JPS6034522B2 - 血清アルブミンフラクシヨンの製法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は血液フラクションに関し、そしてさらに詳細に
は、高収量および高純度における血清アルブミンフラク
ションの製法に関する。

アルブミンは血※の最大フラクションを構成し、ショシ
クの場合におけるような医学的治療においてあるし、は
血粥増量剤としての広い利用が見出されている。

血液を種々の操作により分別してアルブミンを得、その
他の分離された成分を回収することは確立された操作で
ある。

正常血清アルブミンとして知られている商業上の主要な
アルブミンフラクショソは少くとも９６％のアルブミン
を含有している高度に精製された血嫌フラクションの浸
透圧上安定な溶液である。その入手は主としてハーバー
ド・メディカル・スクールのコーン（Ｃｏｈｎ）氏等に
より可能とされており、その製法は米国特許第２，３９
０，０７４号および同第２，４６９，１９３号各明細書
、ジャーナル・オブ・ジ・アメリカン・ケミカル・ソサ
ェティ第６法巻第４６９〜７５頁（１９４８王）、カー
クーオスマー（Ｋｉｒｋ−○仇ｍｅｒ）氏綱「ヱンサイ
クロベデイア・オブ・ケミカル・テクノロジー」第３巻
第５８４〜８８頁（第２版１９６４年）に記載されてい
る。米国内において正常血清アルブミン製造のために現
在選択される方法はいわゆるコーンの方法６である。他
の１種の商業上の主要なァルブミンフラクションはいわ
ゆる皿糠蛋白フラクション（ＰＰＦ）であり、これは１
７％以下のＱ−およびＢ−グロブリンの混合物と共に少
くとも８３％のアルブミンを含有している血酸フラクシ
ョンの溶液である。

米国内においてＰＰＦ製造のために現在選択される方法
は米国特許第２，９５８，６２８号明細書およびボック
ス・オブ・サンギス（ＶｏｘＳａｎｇ．）第２巻第１７
４頁（１９５７年）に記載されているようなヒンク（Ｈ
ｉｎｋ）の方法である。一層高度に濃縮された正常血清
ァルブミンならびに濃縮度の一層低いＰＰＦを得るため
の前述の操作は分別構成において沈殿剤として冷エタノ
ールを利用している。

アルブミンフラクション調製のためのその他の各種既知
の操作においてはェープル．〆／タノールあるいは硫酸
アンモニウム塩のような他の沈殿剤を利用するか、ある
いはゲル上への吸着もしくはイオン交換クロマトグラフ
ィーを包含している。さらに最近になってアルブミンの
分離を包含する血液の分別に対して各種の重合体状物質
が開発された。

例えば、米国特許第３，４１５，８０４号明細書記載の
ようなポリエチレングリコール（ＰＥＧ．カーボワック
ス）、米国特許第３，８５０，９０３号明細書およびド
イツ特許出願公開公報第２，４０３，０６５号に記載さ
れているようなエチレンオキサィドとポリオキシフ。ロ
ピレンポリマーとの共重合体（プルロニックス）、およ
び米国特許第３，５５４，９８５号ならびに同第３，５
５５，００１号明細書に規定されているエチレン／無水
マレィン酸交さ結合共重合体誘導体のようなある種の特
異的な高分子電解質である。これらの重合体状物質を利
用することの利点はそれらを通常の室温で使用すること
が可能であり、従って前述のコーン氏のエタノール分別
操作における低温要件を回避しうろことである。精製さ
れた血清アルブミンを得るためのさらに他の方法は、米
国特許第２．７０５，２３ぴ号および同第２．７６５，
２９叫号明細書、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・
ケミストリー第１６２巻第１８１〜聡頁（１９４６王）
、およびブルート（Ｂｌｕｔ）第３０巻、第１２１〜１
３４頁（１９７３王）に記載されているようにカプリレ
ートあるいはその他の脂肪酸陰イオン安定剤の存在下に
おいて加熱することにより、血清アルブミンの変性を伴
なわなし、で血清グロブリンを選択的に変性することを
包含している。

この方法はＰＰＦ型のアルブミンフラクションの製造に
は有用であるが、価値あるガンマグロブリンを破壊する
ことなく高度に精製された血清アルブミンを高収量で製
造するには一般に適していない。これは通常ウイルス不
含のアルブミン生成物を得るためのパスツール法工程と
して行われる。本発明によれば、血糠およびその他のア
ルブミン含有血液フラクションから、これをアルプミン
に対する高い吸着能力を有する樹脂状重合体状物質と接
触させ、約５．０〜約５．５のＰＨを保持して約６５〜
約７〆０の温度に約１〜約４時間加熱し、次いでｐＨ約
３．５〜約４．５で樹脂−製白塊からァルブミンを選択
的に熔雛することにより血清アルブミンフラクションが
高収量かつ高純度で製造される。

本発明で用いられる樹脂状重合体状物質はジ低級アルキ
ルアミノ低級アルキル置換交さ結合デキストラン重合体
である。これらのデキストラン重合体状物質を用いる吸
着−溶雛段階と加熱処理との組み合せによれば、加熱処
理段階あるいは吸着−溶雛段階のいずれかにより別々に
得られるものよりも実質上一層高い純度および収量にお
いてアルブミン生成物が得られる。アルブミンは本発明
方法により９０％以上の収率および９４％以上の純度で
回収され得る。本発明により製造される血清アルブミン
は全血．血嫌および血清、あるいはアルブミンを含有し
ていることが知られているそれらのフラクションから取
得され得る。

本発明方法において行なわれる前記加熱による処理は処
理される物質中に存在するグロブリンを変性させる傾向
があるので、本発明方法で処理する前にガンマグロブリ
ンのようなある種の所望のグロプリンフラクション，を
はじめに単離しておくことが多くの場合有用である。凝
固因子、ＡＨＦおよびプロトロンピン複合体のようなそ
の他の価値ある血液フラクションもまた本発明方法で処
理する前に血競出発物質からはじめに分離され得る。こ
れらフラクションは当業界におし・既知の慣用の操作に
より分離され得る。本発明において用いられるジ低級ア
ルキルアミノ低級ァルキル置換交さ結合デキストラン重
合体は米国特許第３，２２７，０２５号明細書に記載さ
れている。

これらの物質は例えばジェチルアミノェチル（ＤＥＡＥ
）官能基のような適当なジ低級アルキルァミノ低級ァル
キル官能基を交さ結合デキストラン中に導入することに
より製造される。低級アルキルなる用語は１個ないし約
４個の炭素原子を有するアルキル基を意味する。「セフ
ァデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）」（商標名）として商
業上入手しうる交さ結合デキストランは、米国特許第３
，０４２，６６７号明細書に記載されているようにデキ
ストラン物質をこのデキストラン物質のヒドロキシル基
と反応し得る二官能性有機物質と反応させることにより
得られる親水性高分子量共重合生成物である。

デキストラン鎖の交さ結合はＤＥＡＥあるいはその他の
前記のような官能基がデキストラン鎖のグルコース単位
にエーテル結合により結合している三次元多糖ネットワ
ークを与える。ＤＥＡＥ交さ結合デキストランはＤＥＡ
Ｅ−セフアデックスＡ−２５およびＡ−５０として商業
上入手し得る。Ａ−２５はＡ−５０より一層高度に交さ
結合しており、従って多孔度が一層低い。これらの物質
はこれまで、ェクスベリェンチア（Ｅｘｐｅｒｉｅｎｔ
ｉａ）第３０巻｛６〕第６０８〜１０頁（１９７４年）
に記載のように人間の血清からのァルブミンのクロマト
グラフィーによる分離、およびアーカィブズ・オブ・バ
イオケミストリー・オンド・バイオフィジクス第１０＄
筈第５１４〜２２頁（１９６４年）、同第１３公舎、第
２ね〜８４頁（１９６９年）、ボックス・オブ・サンギ
ス第２安静４｝第２７９〜９０頁（１９７２）および米
国特許第３，８６９，４３６号明細書に記載されている
ように免疫グロブリンのような他の血液蛋白の製造、お
よびボックス・オブ・サンギス第２３筆■第１１３〜２
３頁（１９７３年）および米国特許第３，９２０，６２
５号明細書に記載されているようにプロトロンピンの製
造に使用されてきた。

ベルギー特許第８３２，５２７号明細書には、ＤＥＡＥ
−デキストランが非常に純粋なアルブミンフラクション
の製造に有用であると記載されている。

前記ベルギー特許明細書に記載の方法においては、血数
を樹脂と接触させ、続いて熔費珪を行ない次いでアセチ
ルトリブトフアンもしくは中程度の鎖長を有する脂肪酸
の存在下において前記溶離溶液を加熱処理する。この操
作は有用ではあるが、本発明による樹脂−蛋白混合物の
加熱処理により促進される変性グロブリンをアルブミン
から分離するという利点を有しない。本発明方法を実施
するには、前述の樹脂状デキストラン重合体状物質を好
ましくは重合体の約１〜５％の濃度範囲で皿酸あるいは
血清、あるいはアルブミン含有血液フラクションと混合
する。

樹脂−蛋白混合物のｐＨを異なる水準に調整することに
より、選択された蛋白がはじめに除去される。ｐＨ約５
．５〜７．５においてアルブミン、Ｑおよび８−グロプ
リンおよびフィブリノーゲンが樹脂により吸着され、他
方ガンマグロブリンの主要部分は未吸着で残留しそして
治療上の使用のために上澄みから回収され得る。好まし
くは、このガンマグロブリンのはじめの分離は約ｐＨ６
で行われる。吸着されたＱ−および８−グロブリンおよ
びフイブリノーゲンの部分は樹脂−蛋白混合物をｐＨ約
４．７に調整し、脱着された上澄みを集めることにより
回収され得る。次いで樹脂−蛋白混合物をｐＨ約５．０
〜約５．５に調整し約６５〜約７〆０に約１〜約４時間
加熱する。

好ましくは、ｐＨを約５．２〜５．３に調整し、樹脂−
蛋白混合物を約７０００に約１時間加熱する。加熱処理
段階中に、主としてＱ−および８−グロブリンである残
留グロブリンが変性ごれるが、同時にアルブミンは変性
されず溶易に回収され得る。

加熱処理に続き、恥を約３．５〜約４．５の範囲に調整
して所望のアルブミソを樹脂−蛋白混合物から溶雛する
。

好ましくは、樹脂−蛋白混合物を前記のｐＨ調整の前に
冷却し次いでｐＨを約４に調整する。アルブミンの回収
は沈降、炉過、あるいは猿心分離のような種々の分離方
法により行われ得るが、ｐＨ調整された樹脂−蛋白混合
物を炉過し、炉過ケーキを洗いそして炉液を所望の高度
に精製されたアルブミンフラクションとして集めること
によって行うのが好ましい。

前述の操作中にｐＨを所望の水準に調整することは臨床
上受容され得ることが知られている酸もしくはアルカリ
性緩衝物質で処理することにより、例えば酸性化するた
めには酢酸ナトリウム−酢酸緩衝液あるいはクエン酸を
使用することによりあるいはアルカリ度を増すためには
重炭酸ナトリウムあるいは水酸化ナトリウムを使用する
ことにより行われ得る。

加熱処理の間樹脂−蛋白混合物中に安定化作用が既知の
アセチルトリプトフアンナトリウムおよびカプリル酸ナ
トリウムのような既知のアルブミン安定剤を包含させる
こともまた好ましい。

以下に本発明の実施例を掲げるが本発明はこれらの特定
の例に限定されるものではない。実施例 １本実施例に
おいては、樹脂状重合体性物質は商業上入手し得るジェ
チルァミノェチル置換交さ結合デキストラン重合体であ
るＤＥＡＥーセフアデックスＡ−５０からなる。

はじめに、前記の重合体状樹脂を０．０４モルのＮａＣ
そ中で洗う。プールした人間の血液から得られる血糠を
血数１部に対して３部の水で希釈し、次いで２重量％の
前記の洗浄された樹脂と混合する（２夕／１００の【）
。この樹脂−血数混合物をｐＨ６．０に調整し、３０分
間混合し、炉過し次いで０．００２モルのＮａＣそで洗
う。主にガンマグロブリン、８ーグロブリン、フイブリ
ノーゲンおよび付随血液因子から成る炉液を残留樹脂−
蛋白炉過ケーキから分離する。吸着されたアルブミンを
含有している樹脂−蛋白炉過ケーキを軸５．２に酸性化
する。０．０１２モル濃度を与えるのに充分なカプリル
酸ナトリウム安定剤を樹脂−吸着蛋白と混合し、ＮａＣ
そを加えて０．００２モル濃度となす。

次いで７０００で１時間樹脂−吸着蛋白を加熱する。こ
の懸濁液を室温に冷却し、その後この物質を炉遇し炉液
を捨てる。０．００２モルＮａＣそ中でクエン酸を用い
てｐＨ４に酸性化し、３０分間混合しそして炉遇するこ
とにより残留樹脂−蛋白炉過ケーキからアルブミンを溶
離する。

炉液は９１．５％の収率（もとの血数中のアルプミン濃
度に基づく）および９５．２％の純度の所望のアルブミ
ンフラクションとして保持する。前記樹脂から溶離され
た生成物のアルブミン純度はコーニング（ｃｏｍｉｎｇ
）ＡＣＩ電気泳動装置によりｐＨ８．６のバルビタール
緩衝液中アガロース・ゲル電気泳動により測定される。
この測定においては、実質上フアゼカス・ド・セント・
グロス（ＦａｚｅｋａｓｄｅＳｔ．Ｇｒｏｔｈ）氏等に
よりバイオキミカ．ェ．バイオフィジカ．アクタ（Ｂｉ
Ｍｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ）第７１巻第３７
７〜９１頁（１９６３王）に記載されている方法に従っ
て、クマシーブリリアントブルーＲ２５０（Ｃ．そ．４
２６６０）染色法が用いられ測定はゲルマン（ＧＩｍａ
ｎ）ＡＣＤ−１９農度計を用いて６０肌ｍにおいて行わ
れる。クマシーブリリアントブルーＲ２５０は非常に感
度の大きい蛋白染料であってこれは上限２０仏夕／中の
までベールの法則に従し、そして下限０．５仏夕／中ま
で感受性である。この感度のために、クマシーブリリア
ントブルーＲ２５０は前記アルフミン生成物中の蛋白汚
染物の高度の検出を可能にし、前述の分析値は高純度の
アルブミン生成物の製造を確認している。実施例 ２ 出発血酸がＡＨＦ−減少化血数であること以外は実施例
１の操作をくり返す。

アルブミン生成物の収率および純度は実質上実施例１に
おいて得られるものと同じである。実施例 ３ 血鰍中から他のグロプリンおよびフィブリノーゲンを除
去するために中間段階が、第１回の炉過後加熱処理段階
に先立って行われる以外は実施例１の操作をくり返す。

この中間段階においては、第１回の炉過段階からの樹脂
−蛋白炉過ケーキを０．００２モルＮａＣク中クェン配
を用いてｐＨ４．７に調整し３０分間混合する。この混
合物を炉過し、洗浄し次いで加熱処理および実施例１の
後続の段階に付す。ＰＨ４．７における処理から得られ
る炉液はＱ−および８ーグロブリンおよびフイブリノー
ゲルを含有しておりこれらは各種既知の浩療上あるいは
診断上の用途のために保持され得る。最後的なアルブミ
ン生成物は実施例１のそれと実質上同一の収率および純
度で得られる。本発明による精製アルブミン生成物の回
収によれば、アルブミンを所望の水準まで濃縮すること
が可能であり、濃縮された生成物は生理学的に受容され
得るＰＨおよび電解質舎量に調整され、さらに加熱して
ウイルスを破壊し、そして炉過あるいはその他の操作に
より清澄化して臨床上受容され得る生成物とされ得る。

使用可能な有用な濃縮操作の例としては山凍結乾燥およ
びそれに続く５％あるいは２５％のような所望の水準ま
での再溶解、および■限外炉過があげられる。以上の記
載から他の各種の例が本発明の精神および範囲を逸脱す
ることなく当業者に明らかとなるであろう。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ アルブミン−蛋白混合物をジ低級アルキルアミノ低
   級アルキル置換交さ結合デキストラン重合体から成る群
   から選択される樹脂状重合体状物質と接触させ、約６５
   ℃〜約７２℃の温度でｐＨ約５．０〜約５．５において
   約１〜約４時間加熱し次いでこの混合物をｐＨ約３．５
   〜約４．５に調整することにより所望のアルブミンをそ
   こから選択的に溶離することを特徴とする、他の血液蛋
   白成分との混合物から高収量かつ高純度において血清ア
   ルブミンフラクシヨンを製造する方法。 ２ 樹脂状重合体状物質がアルブミン−蛋白混合物の約
   １〜約５重量％の濃度で使用されることを特徴とする前
   記第１項の方法。 ３ 加熱処理段階中のｐＨが約５．２〜約５．３であり
   溶離段階中のｐＨが約４．０であることを特徴とする前
   記第１項の方法。 ４ 加熱処理が約７０℃の温度で行われることを特徴と
   する前記第１項の方法。 ５ アルブミン−蛋白混合物が全血血漿であるかあるい
   はＡＨＦ−減少化血漿フラクシヨンであることを特徴と
   する前記第１項の方法。 ６ ジ低級アルキルアミノ低級アルキルがジエチルアミ
   ノエチルであることを特徴とする前記第１項の方法。 ７ アルブミン−蛋白混合物が、最初にフラクシヨン化
   されてガンマグロブリンが除去されている血漿であるこ
   とを特徴とする前記第１項の方法。 ８ ガンマグロブリンを除去するためのはじめの分別が
   、アルブミン−蛋白混合物を約５．５〜約７．５のｐＨ
   において樹脂状重合体状物質と接触させ未吸着物質をガ
   ンマグロブリンフラクシヨンとしてそれから分離するこ
   とから成ることを特徴とする前記第７項の方法。 ９ はじめの分別がｐＨ約６．０で行われることを特徴
   とする前記第８項の方法。 １０ 樹脂−吸着されたアルブミン−蛋白混合物をｐＨ
   約４．７に調整し脱着された上澄みをそれから分離する
   ことから成るα−およびβ−グロブリン除去のための追
   加段階を包含することを特徴とする前記第７項の方法。