが、一般には組合せによって１対１で
ない場合が多い。一方のポリマーイオンが過剰であれば
ポリィオンコンプレックスを沈澱せしめた時、過剰のポ
リマーイオンが液中に残存することになるからあらかじ
め、予備実験により当量関係を求めておけば、一方のポ
リマーイオンを過剰に使い過ぎる無駄をなくすることが
できる。酵素または酵素活性を有する菌体を含有するポ
リィオンコンプレックスを生成せしめる際の温度、ＦＨ
‘ま、酵素活性を低下させない範囲で適宜選ぶことがで
きるが、温度については室温前後、ｐＨについては酵素
の至適ｐＨ附近が好ましい。

本発明において酵素反応は特に限定されないが、酵素ま
たは酵素活性を有する菌体を含有するポリィオンコンプ
レックスが徴粉体の形で得られる場合には、フィルター
で仕切られた反応器中に懸濁させた蝿梓槽型の反応器を
用いて酵素反応を行なうことができる。またフィルター
上にケーキとして固定し、反応液を炉過しなから酵素反
応を行なう方式をとることもできる。更に酵素または酵
素活性を有する菌体を含有するポリィオンコンプレック
スを粒状に成形するとか、または粒状の多孔性坦体上に
分散させることも可能でありこの場合はこれらをカラム
に充填したカラム反応方式をとることができる。以下実
施例によって本発明をさらに具体的に説明するが、本発
明はこれのみに限定されるものではない。

なお、実施例において用いられるリン酸緩衝液はリン酸
１水素２ナトリウムとリン酸２水素１ナトリウムとから
、また酢酸緩衝液は酢酸と酢酸ナトリウムとから常法に
より調製した。また本実施例において用いられるポリマ
ーイオンのうち、ポリアクリル酸ソーダ、ポリエチレン
ィミン、ボリビニル硫酸カリは市販品を使用した。ポリ
（Ｎーメチル−２ーメチルー５−ビニルピリジン）アィ
オダイド（以下ＰＭＶＰと略す）は、２−メチル−５ー
ビニルピリジンを重合して得た分子量約４万のポリマー
をョウ化メチルで４級化したものを用いた。またポリス
チレンスルホン酸カリ（以下ＰＳＳＫと略す）は、スチ
レンスルホン酸カリを重合して得た分子量約１０万のポ
リマーを使用した。実施例 １〜３ グルコースィソメラーゼ菌体（グルコースイソメラーゼ
ナガセ、長瀬産業■製）をｐＨ７．２の０．０９Ｍリン
酸緩衝液に懸濁した。

この懸濁液の活性力価は２．５８Ｕ′の‘であった。こ
の懸濁液各５肌‘（すなわち総活性力価は１２．９Ｕ）
をビーカーにとり、２．１％ＰＭＶＰ水溶液１０叫を加
え蝿拝する。その各々に、２．２％ＰＳＳＫ水溶液１０
地（実施例１）、１．６％ポリピニル硫酸カリ水溶液（
実施例２）、１．３％ケイ酸水溶液（実施例３）を添加
し、約５分間蝿拝した後炉過、水洗して、不落化グルコ
−スィソメラーゼ剤を得た。実施例３で用いたケイ酸水
溶液はＳｉ０２／Ｎａ２０モル比３．２５の水ガラスを
希釈、使用直前に塩酸でｐＨ７〜８に中和したものを用
いた。（以後の実施例で用いたケイ酸水溶液も同様に調
製した。）グルコースイソメラーゼ活性の測定は、次の
ようにして行なった。基質溶液としてグルコース０．２
ｍｏｌｅ／そ、ＭｇＳ０４７日２００．０２ｍｏｌｅ／
そを含む０．０肌リン酸緩衝液（ＰＨ７．２）を用意す
る。菌体懸濁液の場合は、菌体懸濁液１の‘に上記基質
溶液１の‘を加える。実施例１〜３の固定化菌体は、基
質溶液５の‘、０．０５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）
５机上に懸濁する。これらの混合液を６０℃に１時間保
持し反応させた後、生成したフラクトース量をシスティ
ン・カルバゾール硫酸法により測定した。活性力価ＩＵ
とは、上記条件でフラクトース１倣を生成する酵素量と
定義する。上記のごとく調製した固定化酵素剤の活性を
測定した結果を表１に示す。表 １ なお表中の活性比は、｛（固定化酵素剤の活性力価）／
（使用した菌体懸濁液の総活性力価）｝ ×１００で定
義した。

なお実施例１の固定化グルコ−スィソメラーゼ剤を反応
後炉別、水洗し再度反応に用いることをくり返したが、
５回目でも活性低下を認めなかった。実施例 ４〜６ グルコースイソメラーゼ・ナガセをｐＨ７．２の０．０
Ｍリン酸緩衝液に懸濁した。

この懸濁液の活性力価は３．６Ｕ／机【であった。この
懸濁液５Ｍ（総活性力価１８Ｕ）に、２．１％ＰＭＶＰ
水溶液ｌｏｗ【、２．２％ＰＳＳＫ水溶液１０の【を、
実施例４ではＰＭＶＰ→ＰＳＳＫの順に、実施例５では
その逆の順序を添加し、ポリィオンコンプレックスに固
定化された不溶性グルコースィソメラーゼ剤を調製した
。また実施例６では、２．１％ＰＭＶＰ水溶液１０柵と
２．２％ＰＳＳＫ水溶液１０の‘を混合し、ポリィオン
コンプレツクスを生成せしめ、これに菌体、懸濁液５の
‘を添加して、不溶性グルコースィソメラーゼ剤を調製
した。活性の測定は実施例１〜３と同様にして行なった
。結果を表２に示す。なお反応後炉別水洗して回収した
不溶性グルコースィソメラーゼをくり返し使用したが、
５回目でも活性低下が認められなかった。表 ２ 実施例 ７〜９ グルコースィソメラーゼナガセを用いて、超音波処理に
より、グルコースイソメラーゼ粗酵素抽出液を調製した
。

このグルコースィソメラーゼ抽出液の活性力価は、５．
９Ｕ′泌であった。この抽出液５の【（総活性力価２９
．５Ｕ）に、２．１％ＰＭＶＰ水溶液１０の‘、２．２
％ＰＳＳＫ水溶液１０の‘を、実施例７ではＰＭＶＰ→
ＰＳＳＫの順に、実施例８ではその逆の順序で添加し、
ポリィオンコンプレツクスに固定化された不落’性グル
コースイソメラーゼ剤を調製した。また、実施例９では
、２．１％ＰＭＶＰ水溶液１０羽と２．２％ＰＳＳＫ水
溶液１０叫を混合し、ポリィオンコンプレックスを生成
せしめ、これに粗酵素抽出液５の‘を添加して不溶性グ
ルコースィソメラーゼ剤を調製した。活性の測定は実施
例１〜３と同様にして行なった。結果を表３に示す。な
お反応後炉別水洗して回収した不溶性グルコースイソメ
ラーゼをくり返し使用したが、５回目でも活性低下が認
められなかった。表 ３ 実施例 １０ １．３％ケイ酸水溶液（ｐＨ７に中和した）３０の‘に
２．１％ＰＭＶＰ水溶液３０肌を加え、生成したポリィ
オンコンブレックスを炉別、水洗、乾燥した。

このポリィオンコンプレックス０．５夕を実施例７〜９
で用いたグルコースィソメラーゼ粗酵素抽出液５叫（総
括性力価２９．５Ｕ）に加え、凝梓後、炉別、水洗して
、不溶性グルコースィソメラーゼ剤を得た。このように
して得られたグルコースィソメラーゼ剤を用いて酵素反
応を行なったところ、その活性力価は２９Ｕ（活性比９
８％）であった。なお反応後、炉別、水洗して岡定イ技
酵素を回収し３回くり返し使用したが活性低下は殆んど
認められなかった。比較例 １ 実施例１０との比較のために、ＭＲ型の強塩基性アニオ
ン交換樹脂であるアンバーライトＩＲＡ−９０４（Ｓ０
４型）を０．５夕用いて実施例１０と同様に、グルコー
スイソメラーゼ粗酵素抽出液５の【（総括性力価２９．
５Ｕ）を用い、不溶性グルコースィソメラーゼ剤を調製
した。

この不瀞性グルコースイソメラーゼ剤の活性を測定した
ところ、２１Ｕ（活性比７１％）であった。反応後、炉
別、水洗して、固定化グルコースィソメラーゼ剤を回収
し、再使用したところ活性は１２Ｕ‘こ低下した。実施
例 １１〜１３ ノカルデイア タータリカンス（Ｎｏｃａｒｄｉａねｒ
ｔａｒｉｃａｎｓ）ｎｏｖ．ｓｐ．ＥＳ３一Ｔ株（徴工
研菌寄３３７４号）をプロピレングリコール１％、尿素
０．３％ 、 ＫＨ２Ｐ０４０．２ ％ 、 Ｎａ２Ｈ
Ｐ０４０．２ ％ 、ＭｇＳ０４７日２００．１ ％
、 ＦｅＳ０４７比００．００１ ％ 、ＣａＣ１２２
も００．００３％、ＭｎＳ０４４日２００．０００４％
、酵母エキス０．０５％、界面活性剤プルロニックＬ−
６１０．１％から成る組成の培地（ｐＨ７．０）１０そ
を含む２０そジャーファーメンターに接種・培養し、対
数増殖期にシスェポキシコハク酸ジナトリウム０．５％
を添加し、３０午０で２畑時間培養し、シスェポキシコ
ハク酸ハイドロラーゼ活性を有する菌体を得た。

得られた培養液の菌体濃度は４．６夕／そ、シスェポキ
シコハク酸ハイドロラーゼの活性力価は、８９．５Ｕ／
泌であった。この培養液各５の‘をビーカーにとり、０
．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）１０の‘を加え鷹拝
する。実施例１１では、これに、５％ポリエチレンイミ
ン水溶液１の【（塩酸でｐＨ８になるように中和してお
く）を加え、次いで２．５％ポリアクリル酸ソーダ水溶
液１の‘を添加した。実施例１２では、２．２％ＰＳＳ
Ｋ水溶液１０の【次いで、２．１％ＰＭＶＰ水溶液を添
加した。

実施例１３では、２．１％ＰＭＶＰ水溶液５の‘を先に
添加し、次いで１．３％ケイ酸水溶液１０の‘を加えた
。

かくして得られた沈澱物を炉別、水洗して、固定化菌体
を得た。培養液、固定化菌体の酵素活性の測定は次のよ
うにして行なった。

２Ｍシスェポキシコハク酸ジナトリゥム水溶液、５％Ｂ
Ｌ−班Ｘ水溶液（非イオン系界面活性剤、日光ケミカル
ズ欄製）、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ８）の３対０．
あげ６．８の容積比から成る混合溶液を基質溶液とする
。

培養液１私と基質溶液２の‘とから成る混合溶液または
、基質溶液１０の‘と０．１Ｍリン酸緩衝液５の‘から
成る混合溶液に上記固定化菌体を懸濁させた液を４０ｑ
ｏで１時間振とう反応せしめ、生成する酒石酸をメタバ
ナジン酸アンモン試薬を用いる比色法により定量した。
上記反応条件下で酒石酸１雌を生成するシスェポキシコ
ハク酸ハイドロラーゼ量を活性力価ＩＵとする。上記で
調製した固定化菌体を用いて、酵素反応を行なった結果
を表４に示す。

表 ４ 実施例 １４ 市販のィンベルターゼ（酵母製、和光純薬工業欄製）の
希釈水溶液を調製し、その活性力価は、７５．５Ｕ′の
【であった。

このィンベルターゼ溶液５舷に１．６％ポリビニル硫酸
カリ水溶液１０の‘を加え鷹拝し、次いで２．１％ＰＭ
ｙＰ水溶液１０叫を加え、沈澱を炉別、水洗して水不綾
性ィンベルターゼ剤を得た。ィンベルターゼ活性の測定
は次のようにして行なった。ィンベルターゼ溶液１叫、
０．３Ｍシュークロース水溶液１の‘、０．０３Ｍ酢酸
緩衝液（ｐＨ５．６）１泌から成る混合液または、０．
３Ｍシュークロース水溶液５の‘、０．０３Ｍ酢酸緩衝
液（ｐＨ５．６）５泌、水５の上から成る混合液中に上
記水不溶性ィンベルターゼを懸濁したものを、４０００
に２０分保持し、反応せしめた後、生成する還元糖をジ
ニトロサリチル酸法により定量した。上記条件下に、還
元糖１雌を生成する酵素量をＩＵとする。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 固定化酵素を用いる反応において、ポリカチオンポ
   リマーと、ポリアニオンポリマーとから形成される水不
   溶性のポリイオンコンプレツクスに吸着固定化された酵
   素または酵素活性を有する菌体を用いることを特徴とす
   る酵素反応方法。 ２ ポリカチオンポリマー、ポリアニオンポリマーの少
   くとも一方が水溶性ポリマーであることを特徴とする特
   許請求の範囲１項記載の方法。 ３ 酵素または酵素活性を有する菌体とポリカチオンポ
   リマーまたはポリアニオンポリマーを含有する水性媒体
   中に反応荷電を有するポリマーイオンを添加することに
   よりポリイオンコンプレツクスに固定化せしめた酵素ま
   たは酵素活性を有する菌体を用いることを特徴とする特
   許請求の範囲１項記載の方法。 ４ ポリカチオンポリマーとポリアニオンポリマーとか
   ら形成されたポリイオンコンプレツクスと酵素または酵
   素活性を有する菌体を水性媒体中で接触せしめることに
   より、酵素または酵素活性を有する菌体を吸着固定化せ
   しめたポリイオンコンプレツクスを用いることを特徴と
   する特許請求の範囲１項記載の方法。 ５ 酵素または酵素活性を有する菌体として培養液、菌
   体、菌体破砕物、粗酵素抽出液、粗製酵素または精製酵
   素を用いることを特徴とする特許請求の範囲１項記載の
   方法。 ６ 酵素または酵素活性を有する菌体として、グルコー
   スイソメラーゼまたはグルコースイソメラーゼ活性を有
   する菌体を用いることを特徴とする特許請求の範囲１項
   記載の方法。 ７ 酵素または酵素活性を有する菌体としてシスエポキ
   シコハク酸ハイドロラーゼまたはシスエポキシコハク酸
   ハイドロラーゼ活性を有する菌体を用いることを特徴と
   する特許請求の範囲１項記載の方法。 ８ 酵素としてインベルターゼを用いることを特徴する
   特許請求の範囲１項記載の方法。