JPS603835B2 - トリンダ−試薬、及びそれを使用して過酸化水素を分析する方法 - Google Patents
トリンダ−試薬、及びそれを使用して過酸化水素を分析する方法Info
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- JPS603835B2 JPS603835B2 JP56014512A JP1451281A JPS603835B2 JP S603835 B2 JPS603835 B2 JP S603835B2 JP 56014512 A JP56014512 A JP 56014512A JP 1451281 A JP1451281 A JP 1451281A JP S603835 B2 JPS603835 B2 JP S603835B2
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Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、改良されたトリンダー試薬、及びそれを使用
して、過酸化水素を分析する方法に関し、特に、ァミノ
ピリンを含むトリンダー試薬、及びそれを使用して過酸
化水素を分析する方法に関する。
して、過酸化水素を分析する方法に関し、特に、ァミノ
ピリンを含むトリンダー試薬、及びそれを使用して過酸
化水素を分析する方法に関する。
臨床化学において、グルコースオキシダーゼ、コレステ
ロールオキシダーゼ、ウリカーゼ、Ｑ−グリセルフオス
フアートオキシダーゼ、コリネオキシダーゼのようなオ
キシダーゼの作用により、特定の物質より形成される過
酸化水素の定量分析に際し、「アナルス・オブ・クリニ
カル・バイオケミストリー」（Ａｎｎ．ＣＩｉｎ．Ｂｉ
ｏｃｈｅｍ．）６、２４（１９６９）に記載されている
ように、トリンダー試薬（Ｔｒｉｎｄｅｒ′ｓ）反応が
広く使用されている。
ロールオキシダーゼ、ウリカーゼ、Ｑ−グリセルフオス
フアートオキシダーゼ、コリネオキシダーゼのようなオ
キシダーゼの作用により、特定の物質より形成される過
酸化水素の定量分析に際し、「アナルス・オブ・クリニ
カル・バイオケミストリー」（Ａｎｎ．ＣＩｉｎ．Ｂｉ
ｏｃｈｅｍ．）６、２４（１９６９）に記載されている
ように、トリンダー試薬（Ｔｒｉｎｄｅｒ′ｓ）反応が
広く使用されている。
この反応は、グルコース、コレステロール、尿酸並びに
トリグリセラィドのような、生物学的に非常に重要な代
謝産物と、酵素酸化反応とを組合わせた測定方法よりな
っている。特に、公知のトリンダークロモゲン法は、フ
ェノールと、４−アミノフヱナゾン、即ち４−アミノ−
１・５ージメチル−２ーフエニルーピラゾロンとを、ベ
ルオキシダーゼの存在の下に、過酸化水素により酸化し
て、赤色のキノニミニック（ｃｈｉｎｏｎｊｍｍｉｎｉ
ｃ）化合物を生成し、この色度より、試験時に試料に存
在するグルコース、コレスプロール、尿酸のような代謝
産物の量を間接的に測定するものである。
トリグリセラィドのような、生物学的に非常に重要な代
謝産物と、酵素酸化反応とを組合わせた測定方法よりな
っている。特に、公知のトリンダークロモゲン法は、フ
ェノールと、４−アミノフヱナゾン、即ち４−アミノ−
１・５ージメチル−２ーフエニルーピラゾロンとを、ベ
ルオキシダーゼの存在の下に、過酸化水素により酸化し
て、赤色のキノニミニック（ｃｈｉｎｏｎｊｍｍｉｎｉ
ｃ）化合物を生成し、この色度より、試験時に試料に存
在するグルコース、コレスプロール、尿酸のような代謝
産物の量を間接的に測定するものである。
しかし、トリンダー反応は、ビリルビンとヘモグロビン
のような内因性物質、及び薬剤のような外因性物質によ
って妨害作用を受ける。
のような内因性物質、及び薬剤のような外因性物質によ
って妨害作用を受ける。
特に、鉄−プロトポルフィリン緒体のような「ヘム」の
異化により生成されるピリルビンは、主要な妨害源であ
る。
異化により生成されるピリルビンは、主要な妨害源であ
る。
これは、ジェイコブセン、ジェー（Ｊａｃｏｂｓｅｎ、
Ｊ．）及びウェンバーグ、アール・ピー（Ｗｅｎ肋ｅｒ
ｇ、Ｒ．Ｐ．）が、「クリニカル・ケミストリー」２０
、７８３（１９７４）で述べているように、過酸化水素
又はベルオキシダーゼが、正常な人体の血清中に０．６
の９／ｄ‘から１．２の９／のの濃度で、また、高ビリ
ルビン血症の人体の血清中には、３．０の９／ｄ‘から
３０の９／のの濃度で必ず存在するためである。クロモ
ゲン法のトリンダ−型における、ビリルビンによるこの
ような妨害作用については、「プリンシブ・クアド・ス
クラボ・ダイアグノステイツクＪ（ＰｒｉｎｃｉｐｅＱ
雌ｄ．ＳｃｌａｖｏＤｊａ劉．）１４、１６４（１９７
８）の中で、フオサツテイ、エル（Ｆｏｓｓａｔｉ、Ｌ
．）が、また「クリニカル・ケミストリ−」２４１７７
８（１９７８）の中で、ウイツテ、ディー、ェル（Ｗｉ
ｔに、Ｄ．Ｌ．）、ブラウン、エル、エフ（Ｂｒｏｗｎ
、Ｌ．Ｆ）他が、種々の解決方法を提案している。
Ｊ．）及びウェンバーグ、アール・ピー（Ｗｅｎ肋ｅｒ
ｇ、Ｒ．Ｐ．）が、「クリニカル・ケミストリー」２０
、７８３（１９７４）で述べているように、過酸化水素
又はベルオキシダーゼが、正常な人体の血清中に０．６
の９／ｄ‘から１．２の９／のの濃度で、また、高ビリ
ルビン血症の人体の血清中には、３．０の９／ｄ‘から
３０の９／のの濃度で必ず存在するためである。クロモ
ゲン法のトリンダ−型における、ビリルビンによるこの
ような妨害作用については、「プリンシブ・クアド・ス
クラボ・ダイアグノステイツクＪ（ＰｒｉｎｃｉｐｅＱ
雌ｄ．ＳｃｌａｖｏＤｊａ劉．）１４、１６４（１９７
８）の中で、フオサツテイ、エル（Ｆｏｓｓａｔｉ、Ｌ
．）が、また「クリニカル・ケミストリ−」２４１７７
８（１９７８）の中で、ウイツテ、ディー、ェル（Ｗｉ
ｔに、Ｄ．Ｌ．）、ブラウン、エル、エフ（Ｂｒｏｗｎ
、Ｌ．Ｆ）他が、種々の解決方法を提案している。
ピリルビンによる妨害作用は、トリンダー反応により測
定することのできるグルコースの濃度よりも、１び音以
上も低い２．７雌′のから７．５の９／の位の低濃度の
血清中の尿素を測定する場合に、特に著しく現れる。
定することのできるグルコースの濃度よりも、１び音以
上も低い２．７雌′のから７．５の９／の位の低濃度の
血清中の尿素を測定する場合に、特に著しく現れる。
即ち、グルコースを測定する場合、吸収を光度測定によ
り確実に読み取れる５０仇肋では、血清と試薬との希釈
率が、１：１５０であるのに対し、トリンダー試薬によ
り尿酸を測定するのに際して、同一の吸光度、即ち同一
の感度を与えるには、血清と試薬との希釈率を、１：１
５の割合にする必要がある。
り確実に読み取れる５０仇肋では、血清と試薬との希釈
率が、１：１５０であるのに対し、トリンダー試薬によ
り尿酸を測定するのに際して、同一の吸光度、即ち同一
の感度を与えるには、血清と試薬との希釈率を、１：１
５の割合にする必要がある。
しかし、このような条件の下では、ビリルビンによる妨
害作用により、尿酸の正確な定量は妨げられる。
害作用により、尿酸の正確な定量は妨げられる。
このことは、グルコース測定の場合には、血清の高希釈
率により、ビリルビンの妨害作用を無視しうろことに比
べて異なる点である。このような欠点を克服するために
、「アナリスト」（Ａ雌ｌｙｓｔ）９７、１４２（１９
７２）において、バーハム、デイー（斑ｒｈａｍ、Ｄ．
）とトリンダー、ピー（Ｔｒｉｎｄｅｒ、Ｐ．）は、フ
ェノールの代りに、２一４ジクロロフェニルスルホン酸
を用いることを提案している。この方法によれば、普通
のトリンダ−試薬の４倍の強度の発色団が得られる。そ
れにより、１：４０の血清と試薬の希釈率が達成され、
それにより、ビリルビンによる妨害を消滅することはで
きないが、減少させることはできる。その後、ビリルビ
ンによる妨害作用を完全に消滅させるべく、次のような
種々の方法が提案された。‘ａ｝ クローズ、エス（Ｋ
ｌｏｓｅ、Ｓ．）、シユトルツ、エム（Ｓｔｏｌｚ、Ｍ
．）、ミユンツ、イー（Ｍｕｍ、Ｅ．）他が、「クリニ
カル・ケミストリー」２４２５０（１９７８）で述べる
ような、蛋白質とビリルビンの除去による試料の透析法
。
率により、ビリルビンの妨害作用を無視しうろことに比
べて異なる点である。このような欠点を克服するために
、「アナリスト」（Ａ雌ｌｙｓｔ）９７、１４２（１９
７２）において、バーハム、デイー（斑ｒｈａｍ、Ｄ．
）とトリンダー、ピー（Ｔｒｉｎｄｅｒ、Ｐ．）は、フ
ェノールの代りに、２一４ジクロロフェニルスルホン酸
を用いることを提案している。この方法によれば、普通
のトリンダ−試薬の４倍の強度の発色団が得られる。そ
れにより、１：４０の血清と試薬の希釈率が達成され、
それにより、ビリルビンによる妨害を消滅することはで
きないが、減少させることはできる。その後、ビリルビ
ンによる妨害作用を完全に消滅させるべく、次のような
種々の方法が提案された。‘ａ｝ クローズ、エス（Ｋ
ｌｏｓｅ、Ｓ．）、シユトルツ、エム（Ｓｔｏｌｚ、Ｍ
．）、ミユンツ、イー（Ｍｕｍ、Ｅ．）他が、「クリニ
カル・ケミストリー」２４２５０（１９７８）で述べる
ような、蛋白質とビリルビンの除去による試料の透析法
。
しかし、この方法は、適当な透析ユニットを有する連続
フローアナライザーにしか適用できないという欠点があ
る。
フローアナライザーにしか適用できないという欠点があ
る。
‘ｂー プレンシプ、エル（Ｐｒｅｎｃｌｐｅ、Ｌ．）
、フオサッテイ、ピー（Ｆｏｓｓａｔｉ、Ｐ．）他が、
「クアド・スクラポ・ダイアグノシス」（Ｑｕａｄ．Ｓ
ｃｌａｖｏＤｉａ柳．）１４３８３（１９７８）で述べ
ているように、フェリチアンカリウムによるか、若し〈
はべラシノ、エヌ（Ｐｅｒａｃｌｎｏ、Ｎ．）、ゾツピ
、エフ（ｚｏｐｐｉ、Ｆ．）他が、「ユーリツクアシツ
ドアセイ」（Ｕｒｉｃａｃｉｄａｓｓａｙ）の「ウリカ
ーゼ・ベルオキシダーゼークロモゲンと、ウリカーゼー
カタラーゼーアルデヒド・デヒドロジナーゼーＮＡＤ＋
を使用する方法」の中で述べられているように、過酸化
エチレン又はエチレンベルオキシダーゼにより、ビリル
ビンとビリベルジンを酸化する方法。
、フオサッテイ、ピー（Ｆｏｓｓａｔｉ、Ｐ．）他が、
「クアド・スクラポ・ダイアグノシス」（Ｑｕａｄ．Ｓ
ｃｌａｖｏＤｉａ柳．）１４３８３（１９７８）で述べ
ているように、フェリチアンカリウムによるか、若し〈
はべラシノ、エヌ（Ｐｅｒａｃｌｎｏ、Ｎ．）、ゾツピ
、エフ（ｚｏｐｐｉ、Ｆ．）他が、「ユーリツクアシツ
ドアセイ」（Ｕｒｉｃａｃｉｄａｓｓａｙ）の「ウリカ
ーゼ・ベルオキシダーゼークロモゲンと、ウリカーゼー
カタラーゼーアルデヒド・デヒドロジナーゼーＮＡＤ＋
を使用する方法」の中で述べられているように、過酸化
エチレン又はエチレンベルオキシダーゼにより、ビリル
ビンとビリベルジンを酸化する方法。
しかし、この方法は、血清と試薬の低希釈率のために、
分析される試料毎に、ブランク試験をしなくてはならな
いという欠点があった。
分析される試料毎に、ブランク試験をしなくてはならな
いという欠点があった。
更に、分析法の煩雑さを解消し、上記の欠陥を克服する
目的で、種々の代謝産物、特に尿酸の直接測定について
も研究がなされている。その結果、次のような方法が提
案されている。
目的で、種々の代謝産物、特に尿酸の直接測定について
も研究がなされている。その結果、次のような方法が提
案されている。
‘ｃ｝ 過酸化水素法又はべロキシダーゼ法により、フ
ェロサィアナィドをフェリサイアナィド‘こ酸化し、そ
れにより、ビリルビンによる妨害作用を防止する方法。
ェロサィアナィドをフェリサイアナィド‘こ酸化し、そ
れにより、ビリルビンによる妨害作用を防止する方法。
上記の問題に対し、本発明によれば、尿酸の分析に際し
て、トリンダーの改良されたクロモゲン法により尿酸を
酵素と共に分析するための種々の成分に対し、高濃度の
アミノピリンを添加することによって、トリンダー試案
を改良し、トリンダー反応におけるピリルビンの妨害作
用を大幅に克服することができる。事実、４ーアミノフ
ェナゾン、ビリルビン、及び過酸化水素に対する高濃度
のアミノピリンにより、ゥリカーゼ酵素とともに尿酸の
酸化中に生成した過酸化水素とビリルビンの反応が、ト
リンダー反応平衡における質量作用の結果防止されるた
め、アミノピリンの存在の重要性が実験的に確かめられ
ている。
て、トリンダーの改良されたクロモゲン法により尿酸を
酵素と共に分析するための種々の成分に対し、高濃度の
アミノピリンを添加することによって、トリンダー試案
を改良し、トリンダー反応におけるピリルビンの妨害作
用を大幅に克服することができる。事実、４ーアミノフ
ェナゾン、ビリルビン、及び過酸化水素に対する高濃度
のアミノピリンにより、ゥリカーゼ酵素とともに尿酸の
酸化中に生成した過酸化水素とビリルビンの反応が、ト
リンダー反応平衡における質量作用の結果防止されるた
め、アミノピリンの存在の重要性が実験的に確かめられ
ている。
即ち、アミノピリンが、２−４ージクロロフエニルスル
ホン酸と過酸化水素とともに、トリンダ‐反応に直接加
わり、この発色団が、４−アミノフエナゾン、２・４ー
ジクロロフエニルスルホン酸および過酸化水素の間の反
応に現われる発色団よりも、わずかに薄い色を呈するこ
とにより、実験的に検証されている。
ホン酸と過酸化水素とともに、トリンダ‐反応に直接加
わり、この発色団が、４−アミノフエナゾン、２・４ー
ジクロロフエニルスルホン酸および過酸化水素の間の反
応に現われる発色団よりも、わずかに薄い色を呈するこ
とにより、実験的に検証されている。
これを更に説明すると、生成したすべての過酸化水素が
、アミノピリン及び４ーアミノフェナゾンとともに、ト
リンダー試薬に完全に吸収される結果、ビリルビンによ
る妨害作用が十分に防止されるせいである。
、アミノピリン及び４ーアミノフェナゾンとともに、ト
リンダー試薬に完全に吸収される結果、ビリルビンによ
る妨害作用が十分に防止されるせいである。
特にアミノピリンの濃度について述べると、有効な濃度
は１多／そから３０夕／そであり、特に約１５夕／そが
好適であることが、実験により確かめられた。
は１多／そから３０夕／そであり、特に約１５夕／そが
好適であることが、実験により確かめられた。
本発明による、アミノピリンを有する改良されたトリン
ダ−試薬を含む、血清のような生物学的試料中の尿酸分
析における実験的な研究によれば、この新規な方法を実
施するための必要な条件は、反応をなす酵素の触媒活性
と、種々の成分の濃度が、次表に示す場合に好適である
ことが分った。
ダ−試薬を含む、血清のような生物学的試料中の尿酸分
析における実験的な研究によれば、この新規な方法を実
施するための必要な条件は、反応をなす酵素の触媒活性
と、種々の成分の濃度が、次表に示す場合に好適である
ことが分った。
ベルオキシダーゼ ２０００１Ｕ／〆
２・４−ジクロロフェニルスルホン酸ナトリウム塩
１夕／そリン酸二水素カリウム（
ＫＨ２Ｐ０４） １８タノ〆棚砂（Ｎａ２Ｂ４０７・
１０日２０） １３．９夕／そ４−アミノフ
エナゾン ２６０の９′そアミノピリン
１５タ′とウリカーゼ（例えばア
ルベルギルス・フラブス）１００１Ｕ／夕また、血清と
クロモゲン試薬の比率は、１：４０であり、更に反応生
成物の分光光度計による測定は５０仇肋乃至５２仇舷の
間においてなされる。
２・４−ジクロロフェニルスルホン酸ナトリウム塩
１夕／そリン酸二水素カリウム（
ＫＨ２Ｐ０４） １８タノ〆棚砂（Ｎａ２Ｂ４０７・
１０日２０） １３．９夕／そ４−アミノフ
エナゾン ２６０の９′そアミノピリン
１５タ′とウリカーゼ（例えばア
ルベルギルス・フラブス）１００１Ｕ／夕また、血清と
クロモゲン試薬の比率は、１：４０であり、更に反応生
成物の分光光度計による測定は５０仇肋乃至５２仇舷の
間においてなされる。
分光光度計の記録計でクロモゲン反応の進展を観察しな
がら、アミノピリンを加えたり、加えなかったりして、
対比の試験を実施した。過酸化水素がビリルビンを酸化
するため、４３仇凧で負吸収のピーク値が形成されるの
で、ｌｏｏのＺ当り、それぞれ１１．６雌、１４．８２
の９、１５．３０雌、１６の９、並びに１８の２のビリ
ルビンを含む試料において、ビリルビンによる妨害作用
が示された。
がら、アミノピリンを加えたり、加えなかったりして、
対比の試験を実施した。過酸化水素がビリルビンを酸化
するため、４３仇凧で負吸収のピーク値が形成されるの
で、ｌｏｏのＺ当り、それぞれ１１．６雌、１４．８２
の９、１５．３０雌、１６の９、並びに１８の２のビリ
ルビンを含む試料において、ビリルビンによる妨害作用
が示された。
事実、アミノピリンの存在下に、負吸収のピーク値が、
６５％から９０％位という大きな値まで減少することが
観察された。本発明をより詳しく説明するために、いく
つかの比較実施例を次に挙げる。
６５％から９０％位という大きな値まで減少することが
観察された。本発明をより詳しく説明するために、いく
つかの比較実施例を次に挙げる。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ 代謝物の酵素酸化により、ビリルビンの存在下に過
酸化水素を臨床分析するために、２・４−ジクロロフエ
ニルスルホン酸、及び４−アミノフエナゾンを含むトリ
ンダー試薬であって、 前記ビリルビンにより、上記分
析が妨害されるのを防止するために、１ｇ／ｌから３０
ｇ／ｌまでの割合で、アミノピリンを含むことを特徴と
するトリンダー試薬。 ２ アミノピリンを１５ｇ／ｌの割合で含有することを
特徴とする特許請求の範囲第１項に記載のトリンダー試
薬。３ ペルオキシダーゼ 約２０００ＩＵ／ｌ２・４
−ジクロロフエニルスルホン酸ナトリウム塩 約１ｇ／
ｌリン酸二水素カリウム（ＫＨ＿２ＰＯ＿４） １８ｇ
／ｌ硼砂（Ｎａ＿２Ｂ＿４Ｏ＿７・１０Ｈ＿２Ｏ） １
３．９ｇ／ｌ４−アミノフエナゾン 約２６０ｍｇ／ｌ
アミノピリン 約１５ｇ／ｌ ウリカーゼ（例えばアスペルギルスフラブス）約１００
ＩＵ／ｌの各成分よりなる特許請求の範囲第１項若しく
は第２項に記載のトリンダー試薬。 ４ 代謝物の酵素酸化により、ビリルビンの存在下で過
酸化水素を臨床分析するために、２・４−ジクロロフエ
ニルスルホン酸、４−アミノフエナゾン、並びに１ｇ／
ｌから３０ｇ／ｌの割合でアミノピリンを含むトリンダ
ー試薬を使用し、 次に、血清とクロモゲン試薬とを、
１：４０の割合で使用し、 最後に、反応生成物を、分
光光度計の５００ｍｍと５２０ｍｍ範囲で測定すること
を特徴とする、トリンダー試薬を使用して、代謝産物の
酵素酸化により過酸化水素を分析する方法。 ５ トリンダー試薬が、アミノピリンを１５ｇ／ｌの割
合で含有することを特徴とする特許請求の範囲第４項に
記載の方法。 ６ トリンダー試薬が、 ペルオキシダーゼ 約２０００ＩＵ／ｌ ２・４−ジクロロフエニルスルホン酸ナトリウム塩 約
１ｇ／ｌ燐酸二水素カリウム（ＫＨ＿２ＰＯ＿４） 約
１８ｇ／ｌ硼砂（Ｎａ＿２Ｂ＿４Ｏ＿７・１０Ｈ＿２Ｏ
） 約１３．９ｇ／ｌ４−アミノフエナゾン 約２６０
ｍｇ／ｌアミノピリン 約１５ｇ／ｌウリカーゼ（例え
ばアスペルギルスフラブス）約１００ＩＵ／ｌの各成分
よりなることを特徴とする特許請求の範囲第４項に記載
の方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| AU88152/82A AU543356B2 (en) | 1981-02-04 | 1982-09-09 | Device for charging weighed out articles |
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| IT19672A/80 | 1980-02-04 | ||
| IT19672/80A IT1130252B (it) | 1980-02-04 | 1980-02-04 | Metodo per l'eliminazione dell'interferenza da biliribuna nel dosaggio di perossido di idrigeno mediante una reazione di trinder modificata |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS56124398A JPS56124398A (en) | 1981-09-30 |
| JPS603835B2 true JPS603835B2 (ja) | 1985-01-30 |
Family
ID=11160273
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP56014512A Expired JPS603835B2 (ja) | 1980-02-04 | 1981-02-04 | トリンダ−試薬、及びそれを使用して過酸化水素を分析する方法 |
Country Status (8)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4350762A (ja) |
| EP (1) | EP0033462A1 (ja) |
| JP (1) | JPS603835B2 (ja) |
| AR (1) | AR224670A1 (ja) |
| BR (1) | BR8100648A (ja) |
| DE (1) | DE3021259C2 (ja) |
| ES (1) | ES8301538A1 (ja) |
| IT (1) | IT1130252B (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS62195135U (ja) * | 1986-06-02 | 1987-12-11 |
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| JPH0614879B2 (ja) * | 1984-04-27 | 1994-03-02 | 株式会社ヤトロン | ビリルビンの干渉を回避して行なう生体成分の測定方法 |
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| ATE485766T1 (de) | 2001-06-12 | 2010-11-15 | Pelikan Technologies Inc | Elektrisches betätigungselement für eine lanzette |
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