JPS6037B2 - 高度好熱菌に由来する新規なプラスミド - Google Patents
高度好熱菌に由来する新規なプラスミドInfo
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- JPS6037B2 JPS6037B2 JP57189527A JP18952782A JPS6037B2 JP S6037 B2 JPS6037 B2 JP S6037B2 JP 57189527 A JP57189527 A JP 57189527A JP 18952782 A JP18952782 A JP 18952782A JP S6037 B2 JPS6037 B2 JP S6037B2
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- thermophilic bacteria
- pnhs212
- bacteria
- dna
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
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Description
【発明の詳細な説明】
本発明は高度好熱菌を宿学とする組換えＤＮＡ実験のべ
クターとして有用な新規なプラスミドに関するものであ
り、より詳しくはその分子量が約５４メガダルトンであ
り、図に示される制限酵素関裂地図により特徴づけられ
る新規なプラスミドに関するものである。
クターとして有用な新規なプラスミドに関するものであ
り、より詳しくはその分子量が約５４メガダルトンであ
り、図に示される制限酵素関裂地図により特徴づけられ
る新規なプラスミドに関するものである。
従来、絹換えＤＮＡ実験は主として大腸菌を宿王とする
系で広く研究がおこなわれインシュリン「インターフェ
ロン、ヒト成長ホルモン等が大腸菌で量産されるなど大
きな成果を拳げている。
系で広く研究がおこなわれインシュリン「インターフェ
ロン、ヒト成長ホルモン等が大腸菌で量産されるなど大
きな成果を拳げている。
大腸菌の宿主・ベクタ−系はほぼ完成されており、また
大腸菌以外にも酵母、枯草菌などで宿主・ベクター系が
開発され応用への道が検討されつつある。しかし、上記
の菌はいずれも生育温度が３０こ０〜３７００の中塩菌
である点に問題がある。一方、好熱性細菌は、生育上限
温度が５５ｑｏ〜７５℃にある中等度好熱菌と、生育上
限温度が７５ｑｏ以上である高度好熱菌とに大別される
が、いずれについても、その有する酵素、生体成分が耐
熱性、耐溶媒性に優れている事が知られており「とりわ
け好熱菌由来の耐熱性酵素及び耐熱性生体機能のバイオ
リアクター等の工業プロセスへの応用という点から注目
を集めている。従って、好熱性細菌の育種が重要と考え
られるが、その為の一つの、しかも有力な手段と考えら
れる好熱性細菌の宿主・ベクター系の開発研究、とりわ
け高度好熱菌の宿主・ベクター系の開発研究は「 これ
まで全く行なわれていない。しかも、ベクターの開発研
究の基礎となるべきプラスミドＤＮＡの検索という点に
ついても、高度好熱菌を材料とした研究は以下の２報し
か知られていない。（１｝ 高度好熱菌よりの染色体外
ＤＮＡの分離ヒシヌマ，Ｆ．，タナ力，Ｔ．アンド サ
カグチ，ＫＪ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂ．，１０４，１９
３一１９９（１９７８）ｔ２）サーマス・サーモフィル
スから単離されたプラスミド（ｐＴＴＩ）の物理的性状
工ベルハード，Ｍ．Ｄ．，／ゞスクエズ，Ｃ．，ノゞレ
ンズエラ，Ｐ．，ビキユナ，Ｒ．アンド ユデレビツク
，Ａ．Ｐ１ａｓｍｉｄ，６，１一６（１９８１）上記２
報に記載されているプラスミドは、いずれもその性質が
不明ないわゆるクリプティック・プラスミドであり、ま
たそれらの分子量も６メガダルトン程度とやや大きい。
大腸菌以外にも酵母、枯草菌などで宿主・ベクター系が
開発され応用への道が検討されつつある。しかし、上記
の菌はいずれも生育温度が３０こ０〜３７００の中塩菌
である点に問題がある。一方、好熱性細菌は、生育上限
温度が５５ｑｏ〜７５℃にある中等度好熱菌と、生育上
限温度が７５ｑｏ以上である高度好熱菌とに大別される
が、いずれについても、その有する酵素、生体成分が耐
熱性、耐溶媒性に優れている事が知られており「とりわ
け好熱菌由来の耐熱性酵素及び耐熱性生体機能のバイオ
リアクター等の工業プロセスへの応用という点から注目
を集めている。従って、好熱性細菌の育種が重要と考え
られるが、その為の一つの、しかも有力な手段と考えら
れる好熱性細菌の宿主・ベクター系の開発研究、とりわ
け高度好熱菌の宿主・ベクター系の開発研究は「 これ
まで全く行なわれていない。しかも、ベクターの開発研
究の基礎となるべきプラスミドＤＮＡの検索という点に
ついても、高度好熱菌を材料とした研究は以下の２報し
か知られていない。（１｝ 高度好熱菌よりの染色体外
ＤＮＡの分離ヒシヌマ，Ｆ．，タナ力，Ｔ．アンド サ
カグチ，ＫＪ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂ．，１０４，１９
３一１９９（１９７８）ｔ２）サーマス・サーモフィル
スから単離されたプラスミド（ｐＴＴＩ）の物理的性状
工ベルハード，Ｍ．Ｄ．，／ゞスクエズ，Ｃ．，ノゞレ
ンズエラ，Ｐ．，ビキユナ，Ｒ．アンド ユデレビツク
，Ａ．Ｐ１ａｓｍｉｄ，６，１一６（１９８１）上記２
報に記載されているプラスミドは、いずれもその性質が
不明ないわゆるクリプティック・プラスミドであり、ま
たそれらの分子量も６メガダルトン程度とやや大きい。
従って、このままの形でべクタ−として利用する、或い
はこれらを素材としてべクター開発を行う事には、あま
りもこ困難が大きいものと考えられる。そこで、本発明
者らは、高度好熱菌より、選択マーカー（そのプラスミ
ドが宿主内に存在していることを示すマーカー）を有し
、しかも分子量の小さいプラスミドの検索を行った。そ
の結果ストレプトマイシンに耐性を示したサーマス・フ
ラバスから分子量約５．４メガダルトンのプラスミドを
単離する事に成功した。このプラスミド‘ま、前記の制
限酵素開裂地図に示される如く、分子量がやや小さくし
かも数種の制限酵素による切断点を特異的に有している
（以下、本プラスミドをｐＮＨＳ２１２と略称する）。
はこれらを素材としてべクター開発を行う事には、あま
りもこ困難が大きいものと考えられる。そこで、本発明
者らは、高度好熱菌より、選択マーカー（そのプラスミ
ドが宿主内に存在していることを示すマーカー）を有し
、しかも分子量の小さいプラスミドの検索を行った。そ
の結果ストレプトマイシンに耐性を示したサーマス・フ
ラバスから分子量約５．４メガダルトンのプラスミドを
単離する事に成功した。このプラスミド‘ま、前記の制
限酵素開裂地図に示される如く、分子量がやや小さくし
かも数種の制限酵素による切断点を特異的に有している
（以下、本プラスミドをｐＮＨＳ２１２と略称する）。
なお、図に示されている制限酵素の略称は次のとおりで
ある。Ｍ１ｕｌはミクロコッカス・ルテウス由来の酵素
しＢｇ０‘まバチルス・グロビギイ由来の酵素、Ｐｓｔ
ｌはプロビデンシア・スチュアルテイイ由来の酵素を示
す。
ある。Ｍ１ｕｌはミクロコッカス・ルテウス由来の酵素
しＢｇ０‘まバチルス・グロビギイ由来の酵素、Ｐｓｔ
ｌはプロビデンシア・スチュアルテイイ由来の酵素を示
す。
以下、これまでに報告されているサーマス属細菌、即ち
高度好熱菌由来のプラスミドとの相違点を表に示す。
高度好熱菌由来のプラスミドとの相違点を表に示す。
表
高度好熱菌由来のプラスミド
表から明らかなように、ｐＮＨＳ２１２は既知のプラス
ミドキこ較べ、分子量、制限酵素による切断パターンが
明らかに異なっており、新規なプラスミドであることが
認められる。
ミドキこ較べ、分子量、制限酵素による切断パターンが
明らかに異なっており、新規なプラスミドであることが
認められる。
プラスミドＤＮＡがべクターたり得る為には、そのプラ
スミドが宿主内での自律的増殖能、及び選択マーカー（
そのプラスミドが宿主内に存在していることを示すマー
カー）を有していることが必須である。
スミドが宿主内での自律的増殖能、及び選択マーカー（
そのプラスミドが宿主内に存在していることを示すマー
カー）を有していることが必須である。
しかし、高度好熱菌の様に、その生育環境が栄養源に乏
しくしかも抗生物質が存在しない様な温泉である菌につ
いて考えた場合、薬剤耐性遺伝子等を有するプラスミド
を得る事は容易ではない。従って、性質が不明のいわゆ
るクリプティック・プラスミドに宿主染色体由釆のマー
カ−を賦与するという方式でべクター開発を行わなけれ
ばならないであろう。その際にｐＮＨＳ２１２を利用す
れば、極めて便利であるものと考えられる。何故ならば
、第１にｐＮＨＳ２１２は高度好熱菌で複製が可能なプ
ラスミドであるからであり、第２には、他の高度好熱菌
由来の既知のクリプティツク・プラスミドもこ比べてや
や小さに分子量を有するという点から、本プラスミドの
必須領域、例えば複製開始点領域、複製に関与する遺伝
子等の解析が〜他の分子量のより大きなプラスミドより
も、容易に行えるという利点を有しているからである。
更にｐＮＨＳ２１２は図からも明らかなように、Ｍ１ｕ
ｌ「 Ｂｇｍなどの制限酵素による開裂部位を特定のし
かも限られた位置に有している。
しくしかも抗生物質が存在しない様な温泉である菌につ
いて考えた場合、薬剤耐性遺伝子等を有するプラスミド
を得る事は容易ではない。従って、性質が不明のいわゆ
るクリプティック・プラスミドに宿主染色体由釆のマー
カ−を賦与するという方式でべクター開発を行わなけれ
ばならないであろう。その際にｐＮＨＳ２１２を利用す
れば、極めて便利であるものと考えられる。何故ならば
、第１にｐＮＨＳ２１２は高度好熱菌で複製が可能なプ
ラスミドであるからであり、第２には、他の高度好熱菌
由来の既知のクリプティツク・プラスミドもこ比べてや
や小さに分子量を有するという点から、本プラスミドの
必須領域、例えば複製開始点領域、複製に関与する遺伝
子等の解析が〜他の分子量のより大きなプラスミドより
も、容易に行えるという利点を有しているからである。
更にｐＮＨＳ２１２は図からも明らかなように、Ｍ１ｕ
ｌ「 Ｂｇｍなどの制限酵素による開裂部位を特定のし
かも限られた位置に有している。
このことはｐＮＨＳ２１２をべクターとして利用する際
に、挿入すべき異種遺伝子の導入部位を有意に保持でき
るという点で有利である。さて、本プラスミドをべクタ
−として異種の耐熱性を有する遺伝子を好熱菌に導入す
れば、醗酵工業に於ける冷却コストの節減が達成されよ
う。
に、挿入すべき異種遺伝子の導入部位を有意に保持でき
るという点で有利である。さて、本プラスミドをべクタ
−として異種の耐熱性を有する遺伝子を好熱菌に導入す
れば、醗酵工業に於ける冷却コストの節減が達成されよ
う。
また、耐熱性、耐溶媒性等の性質に優れた好熱菌の酵素
の遺伝子を、本プラスミドをべクターとして好燕菌宿主
にクローン化し、その量産を図る事によって、バイオリ
アクター等への応用が可能であり、工業プロセスへの応
用が期待される。ｐＮＨＳ２１２の入手は、本発明者ら
が温泉水中から新たに分離した高度好熱菌、サーマス・
フラバスＴＳ２１株をサーマス培地（ディフコ・イース
トエキストラクト０．４％、ポリベプトン（大五栄養）
０．８％、ＮａＣＩＯ．２％）により対数増殖後期迄増
殖させて得た函株を、リゾチーム、ＳＤＳ処理によって
熔蔵させる事によって蓬せられる。また、サーマス・フ
ラバスＴＳ２１株は好気性のグラム染色陰性の梶菌で「
黄色々素を産生しＤＮＡのＧＣ舎量が約７０％「生育至
適温度が７０ｑｏの菌株であるがｐＮＩＪＳ２１２を保
有する点では従釆には認められない新規な微生物である
。
の遺伝子を、本プラスミドをべクターとして好燕菌宿主
にクローン化し、その量産を図る事によって、バイオリ
アクター等への応用が可能であり、工業プロセスへの応
用が期待される。ｐＮＨＳ２１２の入手は、本発明者ら
が温泉水中から新たに分離した高度好熱菌、サーマス・
フラバスＴＳ２１株をサーマス培地（ディフコ・イース
トエキストラクト０．４％、ポリベプトン（大五栄養）
０．８％、ＮａＣＩＯ．２％）により対数増殖後期迄増
殖させて得た函株を、リゾチーム、ＳＤＳ処理によって
熔蔵させる事によって蓬せられる。また、サーマス・フ
ラバスＴＳ２１株は好気性のグラム染色陰性の梶菌で「
黄色々素を産生しＤＮＡのＧＣ舎量が約７０％「生育至
適温度が７０ｑｏの菌株であるがｐＮＩＪＳ２１２を保
有する点では従釆には認められない新規な微生物である
。
本菌株はストレプトマイシン耐性株として温泉水中より
分離されたものである。なお、本菌株は徴工研菌客第６
７５２号として寄託されている。
分離されたものである。なお、本菌株は徴工研菌客第６
７５２号として寄託されている。
以下、実施例により本発明をより具体的に詳述する。
実施例 １
（菌株のスクリーニング）
静岡県の熱川温泉の温泉水約ｌｍｌサーマス塔地（デイ
フコ・イーストエキストラクト０．４％、ポリベプトン
（大五栄養）０．８％、ＮａＣＩＯ．２％）１０仇ｈｌ
に加え７０ｑＣで約１糊時間振濠培養後、ストレプトマ
イシン（２０ムタ′ｍｌ）を含むサーマス寒天平板上で
生育したコロニーの一つからサーマス・フラバスＴＳ２
１株（徴工研菌寄第６７５２号）が得られた。
フコ・イーストエキストラクト０．４％、ポリベプトン
（大五栄養）０．８％、ＮａＣＩＯ．２％）１０仇ｈｌ
に加え７０ｑＣで約１糊時間振濠培養後、ストレプトマ
イシン（２０ムタ′ｍｌ）を含むサーマス寒天平板上で
生育したコロニーの一つからサーマス・フラバスＴＳ２
１株（徴工研菌寄第６７５２号）が得られた。
実施例 ２プラスミドｐＮＨＳ２１２のサーマス・フラ
／ぐスＴＳ２１株からの分離サーマス・フラバスＴＳ２
１株（徴工研菌寄第６７５２号）の生物学的に純粋な培
養基から１０比ｈｌのサーマス培地（ディフコ・イース
トエキストラクトｏ．４％「 ポリベプトーン（大五栄
養）０．８％、ＮａＣＩＯ．２％、ｐＨ７．５）に後種
し７００○で１６〜１８時間振顔培養する。
／ぐスＴＳ２１株からの分離サーマス・フラバスＴＳ２
１株（徴工研菌寄第６７５２号）の生物学的に純粋な培
養基から１０比ｈｌのサーマス培地（ディフコ・イース
トエキストラクトｏ．４％「 ポリベプトーン（大五栄
養）０．８％、ＮａＣＩＯ．２％、ｐＨ７．５）に後種
し７００○で１６〜１８時間振顔培養する。
この培養液を１そのストレプトマイシン２０ムタ′ｍｌ
を含有するサ−マス塔地に接種し、７０００で５時間培
養する。菌体を遠心によって集め、ＴＥＳ（２仇ｈＭＴ
ｒｉｓ一日ＣＩ，耳ｈＭＥＤＴＡ，１皿ｈＭＮａＣ１ｐ
Ｈ７．５）で洗浄後菌体温重量４夕当り、１帆１の２５
％ショ糖含有ＴＥＳに懸濁する。リゾチーム（１０の９
′ｍｌ）を２ｈｌ、０．２９の−ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０
）４ｍｉを加え、０℃で１０分間静層、続いて３７００
に１０分間保温する。この細胞混合液に２ｈｌの１０％
ＳＯＳ、５ｍｌの技Ｍ−ＮａＣＩを加え４℃に１５〜１
８時間静置する。これを２８００仇ｐｍ、１時間の超遠
心によって遠○し、上情を得る。この上清にポリエチレ
ングリコール６０００を１０％（ｗ′ｖ）加え、２〜３
時間０℃に静層、２２０仇ｐｍ、２分の遠心で沈澱を得
る。この沈澱を１５ｍｌのＴＥＳに溶解し、ＣｓＣＩ及
びェチジウムフロマイドを加えて密度を１．６１〜１．
６２に調整する。この試料を３８００仇ｐｍで３０〜４
畑時間、平衡密度勾配遠心する。生じたプラスミドＤＮ
Ａのバンドを集め、ィソアミルアルコールでェチジゥム
フロマィドを除去した後、ＴＥＮ（ ２仇ｈＭＴｒｉＳ
一 日ＣＩ ，１ＭＭＥＤＴＡ，２瓜ｈＭＮａＣＩ）
に透析する事によってプラスミド溶液が得られる。この
プラスミド溶液はｐＮＨＳ２１２と分子量約３．１メガ
ダルトンのｐＮＨＳ２１１及び分子量約１０メガダルト
ンのｐＮＨ２１３との混合物であるが、このプラスミド
溶液を１．０％の低融点アガロース（ＢＲＬ社製）によ
る雷気泳動に供し、生ずるｐＮＨＳ２１２に相当するバ
ンドを切り出してＤＮＡを回収する事によって純粋なｐ
ＮＨＳ２１２が得られる。低融点アガロースゲルからの
ＤＮＡの回収は以下の手順によった。
を含有するサ−マス塔地に接種し、７０００で５時間培
養する。菌体を遠心によって集め、ＴＥＳ（２仇ｈＭＴ
ｒｉｓ一日ＣＩ，耳ｈＭＥＤＴＡ，１皿ｈＭＮａＣ１ｐ
Ｈ７．５）で洗浄後菌体温重量４夕当り、１帆１の２５
％ショ糖含有ＴＥＳに懸濁する。リゾチーム（１０の９
′ｍｌ）を２ｈｌ、０．２９の−ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０
）４ｍｉを加え、０℃で１０分間静層、続いて３７００
に１０分間保温する。この細胞混合液に２ｈｌの１０％
ＳＯＳ、５ｍｌの技Ｍ−ＮａＣＩを加え４℃に１５〜１
８時間静置する。これを２８００仇ｐｍ、１時間の超遠
心によって遠○し、上情を得る。この上清にポリエチレ
ングリコール６０００を１０％（ｗ′ｖ）加え、２〜３
時間０℃に静層、２２０仇ｐｍ、２分の遠心で沈澱を得
る。この沈澱を１５ｍｌのＴＥＳに溶解し、ＣｓＣＩ及
びェチジウムフロマイドを加えて密度を１．６１〜１．
６２に調整する。この試料を３８００仇ｐｍで３０〜４
畑時間、平衡密度勾配遠心する。生じたプラスミドＤＮ
Ａのバンドを集め、ィソアミルアルコールでェチジゥム
フロマィドを除去した後、ＴＥＮ（ ２仇ｈＭＴｒｉＳ
一 日ＣＩ ，１ＭＭＥＤＴＡ，２瓜ｈＭＮａＣＩ）
に透析する事によってプラスミド溶液が得られる。この
プラスミド溶液はｐＮＨＳ２１２と分子量約３．１メガ
ダルトンのｐＮＨＳ２１１及び分子量約１０メガダルト
ンのｐＮＨ２１３との混合物であるが、このプラスミド
溶液を１．０％の低融点アガロース（ＢＲＬ社製）によ
る雷気泳動に供し、生ずるｐＮＨＳ２１２に相当するバ
ンドを切り出してＤＮＡを回収する事によって純粋なｐ
ＮＨＳ２１２が得られる。低融点アガロースゲルからの
ＤＮＡの回収は以下の手順によった。
切り出したゲルスライスを６５℃に保温して融解、これ
に２倍量の０．廉ＭＥＤＴＡを含む５０ｈＭＴｒＳ−Ｈ
ＣＩ緩衝液（ｐＨ８．０）を加え、３７００に移し保温
する。これに等量の０．１ＭＴｒＳ一日ＣＩ緩衝液（ｐ
Ｈ８．０）で飽和させたフェノールを加え混合、遠心（
３０００〜５００仇ｐｍ、５分）後、上層の水層を分取
する。フェノール抽出をもう一度行いエーテルによって
フェノールを水層より除去した後、３Ｍ酢酸アンモニウ
ム溶液を１／１咳客加え、３客のエタノールによりエタ
ノール沈澱を行う。得られた沈澱をＴＥＮに溶解してプ
ラスミド溶液とした。ｐＮＨＳ２１２の特性決定の手順 ｐＮＨＳ２１２の分子量は、その超らせん構造（ｓｕｐ
ｅｒｃｏ可ｅｄｓｔｍｃｔｕｒｅ）のＤＮＡ及び制限酵
素によって切断された断片のアガロースゲル電気泳動及
びボリアクリルアミド・ゲル電気泳動より得られた。
に２倍量の０．廉ＭＥＤＴＡを含む５０ｈＭＴｒＳ−Ｈ
ＣＩ緩衝液（ｐＨ８．０）を加え、３７００に移し保温
する。これに等量の０．１ＭＴｒＳ一日ＣＩ緩衝液（ｐ
Ｈ８．０）で飽和させたフェノールを加え混合、遠心（
３０００〜５００仇ｐｍ、５分）後、上層の水層を分取
する。フェノール抽出をもう一度行いエーテルによって
フェノールを水層より除去した後、３Ｍ酢酸アンモニウ
ム溶液を１／１咳客加え、３客のエタノールによりエタ
ノール沈澱を行う。得られた沈澱をＴＥＮに溶解してプ
ラスミド溶液とした。ｐＮＨＳ２１２の特性決定の手順 ｐＮＨＳ２１２の分子量は、その超らせん構造（ｓｕｐ
ｅｒｃｏ可ｅｄｓｔｍｃｔｕｒｅ）のＤＮＡ及び制限酵
素によって切断された断片のアガロースゲル電気泳動及
びボリアクリルアミド・ゲル電気泳動より得られた。
この際の分子量マ‐カーはｐＢＲ３２狐ＮＡ（２．６７
ｍｄ）、ＣｏｌＥＩＤＮＡ（４．２ｍｄ）及びラムダＤ
ＮＡのＨ仇ｄｍ分解断片（１４．６、５．８４、４．０
５、２．６７、１．３０、１．１７、０．３４ｍｄ）、
ラムダＤＮＡのＥｃｏＲＩ分解断片（１３．７、４．７
４、３．７３、３．４８、３．０２、２．１３ｈｄ入
？ ×１７狐ＮＡのＨａｅｍ分解断片（０．８３６、０
．６６６「 ０．５３９、０．３７３、０．１９２「
０．１７４、０．１６７「 ０１４５「 ０．１２０、
０．０７３、０．０４４ｍｄ）を用いた。制限酵素によ
る切断は、プラスミドＤＮＡ溶液からエタノール沈澱に
よってＤＮＡを沈澱させ、適当な緩衝液に溶解して行な
った。制限酵素は宝酒造及び「ベーリンガー・マンハィ
ム社よりの市販品を用いた。アガロースゲル電気漆動は
シーケム社のアガロースを０．５％又は０．７％の濃度
で用い、水平ゲル電気泳動槽によってゲル長さ１肌当り
１．５Ｖの定電圧で１５〜１７時間行なった。ポリァク
リルァミド・ゲル電気泳動は、生化学工業社製のポリア
クリルアミド・ビスアクリルアミドを用い、５％濃度３
０：１の架橋度のゲルによって垂直型スラブゲル電気泳
動槽により、ゲル長さ１伽あたり１０Ｖの定電圧によっ
て２〜３時間行つた。高度好熱菌のプラスミドとしては
「前記の表に示したとおりであるがｐＮＨＳ２１２と他
のものでは前述のように明らかに異なっており、ｐＮＨ
Ｓ２１２は従来認められない新規なプラスミドである。
ｍｄ）、ＣｏｌＥＩＤＮＡ（４．２ｍｄ）及びラムダＤ
ＮＡのＨ仇ｄｍ分解断片（１４．６、５．８４、４．０
５、２．６７、１．３０、１．１７、０．３４ｍｄ）、
ラムダＤＮＡのＥｃｏＲＩ分解断片（１３．７、４．７
４、３．７３、３．４８、３．０２、２．１３ｈｄ入
？ ×１７狐ＮＡのＨａｅｍ分解断片（０．８３６、０
．６６６「 ０．５３９、０．３７３、０．１９２「
０．１７４、０．１６７「 ０１４５「 ０．１２０、
０．０７３、０．０４４ｍｄ）を用いた。制限酵素によ
る切断は、プラスミドＤＮＡ溶液からエタノール沈澱に
よってＤＮＡを沈澱させ、適当な緩衝液に溶解して行な
った。制限酵素は宝酒造及び「ベーリンガー・マンハィ
ム社よりの市販品を用いた。アガロースゲル電気漆動は
シーケム社のアガロースを０．５％又は０．７％の濃度
で用い、水平ゲル電気泳動槽によってゲル長さ１肌当り
１．５Ｖの定電圧で１５〜１７時間行なった。ポリァク
リルァミド・ゲル電気泳動は、生化学工業社製のポリア
クリルアミド・ビスアクリルアミドを用い、５％濃度３
０：１の架橋度のゲルによって垂直型スラブゲル電気泳
動槽により、ゲル長さ１伽あたり１０Ｖの定電圧によっ
て２〜３時間行つた。高度好熱菌のプラスミドとしては
「前記の表に示したとおりであるがｐＮＨＳ２１２と他
のものでは前述のように明らかに異なっており、ｐＮＨ
Ｓ２１２は従来認められない新規なプラスミドである。
図面はｐＮＨＳ２１２の制限酵素開裂地図を示し、図中
のＭ１ｕｌはミクロコツカス・ルテウス由来の酵素、Ｂ
ｇ１０‘まバチルス・グロビギィ由来の酵素、Ｐｓｔｌ
はプロビデンシア・スチュアルティィ由来の酵素をそれ
ぞれ示している。
のＭ１ｕｌはミクロコツカス・ルテウス由来の酵素、Ｂ
ｇ１０‘まバチルス・グロビギィ由来の酵素、Ｐｓｔｌ
はプロビデンシア・スチュアルティィ由来の酵素をそれ
ぞれ示している。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ 分子量が約５．４メガダルトンであり、図に示され
る制限酵素地図で特徴づけられるサーマス属菌由来のプ
ラスミド。 ▲数式、化学式、表等があります▼
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP57189527A JPS6037B2 (ja) | 1982-10-28 | 1982-10-28 | 高度好熱菌に由来する新規なプラスミド |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP57189527A JPS6037B2 (ja) | 1982-10-28 | 1982-10-28 | 高度好熱菌に由来する新規なプラスミド |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS5978691A JPS5978691A (ja) | 1984-05-07 |
| JPS6037B2 true JPS6037B2 (ja) | 1985-01-05 |
Family
ID=16242779
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP57189527A Expired JPS6037B2 (ja) | 1982-10-28 | 1982-10-28 | 高度好熱菌に由来する新規なプラスミド |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS6037B2 (ja) |
-
1982
- 1982-10-28 JP JP57189527A patent/JPS6037B2/ja not_active Expired
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS5978691A (ja) | 1984-05-07 |
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