JPS6029686B2 - 抗血友性第８因子の回収方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、低温沈澱法を適用して第肌因子蛋白質を純化
する改良法を包含する方法による第側因子（Ｆａｃｔｏ
ｒ肌）濃厚物の調整に関する。

１９８中王５月２０日にゲイルＡ．ロック（Ｇａｉｌ
ＡＲｏｃｋ）に対して発行された米国特許第４２０３８
９１号明細書には全血液あるいは血酸成分中のカルシウ
ムおよび／または他のイオンの生理学的濃度の維持に基
いて、全血液、血数または血糠フラクションから得られ
る抗血友性第側因子（ＡｎｔｉｈｅｍｏｐｈｊｌｉｃＦ
ａｃｔｏｒ 皿；ＡＨＦ）の収率を大中に上昇させる方
法が配鼓されている。

この方法においては、可能な限り血糠中の初期の第側因
子活性度（ａｃｔＭｔｙ）を保持しようとする試みと、
同時に、血糠から調整されたクラィオン沈澱物（ｃひｏ
ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｅ）中の第肌因子の回収を改善す
る試みがなされている。

１９８１年１１月１５日に、ゲィル アン ロツク（Ｇ
ａｉｌＡｎｎＲｏｃｋ）およびダグラス ステフエンパ
ーマー（ＤｏｕｇａｓＳｔｅｐｈｅｎＰａｌｍａｅ）の
名のもとに発行された米国特許第４２８９６９１号明細
書（１９８位王１月１８日に出願されたシリアルＮｏ．
３４４０００カナダ明細書に対応する）には第皿因子を
得る方法が記載され、この方法は、第肌因子の製造に至
る低温不溶性グリブロン（Ｃｏｉｄ ｉｎｓｏｌ肋ｌｅ
ｇｏｂ山ｉｎ；Ｃｉｇ）またはフイブロネクテイン（ｆ
ｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ）の導入工程を含み、その結果ク
ラィオ沈澱物中の第側因子の収量が著しく増加し、同様
にクラィオ沈澱物から得られる低温不漆性グロブリンあ
るいはフィブロネクティン中の収量も増す。

この特許において議論されいるように、フイプロネクテ
インおよびフイブリノゲン（ｆｉｂｎｎｏｇｅｎ）のク
ラィオ沈澱物は、１９７２年の元のフヱケテ（Ｆｅｋｅ
ｔｅ）の特許（１９７母王７月１１日にＲｅ２９６９８
として発行された）に先立って何年も前に確立された手
法であった。

低温でのフィブロネクティンの沈澱を実行するためには
、ヘパリンあるいは他の多糖類化合物を添加することが
必要であることは一般に知られている。しかしながら、
第側因子の製造に向けての低温不溶性グロプリンまたは
フィブロネクティンの適用に関しては、いかなる点にお
いても、文献には示唆されず、また、教示されていない
。実際、Ｊ．Ｂ．Ｃ，２５０：６６１４，１９７５の「
フィブリン安定化因子による低温不溶性グロブリンの架
橋」（‘‘ＣｒｏｓｓＬｉｎｋｉｎｇ ｏｆ Ｃｏｌｄ
−ｌｎｓｏｌｕｂｌｅ ＧＩｏｂｕ−ｌｉｎ ｂｙＦｉ
ｂｒｉｎ一ＳＰｂｉｌｉｚｎｉｎｇＦａｃｔｏｒ）なる
標題のモッシャー（Ｍｏｓｈｅｒ）の論文によれば、ア
ミノ酸分析、４％アガロースゲルからの溶機位置および
ポリアクリルアミド中の露気泳動によって低温不溶性グ
ロプリンは抗血友性因子（第肌因子）から峻別される。
このように、先行する米国特許第４２８９６９１号明細
書の発明では、フィブロネクティンあるいは低温不溶性
グロブリンの製造手法を第側因子の製造への適用を取り
扱っている。

第肌因子の製造のに至る低温不溶性グロブリンのクラィ
オ沈澱の導入によって、クラィオ沈澱物中の第風因子の
収量が著しく増加し、同様にこのクラィオ沈澱物かち得
られる次の低温塩不溶性グロプリンフラクション中の収
量も増加する。この手法を用いることにより８１％の第
肌因子がクラィオ沈澱物中に回収される、次の低温不落
・性グロプリンフラクションは初期の第側因子活性度の
６２％を含んでいた。よって、最初の皿糠の１リットル
当たり６６６単位（皿ｉｔ）の最終的な回収が得られ、
また、蛋白質の量は最初の血数に対して１％以下に減少
した。さらに、この手法は献血者センターで行なうこと
もできるし、勿論、第肌因子のより大きな規模での回収
を意図するものでもある。この方法において、ＣＰＤプ
ラズマ（ＣＰＤ：クエン酸塩ーリン酸塩−デキストロー
ズ抗凝結剤、ｃｉＵａｔｅｐｈｏｓｐｈａｔｅｄｅｘ−
ｔｒｏｓｅ）から得られたクラィオ沈澱物の効率は、ヘ
パリン抗凝結剤の添加およびクエン酸塩−食塩一へパリ
ン緩衝剤（ｃＭａｔｅｓａｌｉ肥ｈｅｐａｒｊｎｂｕ船
ｒ）を用いる低温熟成工程によって改善された。この出
願において最高の結果は、血酸１の‘に対して１単位の
へパリンを用いた場合に得られた。この量のへパリンに
より最善の結果が得られることが判り、ここでクラィオ
沈澱効率は増加し、８０％までの簾肌因子の収率が得ら
れた。さらに、初期のまたはゼロ活性度のいくらかの改
善も得られた。１つの比較として、従来の抗凝結剤中に
集められた血簸のクラィオ沈澱効率は４０〜５０％であ
る。

このように、低温不溶性グロブリン法は、中間純度の第
肌因子を単離するのにはるかに優れた方法である。へパ
リン、ナトリウムヘパリン（ｓｏｄＭｍｈｅｐａｒｉｎ
）もしくはこれらの混合物中に集められた血液または血
糠かち得られたクラィオ沈澱（物低温沈澱物ｃｒｙｏｐ
ｒｅｃｊｐｉｔａにｓ）に低温不熔性グロブリン法を適
用することにより、高純度の第側因子が得られることが
判った。

特に、ヘパリン中に血液または皿鰍を集めるプロセスと
低温熟成工程とを一語にすることにより、第肌因子に非
常に富んだ低温不溶性グロプリン様の物質が得られる。
この新しい方法よれば、高純度の第肌因子の調整が可能
であり、これは血液銀行において容易になされ、また、
クラィオ沈澱工程は分別プラントにおいても実施するこ
とができる。本発明方法は血糠１の【当りへパリン６〜
８単位又は血液１の‘当りへパリン３．５〜４単位用い
て、へパリン、ナトリウムヘパリン又へこれらの混合物
から選ばれた抗凝結剤中に新鮮に集められた全血液又は
血擬もしくは皿敬フラクションからの抗血友性第肌因子
の回収方法において、ヘパリン処理した血環を凍結し、
この皿酸を溶解化し、この溶解した血鎌からクラィオ沈
澱物を分離し、この溶解クラィオ沈澱物にへパリン食塩
溶液を加え、これを約０〜４℃の温度で少くとも２時間
熟成して、ヘパリンの作用により第風因子及び低温不溶
性グロブリンに富む沈澱を得、これから第肌因子を分離
することを特徴とする抗血友性第肌因子の回収方法であ
る。

この方法では凍結前に赤血球を予めへパリン処理血糠か
ら分離しておいてもよい。上託したように、血液は血環
１羽当たり約６〜８単位、好ましくは８単位のへパリン
を用いてへパリン中に新鮮に集められ、あるいはクエン
酸塩ーリン酸塩−デキストロース（ＣＤＰ）よりむしろ
抗凝結剤としてへパリンを用い血液搬出法（プラズマフ
エレーゼ；Ｐｌａｓｍａｐｈｅｒｅｓｊｓ）によつて調
整される。

所望により、赤血球（ｒｅｄｃｅｌｌ）は血鰍から分離
され、ついで、血嫌は通常の血液銀行の方法に従って冷
凍され、血薬からクライオ沈澱物が得られる。ついで、
クラィオ沈澱物は溶解化され、前記のような低温不瀞性
沈澱物を得る方法に従ってプールされる。この方法では
食塩−へパリン溶液が用いられまた、好ましいものでも
あるが、上記の米国特許第４２８９５９１号明細書に記
載されたようなクエン酸塩−食塩−へパリン緩衝液も同
様に用いることとができる。

しかしながら、クエン酸塩−食塩−へパリン緩衝液を使
用すると第側因子の収量が低下し、それ故、この緩衝液
が食塩−へパリン溶液に比べて明らかに実用的でない。
本発明の方法のついて更に具体的に記すれば次のように
なる。

８単位へパリンノ泌の新鮮なへパリンプラズマは一８０
ｑｏに冷凍され、ついで４℃で７５分間溶解化され、そ
の後、０℃で７分間、７００的で遠０分離される。

得られたクラィオ沈澱物は３で０２〜５分間で溶解化さ
れ、その後、クラィオ沈澱物バッグ（ｃひｏ−ｐｒｅｃ
ｉｐａｔｅｂａｇ）当たり２．５の‘のへパリン−食塩
緩衝液（ｐＨ７．２）が加えられる。ついで、溶解化さ
れ、プールされたクラィオ沈澱物は冷却した水浴中で０
００、２時間熟成される。クラィオ沈澱物プール中に存
在・する第側因子は、この段階で低温不溶性グロブリン
と共に不落可し、ついで、不溶性沈澱の全量が遠心分離
（７００的、７分、０℃）によって、第畑因子の乏しい
表面層から分離される。表面層を排出した後、低温不溶
性の沈澱は、０℃で最初のバッグ当たり２〜４の‘の低
温の食塩一へパリン溶液を用いて洗浄され、排出され、
そして最初の低温沈澱バッグ当たり２〜１０の‘の、好
ましくは２の‘の食塩−へパリン溶液を用いて３７ｑ○
で５分間溶解化される。２２０でさらに遠心分離（３７
０の、６分）が実施され、表面層中の第肌因子に富んだ
溶液が沈澱肩から分離される。

以下の工程シートは本発明を説明するためのものであり
、上記したような手順の特定の工程についての説明を助
けるフローシートである。

以下の表からも明らかなように、本発明の新しい方法を
用いることにより、初期の第側因子の５０％以上の活性
度で最初の皿兼１そ当たり８０が単位（ｕｎｉ＄）の最
終収量で、高純度かつ高収率で第肌因子を得ることがで
きる。

すでに述べた特許明細書においては、最終生成物は、い
まいま中間純度の第側因子であり、一方、本法によれば
常に高純度の生成物が得られる。

これは非常に有利である。というのは、コーン（Ｃｏｈ
ｎ）の分別法において用いられるようなエタノールおよ
び塩のような化学的沈澱剤あるいは、硫酸アンモニウム
、ポリエチレングリコール、高分子電解質のような他の
沈澱剤を必要とせず、さらに、ｐＨの調整も必要としな
い。得られた物質は凍結真空乾燥することができ、ある
いは貯蔵や注入のために調整することもできる。

第 １ 表 低温不溶性クラィオ沈澱法によるへパリンブラズマ分別
※必要によりへバリン−食塩水希釈液（へパリン１単位
／泌、０．９％Ｎａ０と，ｐＨ ７．２）により溶解化
した。

含量分析 第 ２ 表本方法は血液バッグ（ｂｌｏ
ｏｄｂａｇ）中で行なうことができる。

即ち、希釈剤を必要としない。また、十分なへパリンが
全工程を通じて保持されると思われる。このように、本
法は４・さな採血センターでも行なうことができる。本
発明により得られる効果を要約すれば次の通りである。

ｍ 従来の蛋白質沈澱剤やｐＨ調整の必要がない。

■ 工程が単純で、必要な技術を４・さな血液銀行の能
力範囲のものである。また、大きなスケールの分別工程
にも容易に適用できる。糊 ０℃での熟成に先立ってい
くつかのバッグをプールすることが好ましいが、工程は
完全に最初のクラィオ沈澱物バッグの中で行なうことが
できる。

｛４ー 最終生成物は直ちに投与することができ、また
、その後の投与のために凍結乾燥あるいは冷凍すること
もできる。

これはバッグ自体の中ですることもでき、また、必要な
らば、適当な他の容器に無菌状態で移し換えることがで
きる。｛５｝ 本方法は早く、一般的に、溶解化した血
糠クラィオ沈澱物についての０℃での熟成に２時間あれ
ば足り、その後の遠心分離工程は短かし、時間ですむ。
脚 本方法によれば、生理学的カルシウムレベルと少し
アルカリ性のｐＨとすることにより分別中の第皿因子は
安定化し、第肌因子凝結活性度は維持される。

【７１ 所望により最終生成物は従来の手法により、さ
らに分別することができる。

より詳しくは、最終生成物は高収率、高純度の第肌因子
濃縮物であり、容積１０の‘当たり２５の単位の第肌因
子、２５の９／の上の蛋白質含量、８．７の９／松との
フイブリノゲン、１０単位／の‘のへパリンレベリであ
る。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 血漿１ｍｌ当りヘパリン６〜８単位又は血液１ｍｌ
   当りヘパリン３．５〜４単位用いて、ヘパリン、ナトリ
   ウムヘパリン又はこれらの混合物から選ばれた抗凝結剤
   中に新鮮に集められた全血液又は血漿もしくは血漿フラ
   ンクシヨンからの抗血友性第VIII因子の回収方法におい
   て、ヘパリン処理した血漿酸を凍結し、この血漿を溶解
   化し、この溶解した血漿からクライオ沈澱物を分離し、
   この溶解クライオ沈澱物にヘパリン食塩溶液を加え、こ
   れを約０〜４℃の温度で少なくとも２時間熟成して第V
   III因子及び低温不溶性グロブリンに富む沈澱を得、こ
   れから第VIII因子を分離することを特徴とする抗血友性
   第VIII因子の回収方法。 ２ 赤血球が凍結前にヘパリン処理血漿から分離される
   特許請求の範囲第１項記載の方法。 ３ 全血液が血漿１ｍｌ当り約８単位を用いてヘパリン
   中に新鮮に集められたものである特許請求の範囲第１又
   は２項記載の方法。 ４ 抗凝結剤が実質的にヘパリン、ナトリウムヘパリン
   又はこれらの混合物からなる血液搬出法を用いてカルシ
   ウムキレート化抗凝結剤の不存在下に新鮮に集められた
   全血液から血漿が得られる特許請求の範囲第１〜３項記
   載の方法。