JPS6030B2 - 細菌によるアクリルアミド単量体の分解法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はノカルジア属に属するＮｏ．１００２１号細菌
を利用して、アクリルアミド重合体中のアクリルアミド
単量体を分解除去する方法に関する。

アクリルアミド重合体は土質安定剤として地盤を急速に
凝固させる作用を有し、土木工事等にきわめて有用であ
るが、該重合体中にはアクリルアミド単量体が残存して
いることが多い。アクリルアミド重合体はほとんど無毒
であるが、アクリルアミド単量体は、マウスを用いた経
口毒性試験でＬＤ５。が２５２の９′ｋ９であって毒性
が強い。従って土質安定剤として用いた該重合体に残存
する単量体が地下水に溶解すると、これを飲用したもの
は神経作用を主とする中毒を起すおそれがある。本発明
者は、アクリルアミド単量体が流入した土壌、井戸水な
どより多数の菌類を分離し、それらの菌のアクリルアミ
ド単量体に対する分解能や資化能を検索したところ、特
定の細菌が該単量体を分解「資化する能力を有すること
を見出した。これらの細菌のうち特に活性の高いノカル
ジア属のＮｏ．１００２１号細菌は、栄養素のきわめて
少ない環境でアクリルアミド単量体を炭素源又は窒素源
として増殖させることが可能で、これによってその環境
からアクリルアミド単量体を分解除去しうろことが知見
された。またブイヨンなど通常微生物の培養に用いられ
る各種の培養基中で発育させたＮｏ．１００２１号細菌
の菌体又はこれより抽出した酵素を、アクリルアミド単
量体に接触させるときも、きわめて短時間でこれを分解
消失させうろことが認められた。本発明はこれらの知見
に基づくもので、アクリルアミド分解能を有するノカル
ジア属に属するＮｏ．１００２１号細菌又はその酵素を
用いて、アクリルアミド重合体中に残存するアクリルア
ミド単量体を分解することを特徴とする、アクリルアミ
ド単量体の分解法である。

本発明に用いられるＮｏ．１００２１号細菌は、徴工研
菌寄第３４５１号として寄託されており、その性状は下
記に示すとおりである。

１ 形態 ｛１｝ 細胞の形及び大きさ（イースト・麦芽寒天培地
、２？ｏ、７幼時間）球菌ないし短樟菌状（０．５〜０
．８×１．０〜１．５Ａ）、気中菌糸は着生しない。

【２｝ 細胞の多形性の有無（イースト）・麦芽寒天培
地、２７０スライドカルチャーで早期には長梶菌状 （０．８×２０仏）にジグザグに分裂発育し、７幼時間
培養以降では球菌ないし短樟菌状に４〜２細胞に再断裂
する。

断裂面は錨端状である。‘３｝ 運動性の有無：なし【
４｝ 胞子の有無：芽胞、茨膜は認められない。

風 グラム染色性：腸性（濃染）。

｛６｝ 抗酸性：チールニールセン法、キニョン法で弱
陽性。

‘７ー 額 粒：電子顕微鏡的に電子線不透過性類粒を
有するｏロ 各培地における生育状態 （１｝ 肉汁平板培養（２７ｏ０、２４〜４報時間）生
育は良好、乾燥した周辺不規則で偏平な淡い桃色系の小
集落（５肋以上）を形成し、培地内部への侵入発育はみ
られない。

培養時間の経過に伴い集落の色調は多少濃いトキ色ない
しサーモンピンク色になる。（カラー・ハーモニー・マ
ニュアル色票コード必ａ）。集落は白金耳で容易にかき
とったりくずしたりできる。｛２｝ 肉汁寒天斜面培養
（２７℃、２４〜４報時間）生育良好、糸状、表面乾燥
して偏平、淡い桃色。

‘３’肉汁液体培養（２７０、２４〜７幼時間）菌膜を
張り又は上部管壁に付着して旺盛に発育する。

培養液は澄明である。僅少の動揺で見掛け上混濁するが
、静暦により菌体は沈降し、上清は澄明になる。【４ー
ベプトン水培養（２７０、２４〜７幼時間）肉汁液体
培養に準ずる。

（５｝ 高層イースト・麦芽寒天穿刺培養（２７ｑ０、
７独時間）寒天培地表面に発育し、培地内部ないし下部
には発育を認めがたい。

■ 合成培養基培養（２７０、９劉時間）グルコース・
アスパラギン寒天塔地、ツアベック・ドツクス寒天塔地
、グリセロール・アスパラギン寒天塔地、カルシウム・
マレート寒天靖地、無機塩・でんぷん寒天培地等には、
乳白色などの微々たる発育を示すにすぎない。

‘７１ 肉汁・ゼラチン穿刺培養（２７０、７幼時間）
表面によく生育、穿刺部に沿ってロート状に発育するが
、下層部にはほとんど発育しない。

液化もしない。｛８｝ リトマスミルク：変化なし。

ｍ 生理学的性質 ○｝ 硝酸塩の還元 ＋｛２１
脱窒反応‘３｝ ＭＲテスト ｛４） Ｖｐテスト ｛５｝ インドールの生成 （６’硫化水素の生成 ‘７）でんぷんの加水分解 ■ 〈えん酸の利用 コーサー培地 ＋ クリステンセン塔地 ＋ 【９ー 無機窒素源の利用 硝酸塩 十 アンモニウム塩 十 肌 色素の生成 （１１）ウレア−ゼ 十（１２）
オキシダーゼ（１３）カタラーゼ
＋（１心生育の範囲：ｐＨ ６〜９ 温度１０〜３７０ （１５）酸素に対する態度：好気性 （１６） ○−Ｆテスト（Ｈｕ鮒 Ｌｅｉ＄ｏｕ法によ
る）：○（グルコ−スから好気的に生酸する。

）（１７）糖類から酸及びガスの生成： 山田及び駒形の方法（ジャーナル。

オブ・ジエネラル・アンド・アプライト・マイクロバイ
オロジー１８巻３９９頁１９７２年）により行い、下記
の糖類によく生育した。

なお酸及びガスの生成は下記のとおりである。Ｗ その
他の諸性質 ‘１’有機酸類の同化館： 東村の方法（ジャーナル・オブ・ジェネラル−マイクロ
バイオロジィ５６巻２６５頁１９６９年）により行なっ
た。

酢酸ソーダ、クエン酸ソーダ、乳酸ソーダ、リンゴ酸ソ
ーダ、プロピオン酸ソーダ、ピルビン酸ソーダ及びコハ
ク酸ソーダで同化が認められ、安息香酸ソーダ及びしゆ
う酸ソーダでは同化が認められなさった。（２ー 溶血
性 脚 力ゼィン分解 ｛４’キサンチン水解 ｛５｝ ヒポキサンチン水解 ｛６｝ チロシン分解 ＋ゴード
ンらの方法（ジャーナル・オブ・バクテリオロジィー６
９巻１４７頁１９５５年）による。

｛７｝ 細胞壁成分べッカーらの方法（アプライド・マ
イクロバイオロジィ１２蓋、４２１頁、１９６４年）で
メソジアミノピメリン酸が腸性であり、ルツシュバリェ
らの方法（ザ・アクチノマィセテス・３１１、１９７０
）でアラビノース及びガラクトースが陽性であった。

■ 脂質構成ミコール酸の型 ルッシュバリェらの方法（ジャーナル・オフ・バクテリ
オロジー、１０５筈、３１３頁、１９７１年）でミコー
ル酸を抽出し、熱分解ガスクロマトグラフィ一による脂
肪酸及びアルデヒドの同定を行なったところ、Ｃ，４〜
Ｃ，８の脂肪酸のみを確認し「Ｃ，ｓ〜Ｃ，８のァルデ
ヒドを認めなかったことにより「 この菌体脂質を横成
するミコール酸はノカルドミコール酸であると考えられ
る。

｛９１ 抗生物質感受性（最少発育阻止濃度）ペニシリ
ンＧ Ｉ単位／私テトラサイクリン
２５ｈｃｇ／叫クロラムフエニコール ２８ｈｃｇ
′の上ストレプトマイシシ ５印ｈｃｇ／の‘アン
ホテリジンＢ ＞１０仇ｈｃｇ／舷メタノール ２
岬時間で１０％、 ７幼時間でで１０％以下 ００ 動物に対する毒性 ３週令マウスに４．５×１ぴ３／の‘の菌浮遊液を０．
３の【静脈注射あるいは腹腔注射した場合でも体重の減
少はなく、対照と同程度の体重増加を１５日間示した。

剖検所見では諸臓器に異常を認めなかった。また心臓、
肺臓、肝臓「隅糠、腎臓及び脳よりの逆培養も陰性であ
った。

猿にイースト・マルトェキ液に４鞘時間２７０で培養し
た菌液（２×１旅／の‘）５０の‘を経口投与したとこ
ろ、２碑責問以内の０唾吐、下痢は見られず、以後１か
月間にわたる観察でも何の異常も見られなかった。

ＯＵ 全菌体ＩＲスペクトル 新井ら（ジャーナル・ジェネラル・アプライド・マイク
ロバイオロジィ９巻、１１９頁、１９６３年）による第
１領域（３０００〜２８００弧‐１）はＢパターンを示
し、第ロ領域（１７５０〜ｉ６００肌‐１）はＡパター
ンを示し、第ｍ領域（１５００〜１３５０ｃｍ‐１）は
ＡないしＢパターンを示し、第Ｎ領域（１１５０〜９５
０伽‐１）は８パターンを示し、総じて非病原性ストレ
プトマィセスの示すパターンを示した。

以上のようにＮｏ．１００２１号細菌は好気性、グラム
陽・性、弱抗酸性の内生胞子を生じない程菌であり、鞭
毛、線毛を着生しない。

バーギイーの分類書（バーギィース・マニュアル・オブ
・デターミネーテイブ。バクテリオロジイ、１９７△王
）によれば「内生胞子を生じないグラム陽・性の樺菌は
第１６章の「乳酸梶菌科」と第１７章の「放射菌及びそ
の近緑微生物」の中にすべて含められている。乳酸樟菌
科のうち、乳酸樟菌属の菌種は嫌気性もしくは適性嫌気
性である点で、リステリャ属の菌種は周宅性で活発に運
動する点で、ェリジベロトリツクス属の菌種は細胞壁に
〆ゾージアミノピメリン酸を含まないことで、またカリ
オフアノン属の菌種は側鞭毛を有し運動性を有すること
で、Ｎｏ．１００２１号細菌と異なることが明らかであ
る。従ってＮｏ．１００２１号細菌は第１万事の「放線
菌及びその近緑微生物」中の菌属に含まれるべきである
。この微生物群については特に細胞壁組成がよく研究さ
れており、これが分類の基準ともなっているが、Ｎｏ．
１００２１号細菌と同様に細胞壁に〆ゾージアミノピメ
リン酸、Ｄ−アラビノース及びガラクトースを含有する
ものは（バーギイーの分類書、細胞壁タイプＷ、６５８
頁）コリネ型細菌か、放線菌目のうちのミコバクテリウ
ム、ノカルジア、サーモモノスポーラ及びミクロポリス
ポーラの４菌種である。

しかしミクロポリスポーラ及びサーモモノスポーラは気
菌糸を着生するものであり、これらとは遠く離れている
。またミコバクテリウムは一般に強い抗酸性があり、明
らかにＮｏ．１００２１号細菌とは異なる。さらにＮＯ
．１００２１号細菌は脂質構成脂肪酸としてコリノミコ
ール酸を含まないという点でコリネ型細菌とも異なる。
従ってＮｏ．１００２１号細菌はノカルジア属に含まれ
る細菌と一応考えることができる。しかしノカルジア属
類縁の菌属については、最近学会において種々の菌学的
性質ならびに生化学的性質を検討中であり、その一部を
ロドコツカス属〔グッドフェローら「ザ・バイオロジィ
・オブ・ザ。

ノカルジア、３９頁、１９７６王及びグッドフエロー、
プロシーデイング・オブ・インターナショナル・シンポ
ジウム・オン・ノカルジア・アンド・ストレブトマイセ
ス（モルダルスキーら糠）、ワルシャワも １９７８王
〕〜 あるいはゴルドーナ属（東村、ジャーナルＧオブ
９ジェネラル・マイクロバイオロジィ「 ６珠篭、１５
頁、１９７１年）として再分類することが好ましいとの
報告があり、最終的結論には至っていない現状である。
本発明においては、前記の性状を有するＮＯ．１００２
１号細菌ならびにアクリルアミド単量体分解能を有する
その変異株を用いることができる。

アクリルアミドを分解する菌としてはグラム陰性菌であ
るシュードモナス・ェルギノーザ、縁膿菌（Ｍ．ケリィ
らバイオケミカル・ジャーナル９３巻、５６６頁、１９
６必王）、ミコバクテリウム・スメグマチス（ジヤーナ
ル・ジエネラル・マイクロバイオロジィ４６巻「１１１
、１９６７）等が知られているが「 ノカルジア属の細
菌による生産は報告されていない。またＮｏ．１００２
１号細菌の酵素は縁腰菌のアミダーゼと同様にトランス
フェラーゼ活性を有しているが、これより基質特異性が
広範であり、また縁膿菌やミコバクテリゥム・スメグマ
チスのアミターゼは譲導酵素であるが、Ｎｏ．１００２
１号細菌のアミターゼは構成酵素であるなどの点で特異
的である。Ｎｏ．１００２１号細菌の菌体は、たとえば
次のようにして製造することができる。

同化しうる窒素源としてはたとえばアミノ酸又はその混
合物「ベプチド、たん白質又はその加水分解生成物（ベ
プトン等）、肉エキス、イースト抽出液、大豆粉、とう
もろこし含浸液、魚肉エキス、毅粒水油出分等、ならび
に炭素源としてたとえばグルコース、マンノース「マル
トースその他の利用可能な炭水化物議導体を含有する液
体培養基（ｐＨ６．０〜８．０）に菌を接種し、静止又
は通気して２０〜３０℃で２０〜７幼時間培養する。本
発明方法によりたとえば常温で２独特間以内にアクリル
アミド単量体をほとんど残存しないようにするためには
、単量体に対し０．０１〜３５重量％、好ましくは０．
１〜５重量％の菌体又は酵素が用いられる。下記実施例
中のアクリルアミドの定量法は次のとおりである。

アクリルアミド単量体の定量はガスクロマトグラフィ及
び全有機酸炭素分析計によった。

すなわち該単量体の減少は東芝べックマン社製全有機炭
素分析計１０２Ａ型で測定し、定量的にはガスクロマト
グラフＧＣ−掛（クロモソルブ１０１を担体とし、カラ
ム温度２００００、注入温度２２０ｑｏ、Ｎ２ガス３０
の‘ノ分の条件）で、リテンションタイム約５分に見ら
れるピークを定量曲線により計測した。実施例 １発育
菌体によるアクリルアミド単量体の分解最少培養基にア
クリルアミド単量体を１００ｐｐｍ加え、２７０で振濠
培養し、経時的にアクリルアミド単量体の消長と発育の
度を調べた。

その結果を第１表に示す。この結果から、ＮＯ．１００
２１号細菌は最少培養基中でアクリルアミド単量体を栄
養源として消費しながら発育することが認められた。な
お、菌無添加の上記試料を対照とした。第１表 註）最少培養基の組成は次のとおりである。

ＦｅＣ１３・母ＬＯ Ｏ．００１
％ＭｇＣ１２・抗日２〇 〇・
０１％ＮａＨＳ０３ ０．
０１％Ｋ２ＨＰ０４ ０．２
％ＫＨ２Ｐ０４ ０．１％
ＣａＣ１２・２日２０ ０．０
１％実施例 ２静止菌体によるアクリルアミド単量体の
分解ブイヨン中２７０でＮｏ．１００２１号細菌を振濠
培養し、対数中期に達した菌体を遠沈集菌し、０．９％
生理食塩水で洗浄後、ｐＨ７．０の燐酸緩衝液中でアク
リルァミド単量体と３０ｏｏで振濠反応させ、遠沈後の
反応液中のアクリルアミド単量体残存量を経時的に調べ
た。

その結果を第２表に示す。この結果から、静止菌体は燐
酸緩衝液中の１時間の反応でアクリルアミド２５瓜血を
２脚にまで分解することが認められた。表中の数字はア
クリルアミドの数値を胸で示すものである。第２表 以上の実施例において、生菌の代わりにその酵素を抽出
して使用してもよい。

この場合酵素は、下記のようにして分離精製することが
できる。Ｎｏ．１００２１号細菌をブイヨン中２７０で
振顔培養し「対数増殖期の菌体を遠沈により集め、生理
的食塩水で数回洗浄する。これを３倍量の軸７．０〜０
．０９の燐酸緩衝液中に浮遊させ、２０分間音波破砕（
２風Ｃ′Ｓ）したのち冷却遠心する（１２０００夕、２
０分間）。得られた上燈液を粗酵素液としてアクリルア
ミドの分解に用いることができる。この酵素液の精製は
常法に従い、硫安沈殿、ＤＥＡＥセルロース、セフアデ
ツクスＧ−２０拍等‘こよるゲル炉週などを組合わせて
行なう。

部分精製された酵素は７．４〜９．０の範囲に至通ｐＨ
を有し、至適温度はほぼ４６ｏｏであるが６０ｏｏで失
活し、２０ｑｏでもある程度活性を示した。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ アクリルアミド分解能を有するノカルジア属に属す
   るＮｏ．１００２１号細菌又はその酵素を用いて、アク
   リルアミド重合体中に残存するアクリルアミド単量体を
   分解することを特徴とする、アクリルアミド単量体の分
   解法。