JPS6019990B2 - 発酵法によるウリカ−ゼの製造法 - Google Patents
発酵法によるウリカ−ゼの製造法Info
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- JPS6019990B2 JPS6019990B2 JP52075694A JP7569477A JPS6019990B2 JP S6019990 B2 JPS6019990 B2 JP S6019990B2 JP 52075694 A JP52075694 A JP 52075694A JP 7569477 A JP7569477 A JP 7569477A JP S6019990 B2 JPS6019990 B2 JP S6019990B2
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Description
【発明の詳細な説明】
本発明は発酵法によるゥリカーゼの製造法に関する。
さらに詳しくは、本発明はェンテロバクター属に属し、
ウリカーゼ生産館を有する微生物を栄養培地に培養し、
培養物中にウリカーゼを生成せしめ、これを採取するこ
とを特徴とするウリカーゼの製造法に関する。ウリカー
ゼ（ＥＣＩ．７．３．３）は尿酸をアラントインに酸化
する作用を触媒する酵素であり、尿酸の定量に使用され
る。
ウリカーゼ生産館を有する微生物を栄養培地に培養し、
培養物中にウリカーゼを生成せしめ、これを採取するこ
とを特徴とするウリカーゼの製造法に関する。ウリカー
ゼ（ＥＣＩ．７．３．３）は尿酸をアラントインに酸化
する作用を触媒する酵素であり、尿酸の定量に使用され
る。
従来、発酵法によるウリカーゼの製造法としては、ミク
ロコッカス属、ブレビバクテリウム属（特公昭４４一１
４７８３号）、キャンディダ属（袴公昭４２−５１９２
号）、ストレプトミセス属（Ａ亀ｉｃ．ＢｉｏＩＣｈｅ
ｍ．Ｖｏｌ．３３，１２８２，１９６９）などに属する
微生物を用いる多くの方法が知られている。本発明者ら
はウリカーゼを生産する能力を有する微生物を広範囲に
わたり険策した結果、ェンテロバクター属に属する菌株
がウリカーゼを箸量に生産することを見出し本発明を完
成するに到った。
ロコッカス属、ブレビバクテリウム属（特公昭４４一１
４７８３号）、キャンディダ属（袴公昭４２−５１９２
号）、ストレプトミセス属（Ａ亀ｉｃ．ＢｉｏＩＣｈｅ
ｍ．Ｖｏｌ．３３，１２８２，１９６９）などに属する
微生物を用いる多くの方法が知られている。本発明者ら
はウリカーゼを生産する能力を有する微生物を広範囲に
わたり険策した結果、ェンテロバクター属に属する菌株
がウリカーゼを箸量に生産することを見出し本発明を完
成するに到った。
以下本発明をさらに詳細に説明する。
本発明によれば、ェンテロバクター属に属し、ゥリカー
ゼ生産能を有する微生物を栄養培地に塔養すれば培養物
中にウリカーゼが生成するので、これを採取する。
ゼ生産能を有する微生物を栄養培地に塔養すれば培養物
中にウリカーゼが生成するので、これを採取する。
本発明に使用される微生物は、ェンテロバクター属に属
し、ゥリカーゼを生産する能力を有するものであれば、
いずれの菌株でもよい。
し、ゥリカーゼを生産する能力を有するものであれば、
いずれの菌株でもよい。
好適な菌株の一例としてはェンテロバクタ−・クロアカ
ェ（Ｅｎｔｅｒｏ舷ｃｔｅｒｃｌｏａｃａｅ）ＫＹ−３
０６６（徴工研菌寄第４０７７号、ＮＲＲＬ Ｂ−１１
１５５）があげられる。ェンテロバクター・クロアカェ
の菌学的性質についてはＢｅｒｇｅｙ’ ｓ Ｍａｎ
ｕａｌ ｏｆ Ｄｅｔｅｎｎｉｎａｔｉｖｅ母ｃｔｅｒ
ｉｏｌｏ戦 第８巻３２５頁に記載がある。本発明に使
用される栄養塔地は炭素源、窒素源、無機物、その他使
用菌株の必要とする徴量栄養素を程よく含有するもので
あれ‘ざ合成培地、天然塔地のいずれも使用可能である
。炭素源としては、グルコース、フラクトーク、シュク
ロース、糖蜜などの炭水化物、グアニン、ヒポキサンチ
ン、キサンチンなどの核酸類、尿酸などが用いられる。
ェ（Ｅｎｔｅｒｏ舷ｃｔｅｒｃｌｏａｃａｅ）ＫＹ−３
０６６（徴工研菌寄第４０７７号、ＮＲＲＬ Ｂ−１１
１５５）があげられる。ェンテロバクター・クロアカェ
の菌学的性質についてはＢｅｒｇｅｙ’ ｓ Ｍａｎ
ｕａｌ ｏｆ Ｄｅｔｅｎｎｉｎａｔｉｖｅ母ｃｔｅｒ
ｉｏｌｏ戦 第８巻３２５頁に記載がある。本発明に使
用される栄養塔地は炭素源、窒素源、無機物、その他使
用菌株の必要とする徴量栄養素を程よく含有するもので
あれ‘ざ合成培地、天然塔地のいずれも使用可能である
。炭素源としては、グルコース、フラクトーク、シュク
ロース、糖蜜などの炭水化物、グアニン、ヒポキサンチ
ン、キサンチンなどの核酸類、尿酸などが用いられる。
窒素源としては塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、
リン酸アンモニウム、グアニン、ヒポキサンチン、キサ
ンチンなどの核酸類、グルタミン酸などのアミノ酸類、
尿酸など無機あるいは有機の窒素化合物が使用できる。
リン酸アンモニウム、グアニン、ヒポキサンチン、キサ
ンチンなどの核酸類、グルタミン酸などのアミノ酸類、
尿酸など無機あるいは有機の窒素化合物が使用できる。
さらに窒素源としては、ベプトン、肉エキス、酵母エキ
ス、コーン・スチーブ・リカーなどの窒素含有天然物も
使用できる。無機物としては、リン酸ーカリウム、リン
酸二カリウム、硫酸マグネシウムなどが使用できる。
ス、コーン・スチーブ・リカーなどの窒素含有天然物も
使用できる。無機物としては、リン酸ーカリウム、リン
酸二カリウム、硫酸マグネシウムなどが使用できる。
本発明においては、培地中に尿酸をウリカーゼの誘導物
質として存在せしめることにより、ウリカーゼの生成量
を増加せしめることができる。尿酸は培地中に最初から
存在せしめても良いし、培養途中に培地に添加しても良
い。培養途中に添加する場合は、使用微生物の対数増殖
期の終了までに添加するのが好ましい。培地中の尿酸濃
度は０．趣ノｄ‘以上が好ましい。培養は、通常振遼培
養あるいは通気輝梓培養で行う。
質として存在せしめることにより、ウリカーゼの生成量
を増加せしめることができる。尿酸は培地中に最初から
存在せしめても良いし、培養途中に培地に添加しても良
い。培養途中に添加する場合は、使用微生物の対数増殖
期の終了までに添加するのが好ましい。培地中の尿酸濃
度は０．趣ノｄ‘以上が好ましい。培養は、通常振遼培
養あるいは通気輝梓培養で行う。
培養温度は２０〜４０℃、好適には２５〜３０ｑｏで行
う。培地のｐＨは５．０〜９．欧庁通には７．０〜９．
０の範囲にあることが望ましい。培養期間は、１〜５日
、通常は２〜３日間である。かくして培養することによ
り、培養物中、主として菌体中にウリカーゼが生成蓄積
する。
う。培地のｐＨは５．０〜９．欧庁通には７．０〜９．
０の範囲にあることが望ましい。培養期間は、１〜５日
、通常は２〜３日間である。かくして培養することによ
り、培養物中、主として菌体中にウリカーゼが生成蓄積
する。
培養物中からウリカーゼの採取は次のごとく行つｏ培養
終了後、培養物から菌体を遠Ｄ分離などにより取得し、
ついでこの菌体を適当な手段で破砕し、破砕液から遠心
分離等によって上蒲液を得る。
終了後、培養物から菌体を遠Ｄ分離などにより取得し、
ついでこの菌体を適当な手段で破砕し、破砕液から遠心
分離等によって上蒲液を得る。
上清液を、通常酵素精製に用いられる方法、たとえば塩
祈、有機溶媒沈澱、透析、イオン交換セルロースクロマ
ト、セフアデツクスカラムクロマト、イオン交換セファ
デックスカラムクロマト、凍結乾燥などの方法にて処理
する。かくして精製ウリカーゼを得ることができる。本
発明に於けるウリカーゼの活性は次の方法で測定する。
祈、有機溶媒沈澱、透析、イオン交換セルロースクロマ
ト、セフアデツクスカラムクロマト、イオン交換セファ
デックスカラムクロマト、凍結乾燥などの方法にて処理
する。かくして精製ウリカーゼを得ることができる。本
発明に於けるウリカーゼの活性は次の方法で測定する。
２０岬／ｄ‘の尿酸を含む０．２Ｍホウ酸バッファー（
ｐＨ９．０）溶液２．０泌に活性を測定すべき酵素溶液
０．５の‘を添加し、酸素の存在下、３７００で１０分
間反応させる。
ｐＨ９．０）溶液２．０泌に活性を測定すべき酵素溶液
０．５の‘を添加し、酸素の存在下、３７００で１０分
間反応させる。
反応後０．１Ｎ塩酸４７．５の‘を添加し２８丸ｍでの
吸光度を測定し、これを１び分間反応値とする。コント
ロールのために、尿酸を含む溶液に、酵素液を添加した
直後に０．１Ｎ塩酸を加え、２８劫ゆでの吸光度を測定
し、これをコントロール値とする。ウリ力−ゼの単位は
、三菱夢Ｘ酵素液の希釈率（△ＯＤ２斑はコントロール
値からＩＱ分間反応値を引いた値）として表示される（
Ｊ．し．Ｍａｈｌｅｒ，Ａ岬ｌｙｔｉｃａＩＢｉｏｃｈ
ｅｍｉｓｔび，３８，６５ １９７垣参照）。
吸光度を測定し、これを１び分間反応値とする。コント
ロールのために、尿酸を含む溶液に、酵素液を添加した
直後に０．１Ｎ塩酸を加え、２８劫ゆでの吸光度を測定
し、これをコントロール値とする。ウリ力−ゼの単位は
、三菱夢Ｘ酵素液の希釈率（△ＯＤ２斑はコントロール
値からＩＱ分間反応値を引いた値）として表示される（
Ｊ．し．Ｍａｈｌｅｒ，Ａ岬ｌｙｔｉｃａＩＢｉｏｃｈ
ｅｍｉｓｔび，３８，６５ １９７垣参照）。
１分間に１ｒｍｏｌｅの尿酸を分解する酵素量を１単位
（Ｕ）とする。
（Ｕ）とする。
以下実験例１によって培地中の尿酸濃度の好適な範囲を
示す。
示す。
実験例 １
尿酸（第１表に示す濃度）、コーン・スチープ・リカー
０．舵／ｄ‘、酵母エキス０．酸／ｄ‘、ＫＨ２Ｐ０４
０．１ｇ／の、Ｍ簿０４・７＆００．０雛／ｄ‘より成
る溝地（ｐＨ７．４）１０の‘を７０の‘容試験管に入
れ、１２０℃で１接合間殺菌する。
０．舵／ｄ‘、酵母エキス０．酸／ｄ‘、ＫＨ２Ｐ０４
０．１ｇ／の、Ｍ簿０４・７＆００．０雛／ｄ‘より成
る溝地（ｐＨ７．４）１０の‘を７０の‘容試験管に入
れ、１２０℃で１接合間殺菌する。
各培地にェンテロバクタ−・クロアカヱＫＹ３０６６を
１白金耳接種し、３０℃で４斑時間振鶴培養する。培養
終了後、培養物を遠心分離（１０００仇ｐｍ、１８分、
以下遠心分離はこの条件で行う。）して菌体を得る。こ
れを０．０８ Ｍトリスバッフアー（ｐＨ８．０）１０
の‘に懸濁し、超音波破砕機（久保田製作所製、ウルト
ラソニックジヱネレータ一ＫＭＳ−２５０型、１５０Ｗ
、１０分間）にかける。破砕液を遠０分離して上溶液を
得る。上清液を酵素液としてウリカーゼ活性を測定する
。結果も第１表に示す。第１表 尿酸濃度 ゥリカーゼ活性（Ｕ／ｄ‘）０
１．５０．１
２．７０３
３．８０．５
１２．５○‐７
１７‐〇１０
２７．９１．５
２８．５２０ ３
１．３３．０ ２９．
９４．０ ２９．９
５．０ ３０．５実
験例１の結果より、ウリカーゼの誘導物質としての尿酸
の培地中濃度は０．聡ノｄ‘以上が好適であることがわ
かる。
１白金耳接種し、３０℃で４斑時間振鶴培養する。培養
終了後、培養物を遠心分離（１０００仇ｐｍ、１８分、
以下遠心分離はこの条件で行う。）して菌体を得る。こ
れを０．０８ Ｍトリスバッフアー（ｐＨ８．０）１０
の‘に懸濁し、超音波破砕機（久保田製作所製、ウルト
ラソニックジヱネレータ一ＫＭＳ−２５０型、１５０Ｗ
、１０分間）にかける。破砕液を遠０分離して上溶液を
得る。上清液を酵素液としてウリカーゼ活性を測定する
。結果も第１表に示す。第１表 尿酸濃度 ゥリカーゼ活性（Ｕ／ｄ‘）０
１．５０．１
２．７０３
３．８０．５
１２．５○‐７
１７‐〇１０
２７．９１．５
２８．５２０ ３
１．３３．０ ２９．
９４．０ ２９．９
５．０ ３０．５実
験例１の結果より、ウリカーゼの誘導物質としての尿酸
の培地中濃度は０．聡ノｄ‘以上が好適であることがわ
かる。
次に本発明で得られるウリカーゼの性質を示す。
酵素標品は実施例１で得られたものを使用した。‘１１
安定ｐＨ範囲 酵素標品を種々のｐＨ（６．０，７．０，７．６，８．
１，８．０，８５，９．０，９．６，１０．０，１０．
５）を有する０．０９Ｍトリス・バッファーまたは０．
２Ｍホウ酸バッファーに０．２２Ｕ／の‘になるように
溶かし、各ｐＨの酵素溶液を得る。
安定ｐＨ範囲 酵素標品を種々のｐＨ（６．０，７．０，７．６，８．
１，８．０，８５，９．０，９．６，１０．０，１０．
５）を有する０．０９Ｍトリス・バッファーまたは０．
２Ｍホウ酸バッファーに０．２２Ｕ／の‘になるように
溶かし、各ｐＨの酵素溶液を得る。
ついでこれらの溶液を４５℃に３世分間保ち、処理液の
ウリカーゼ活性を測定する。
ウリカーゼ活性を測定する。
結果を第１図に示す。第１図から、本ウリカーゼの安定
袖範囲は７．５〜１０．０であることがわかる。‘２’
至薄ｐＨ酵素際品を種々の柵（６．０，７．０，７．４
．７．８，８．４，８．１，８．６，９．０，９．５，
１０．１，１０．６，１１．０）を有する０．０８Ｍト
リス・バッファーまたは０．２Ｍホウ酸バッファーに２
０岬／のの尿酸を溶解せしめ、各ｐＨの尿酸溶液を得る
。
袖範囲は７．５〜１０．０であることがわかる。‘２’
至薄ｐＨ酵素際品を種々の柵（６．０，７．０，７．４
．７．８，８．４，８．１，８．６，９．０，９．５，
１０．１，１０．６，１１．０）を有する０．０８Ｍト
リス・バッファーまたは０．２Ｍホウ酸バッファーに２
０岬／のの尿酸を溶解せしめ、各ｐＨの尿酸溶液を得る
。
この溶液２．０私に０．３Ｕ／泌のウリカーゼ溶液（０
．０８Ｍトリス・バッファー、ｐＨ８．０）０．５の【
を添加し、酵素反応を行い、酵素活性の測定を行う。結
果を第２図に示す。第２図から、本ゥリカーゼの至通解
は９．９寸近にあることがわかる。‘３’至適温度 酵素標品を０．２３Ｕ／の‘になるように０．２Ｍホウ
酸バッファ−（ｐＨ９．０）に溶解せしめる。
．０８Ｍトリス・バッファー、ｐＨ８．０）０．５の【
を添加し、酵素反応を行い、酵素活性の測定を行う。結
果を第２図に示す。第２図から、本ゥリカーゼの至通解
は９．９寸近にあることがわかる。‘３’至適温度 酵素標品を０．２３Ｕ／の‘になるように０．２Ｍホウ
酸バッファ−（ｐＨ９．０）に溶解せしめる。
反応温度を２０，２５，３０，３５ ４０，４５ ５０
，５５ ６び０とする以外は、前記ウリカーゼ活性の測
定法と同様にして、ウリカーゼ活性を測定する。結果を
第３図に示す。
，５５ ６び０とする以外は、前記ウリカーゼ活性の測
定法と同様にして、ウリカーゼ活性を測定する。結果を
第３図に示す。
第３図より本ウリカーゼの至適温度は４０３０であるこ
とがわかる。【４１ 基質特異性酵素標品を０．２４Ｕ
／の‘になるように０．２Ｍホウ酸バッファー（ｐＨ９
．０）に溶解せしめる。基質として第２表に示すものを
用いる以外は、前記ウリカーゼ活性の測定法と同様にし
て、基質の減少量を測定する。吸光度の測定波長は、各
基質における最大吸収波長を用いる。結果を第２表に示
す。第２表 基 質 ウリカーゼ活性（Ｕ／の【）尿酸
０．１２４アデニン
０グアニン ０ キサンチン ０ ヒポキサンチン ０ テオブロミン ０ テオフイリン ０ この結果、本ウリカーゼは尿酸に基質特異性を有するこ
とがわかる。
とがわかる。【４１ 基質特異性酵素標品を０．２４Ｕ
／の‘になるように０．２Ｍホウ酸バッファー（ｐＨ９
．０）に溶解せしめる。基質として第２表に示すものを
用いる以外は、前記ウリカーゼ活性の測定法と同様にし
て、基質の減少量を測定する。吸光度の測定波長は、各
基質における最大吸収波長を用いる。結果を第２表に示
す。第２表 基 質 ウリカーゼ活性（Ｕ／の【）尿酸
０．１２４アデニン
０グアニン ０ キサンチン ０ ヒポキサンチン ０ テオブロミン ０ テオフイリン ０ この結果、本ウリカーゼは尿酸に基質特異性を有するこ
とがわかる。
■ 耐熱性
．酵素標品を０．２３Ｕ／の‘になるように０．２Ｍホ
ワ酸バッファー（ｐＨ９．０）に溶解せしめる。
ワ酸バッファー（ｐＨ９．０）に溶解せしめる。
これを３０，３５４０，４５ ５０，５５ ６０，６５
℃の各温度で３の合間処理し、水道水で５分間冷却後ウ
リカーゼ活性を測定する。結果を第４図に示す。第４図
より本ウリカーゼは６５℃、３０分間の処理でも約５０
％の残存活性を有することがわかる。【６’阻害剤酵素
標品を０．２１Ｕ／の【となるように０．２いホウ酸バ
ッファー（ｐＨ９．０）に溶解せしめる。
℃の各温度で３の合間処理し、水道水で５分間冷却後ウ
リカーゼ活性を測定する。結果を第４図に示す。第４図
より本ウリカーゼは６５℃、３０分間の処理でも約５０
％の残存活性を有することがわかる。【６’阻害剤酵素
標品を０．２１Ｕ／の【となるように０．２いホウ酸バ
ッファー（ｐＨ９．０）に溶解せしめる。
種々の酵素活性阻害物質を添加する以外は、前記ウリカ
−ゼ活性の測定法と同様にしてウリカーゼ活性を測定す
る。この結果、反応系に１．３×１０‐５Ｍのｐークロ
ルマーキュリ安息香酸ナトリウムが存在すると活性は約
８０％阻害されることがわかった。また金属イオンの阻
害では、ＣｕＳ０４１．３×１０‐４Ｍで約４４％、Ｃ
ｏＣ〆２１．３×１０‐４Ｍで約５４％阻害されること
がわかった。‘７１ 分子量０．１Ｍ塩化カリウムを含
む０．０９けトリス・バッファー（ｐＨ８．０）で平衡
化したセフアデックスＧ‐２００を用いて分子量の測定
を行った。
−ゼ活性の測定法と同様にしてウリカーゼ活性を測定す
る。この結果、反応系に１．３×１０‐５Ｍのｐークロ
ルマーキュリ安息香酸ナトリウムが存在すると活性は約
８０％阻害されることがわかった。また金属イオンの阻
害では、ＣｕＳ０４１．３×１０‐４Ｍで約４４％、Ｃ
ｏＣ〆２１．３×１０‐４Ｍで約５４％阻害されること
がわかった。‘７１ 分子量０．１Ｍ塩化カリウムを含
む０．０９けトリス・バッファー（ｐＨ８．０）で平衡
化したセフアデックスＧ‐２００を用いて分子量の測定
を行った。
標準タンパク質としては、チトクロームＣ、卵アルブミ
ン、牛血清アルブミン、アルコール脱水素酵素を用いた
。その結果本ワリカーゼの分子量は１０５０００である
ことがわかった。■ 等電点イソエレクトリツク・フオ
カシング （ｌｓ舵ｌｅｃｔｒｉｃＦＭ雌ｉｎｇ）法（蛋白質・核
酸・酵素、１２，７３７，１９６７）により本ワＩＪカ
ーゼの等亀点を求めた。
ン、牛血清アルブミン、アルコール脱水素酵素を用いた
。その結果本ワリカーゼの分子量は１０５０００である
ことがわかった。■ 等電点イソエレクトリツク・フオ
カシング （ｌｓ舵ｌｅｃｔｒｉｃＦＭ雌ｉｎｇ）法（蛋白質・核
酸・酵素、１２，７３７，１９６７）により本ワＩＪカ
ーゼの等亀点を求めた。
アンフオラィン（Ａｍｐｈｏｌｉ船）（柵３．５〜５．
０の表示）と酵素液とを混ぜ、１１０の‘のカラムに充
填し、２岬時間通電後、フラクション・コレクターによ
り滋ずつ分画した。各フラクションのＰＨとゥリカーゼ
活性を測定した結果、本ゥＩＪカーゼの等亀点は柵４．
６であることがわかった。次に本発明を実施例で具体的
に説明する。
０の表示）と酵素液とを混ぜ、１１０の‘のカラムに充
填し、２岬時間通電後、フラクション・コレクターによ
り滋ずつ分画した。各フラクションのＰＨとゥリカーゼ
活性を測定した結果、本ゥＩＪカーゼの等亀点は柵４．
６であることがわかった。次に本発明を実施例で具体的
に説明する。
実施例 １
尿酸０．舷／ｄ‘、コーン・スチープ・リカー０．５ｇ
／の、酵母エキス０．鼓／ｄ‘、ブトウ糖１．５ｇ／ｄ
‘、ＫＨ２Ｐ０４０．１ｇ／の、Ｍ袋０４・７ＱＯＯ．
０鷺／のより成る種培養塔地（ｐＨ７．４）１０偽を７
０叫容試験管に入れ、１２０℃で１５分間殺菌する。
／の、酵母エキス０．鼓／ｄ‘、ブトウ糖１．５ｇ／ｄ
‘、ＫＨ２Ｐ０４０．１ｇ／の、Ｍ袋０４・７ＱＯＯ．
０鷺／のより成る種培養塔地（ｐＨ７．４）１０偽を７
０叫容試験管に入れ、１２０℃で１５分間殺菌する。
この培地にェンテロバクター・クロアカェＫＹ３０６６
を１白金耳接種し、３び○で４乳寿間振遼培養する。得
られる種培養液（第一種培養液）３０の【を２々客三角
フラスコに入れた前記と同じ種培養培地３００の【に接
種し、３ぴ０で４錨時間寂鰹培養する。得られる蟹培養
液（第二種培養液）９００泌を３０そジャーファーメン
タ−に入れた種培養培地と同じ組成の発酵塔地１５のこ
接種し、３０つ○、３０比ｐｍ、通気量１〆′〆／ｍｉ
ｎで４鉛時間本培養を行う。培養物中のウリカーゼは０
．１４Ｕ／の‘である。培養物からのウリカーゼの採取
は次のごとく行う。
を１白金耳接種し、３び○で４乳寿間振遼培養する。得
られる種培養液（第一種培養液）３０の【を２々客三角
フラスコに入れた前記と同じ種培養培地３００の【に接
種し、３ぴ０で４錨時間寂鰹培養する。得られる蟹培養
液（第二種培養液）９００泌を３０そジャーファーメン
タ−に入れた種培養培地と同じ組成の発酵塔地１５のこ
接種し、３０つ○、３０比ｐｍ、通気量１〆′〆／ｍｉ
ｎで４鉛時間本培養を行う。培養物中のウリカーゼは０
．１４Ｕ／の‘である。培養物からのウリカーゼの採取
は次のごとく行う。
培養物を遠心分離して菌体５７＄（銀畢量）を得る。こ
の菌体を０．０８Ｍトリス・バッファー（ｐＨ８．０）
に懸濁した後、ダィノ・ラボラトリー・ミル（Ｄ肌ｏ一
ｂｏ的ｔｏｒｙＭｉＺ〆）ＫＤＬ型（ＷｉＺ〆ｙ Ａ
．母ｃｈｏｆｅｎ ｌｍ．Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）に
て３００仇ｐｍで約１時間処理する。得られる菌体破砕
液を遠心分離して上蒲３そ（１８２０Ｕのウリカーゼを
含む）を得る。上清に硫安を添加して硫安４０％飽和と
し、生成する沈澱物を遠心分離で除く。上蒲に硫安をさ
らに添加して硫安７０％飽和とし生成する沈澱物を遠心
分離により得る。この沈澱物を０．０８Ｍトリス・バッ
ファー（ｐＨ８．０）２００の‘に溶かし同バッファー
１０夕を用い、セロフアンチユープを透析膜として、５
℃で一晩透析を行う。透析チューブ内液２００の‘を０
．１ＭＮａＣ〆を含む０．０８Ｍトリス・バッファー（
ｐＨ８．０）で平衡化したＤＥＡＥ−セルロース１そを
充填したカラムにチャージし、０．２Ｍ ＮａＣ〆を含
む０．０８Ｍトリス・バッファー（ｐＨ８．０）約２そ
で洗浄後、０．３ＭＮａＣ〆を含む０．０９Ｍトリス・
バッファー（ｐＨ８．０）２〆で溶出を行う。溶出液を
２雌ずつ分画し、ゥＩＪカーゼ活性画分を合せる。これ
に硫安を添加して７０％飽和とし、生成する沈澱物を遠
○分離により得る。この沈澱物を０．０８Ｍトリス・バ
ッファー（ＰＨ８．０）約１００私に溶解し、同バッフ
ァーで平衡化したセフアデツクスＧ−１５０５００Ｍを
充填したカラムにチャージし、同バッファーで溶出する
。溶出液を２蛇ずつ分画し、ウリカーゼ活性画分を合せ
る。これを０．２ＭＮａＣＺを含む０．０５Ｍトリス・
バッファー（ｐＨ８０）で平衡化したＤＥＡＥーセフア
デツクスＡ‐５０５００の‘を充填したカラムにチャー
ジし、０．２ＭＮａＣＺを含む同バッファー１そで洗浄
後、０．２一０．５９ＭＮａＣ夕を含む０．０９Ｍトリ
ス・バッファー（ｐＨ８０）１そで濃度勾配溶出を行う
。溶出液を２雌ずつ分画し、ゥＩＪカーゼ活性画分を合
せる。これを０．０８Ｍトリス・バッファー（舟８０）
５そを用い、セロフアンチユープを透析膜として、５℃
で一晩透析を行う。透析内液を凍結乾燥し、ウリカーゼ
の粉末を得る。菌体破砕液を遼心分離して得られた上清
からの活性収率１０．５％、比活性１．９Ｕ／の９蛋白
質である。実施例 ２ コーン・スチープ・リカー０．髭／ｄ‘、酵母エキス０
．髭／の、ＫＨ２Ｐ０４０．１ｇ／ｄ【、ＭｇＳ０４・
７比００．０髭／のより成る培地（ｐＨ７．４）１０の
‘を７０の上容試験管に入れ、１２０℃で１５分間殺菌
する。
の菌体を０．０８Ｍトリス・バッファー（ｐＨ８．０）
に懸濁した後、ダィノ・ラボラトリー・ミル（Ｄ肌ｏ一
ｂｏ的ｔｏｒｙＭｉＺ〆）ＫＤＬ型（ＷｉＺ〆ｙ Ａ
．母ｃｈｏｆｅｎ ｌｍ．Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）に
て３００仇ｐｍで約１時間処理する。得られる菌体破砕
液を遠心分離して上蒲３そ（１８２０Ｕのウリカーゼを
含む）を得る。上清に硫安を添加して硫安４０％飽和と
し、生成する沈澱物を遠心分離で除く。上蒲に硫安をさ
らに添加して硫安７０％飽和とし生成する沈澱物を遠心
分離により得る。この沈澱物を０．０８Ｍトリス・バッ
ファー（ｐＨ８．０）２００の‘に溶かし同バッファー
１０夕を用い、セロフアンチユープを透析膜として、５
℃で一晩透析を行う。透析チューブ内液２００の‘を０
．１ＭＮａＣ〆を含む０．０８Ｍトリス・バッファー（
ｐＨ８．０）で平衡化したＤＥＡＥ−セルロース１そを
充填したカラムにチャージし、０．２Ｍ ＮａＣ〆を含
む０．０８Ｍトリス・バッファー（ｐＨ８．０）約２そ
で洗浄後、０．３ＭＮａＣ〆を含む０．０９Ｍトリス・
バッファー（ｐＨ８．０）２〆で溶出を行う。溶出液を
２雌ずつ分画し、ゥＩＪカーゼ活性画分を合せる。これ
に硫安を添加して７０％飽和とし、生成する沈澱物を遠
○分離により得る。この沈澱物を０．０８Ｍトリス・バ
ッファー（ＰＨ８．０）約１００私に溶解し、同バッフ
ァーで平衡化したセフアデツクスＧ−１５０５００Ｍを
充填したカラムにチャージし、同バッファーで溶出する
。溶出液を２蛇ずつ分画し、ウリカーゼ活性画分を合せ
る。これを０．２ＭＮａＣＺを含む０．０５Ｍトリス・
バッファー（ｐＨ８０）で平衡化したＤＥＡＥーセフア
デツクスＡ‐５０５００の‘を充填したカラムにチャー
ジし、０．２ＭＮａＣＺを含む同バッファー１そで洗浄
後、０．２一０．５９ＭＮａＣ夕を含む０．０９Ｍトリ
ス・バッファー（ｐＨ８０）１そで濃度勾配溶出を行う
。溶出液を２雌ずつ分画し、ゥＩＪカーゼ活性画分を合
せる。これを０．０８Ｍトリス・バッファー（舟８０）
５そを用い、セロフアンチユープを透析膜として、５℃
で一晩透析を行う。透析内液を凍結乾燥し、ウリカーゼ
の粉末を得る。菌体破砕液を遼心分離して得られた上清
からの活性収率１０．５％、比活性１．９Ｕ／の９蛋白
質である。実施例 ２ コーン・スチープ・リカー０．髭／ｄ‘、酵母エキス０
．髭／の、ＫＨ２Ｐ０４０．１ｇ／ｄ【、ＭｇＳ０４・
７比００．０髭／のより成る培地（ｐＨ７．４）１０の
‘を７０の上容試験管に入れ、１２０℃で１５分間殺菌
する。
これにエンテロバクタ−・クロアカェＫＹ３０６６を１
白金耳接種し、３０ｑＣで４糊時間振濠培養する。培養
物１の【当り０．０１５Ｕのウリカーゼが蓄積した。
白金耳接種し、３０ｑＣで４糊時間振濠培養する。培養
物１の【当り０．０１５Ｕのウリカーゼが蓄積した。
第１図は本ウリカーゼの安定ｐＨ範囲を示す。
第２図は本ウリカーゼの至通ｐＨを示す。第３図は本ウ
リカーゼの至適温度を示す。第４図は本ウリカーゼの耐
熱性を示す。る１週 多Ｚ協 姦うｌａ 発４凶
リカーゼの至適温度を示す。第４図は本ウリカーゼの耐
熱性を示す。る１週 多Ｚ協 姦うｌａ 発４凶
Claims (1)
- １ エンテロバクター属に属し、ウリカーゼ生産能を有
する微生物を栄養培地に培養し、培養物中にウリカーゼ
を生成せしめ、これを採取することを特徴とするウリカ
ーゼの製造法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP52075694A JPS6019990B2 (ja) | 1977-06-25 | 1977-06-25 | 発酵法によるウリカ−ゼの製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP52075694A JPS6019990B2 (ja) | 1977-06-25 | 1977-06-25 | 発酵法によるウリカ−ゼの製造法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS5411296A JPS5411296A (en) | 1979-01-27 |
| JPS6019990B2 true JPS6019990B2 (ja) | 1985-05-18 |
Family
ID=13583560
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP52075694A Expired JPS6019990B2 (ja) | 1977-06-25 | 1977-06-25 | 発酵法によるウリカ−ゼの製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS6019990B2 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS6335981U (ja) * | 1986-08-22 | 1988-03-08 |
-
1977
- 1977-06-25 JP JP52075694A patent/JPS6019990B2/ja not_active Expired
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS6335981U (ja) * | 1986-08-22 | 1988-03-08 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS5411296A (en) | 1979-01-27 |
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