JPS6040862B2 - 抗血栓性材料 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は抗血栓性材料に関し、詳しくは材料表面にアル
ブミンを固定化して血小板の粘着を抑制すると共に、こ
のアルブミンに抗凝血物質及び／又は線溶系賦活化酵素
を固定化して血液凝固活性を低減させ、かくして相乗的
に抗血栓性を高めた抗血栓性材料に関する。

人工臓器やカテーテル等の使用時に生ずる内因性血液凝
固は、血液と異物表面との接触による凝固系第皿因子の
活性化により初期反応が開始され、凝固系因子のカスケ
ード的活性化の結果、Ｘａやトロンビン等が生成され、
最終的にはフィブリン網が形成されることにより生じる
。

これらの活性化された凝固系因子は、血液中の阻害物質
であるアンチトロンビンｍによりその作用が徐々に阻害
されるが、ヘパリンの共存によりその阻害効果が著しく
高められる。

従って、臨床的に血液凝固の惹起が懸念される場合には
、ヘパリンを投与することが常套手段となっている。こ
のため、人工心腕や人工腎臓等の人工臓器を利用する場
合には多量のへパリンを投与することとなるが、このよ
うな場合、出血傾向が顕著となる等の多くの副作用を伴
ない、これらの副作用は人工臓器の長期使用により更に
著しくなる。そこで、近時においては、ヘパリンを適宜
の水不溶性高分子担体に固定化し、これに血液を接触さ
せることにより、ヘパリンを血液中に混入しない状態に
保持しつつ、これに血液中のトロンビン等を捕捉せしめ
て血液の凝固を防止する方法が提案されている。

しかし、担体にへパリンを単独で固定化しただけでは満
足すべき抗凝血性が発現されない。このため、本発明者
らは、先にへパリンの固定化に際し、これとアンチトロ
ンビンｍを共存状態を保ちつつ同時に担体に固定化する
ときは、へパリン或いはアンチトロンビンｍをそれぞれ
単独で固定化したものに比べて遥かに優れた抗凝血作用
を発揮する事実を見出した（椿関昭５４一２４４７８号
公報）。

このようにへパリンとアンチトロンビンｍを共存状態を
保ちつつ固定化した材料は、血液凝固因子のＸａやトロ
ンビンに作用して、これを不活性化し、すぐれた孔凝血
作用を発揮することができるものの、固定化されたへパ
リンアンチトロンビンｍはこれらの血液凝固因子と量論
的に作用するため、この材料の抗凝血作用は有限であり
、従って、対応量の活性化凝固因子との結合後には血液
凝固限界効果を有しない点に尚問題が残されている。一
方、抗凝血物質を固定化する担体については、従来、ポ
リエチレン、ポリプロピレン、エチレンービニルアルコ
ール共重合体、ポリテトラフルオロェチレン「天然ゴム
、合成ゴム等の疎水性高分子や、ポリビニルアルコール
、ポリアクリルアミドゲル等の親水性高分子がよく知ら
れているが「疎水性高分子は一般に抗血栓性材料に要求
される血液適合性に劣り、親水性高分子は機械的強度に
劣る傾向があると共に〜一般に抗凝血物質の固定化に複
雑な操作を要する。

しかし、特に血液チューブや人工臓器には大きい機械的
強度が要求されるところから「従来「疎水性高分子が担
体として用いられることが多いが、一方、このような疎
水性高分子には抗凝血物質を固定化するための官能基が
一般に少ないので「十分な抗凝血効果を得るに足るだけ
の量の抗凝血物質を固定化することが困難である。そこ
で「本発明者らは、従釆の抗血栓性材料における上記し
た種々の問題を鱗決すべく鋭意研究した結果、材料にア
ルブミンを固定化すれば「このァルブミンの有する多数
の官能基を利用して多量の抗凝血物質を容易に固定化す
ることができると共に、固定化されたアルブミンが材料
への血小板の粘着を抑えることと相俊つて〜すぐれさ抗
血栓性材料を得ることができることを見出して〜本発明
に至ったものである。

従って「本発明による抗血栓性材料は、材料表面に固定
化されたアルブミン上に抗凝血物質及び／又は線溶系鰍
活化酵素が固定化されていることを特徴とする。

本発明においては前記したような疎水性重合体及び親水
性重合体のいずれでも材料として用いることができ、こ
のほか、生体に対して実質的な有害に作用しない物質で
あり、アルブミンが固定化されればどのような材料でも
用いることができる。

従って、本発明において用いることのできる重合体とし
て、例えばポリエチレン、ポリプロピレン、ポリイソブ
チレン、ポリメチルベンテン、ポリスチレン、天然ゴム
、クロロブレンゴム「ボリ塩化ビーニル「ポリフツ化ビ
ニル、ポリテトラフルオロェチレン、ポリ塩化ビニリデ
ン、ポリ酢酸ビニル、ポリビニルアルコール、エチレン
ービニルアルコール共重合体、ポリアクリロニトリル、
ポリグリコール酸、ポリビニルピロリドン、ポリビニル
ホルマール、ボリビニルブチラール、アセタール樹脂、
アクリル樹脂、ポリアクリルアミド、ポリカーボネート
、ポリスルホン、ポリエチレンテレフタレート、ポリエ
チレンナフタレ−ｒトポリアミド、ポリイミドもセルロ
ース、ニトロセルロース、セロハン、コラーゲン〜ゼラ
チン〜多糖類等を挙げることができる。材料へのアルブ
ミンの固定化の方法は何ら制限されず、従来より知られ
ているタンパク質固定化方法を任意に用いることができ
る。

アルブミンは抗凝血物質及び／又は線溶系賦活化酵素を
固定化するための二次的な担体を形成し「それ自体は何
ら抗凝血活性を有するものではないから、固定化方法及
び条件は任意であり、これらを選択することによりも所
望の量のアルブミンを固定化することができる。好まし
くは共有結合法により固定化する。本発明はこのように
して材料に固定化されたアルブミンの有する多数のカル
ボキシル基やアミノ基を利用して「抗凝血物質及び／又
は線溶系賦溝化酪を固定化する。用いる抗凝血物質及び
線溶系賦宿化酵素は特に制限されないが、好ましくは抗
凝血物質としてへパリンとアンチトロンビン皿が共存状
態で固定化され、また、緑溶系賦宿化酵素としてはウロ
キナーゼやストレプトキナーゼが固定化される特に好ま
しくは、へパリン、アンチトロンビンｍ及びゥロキナー
ゼの三者が共に共存状態で固定化される。このような系
によれば、へパリン山アンチトロンビンｍによる凝固阻
害機能と線溶系賦活化酵素による線熔能とは作用機序が
異るものであるにも拘らず、両系をそれぞれ別途に固定
化したものに比較して、著しい血栓形成抑制効果の延長
が認められる。本発明において材料に抗凝血物質及び線
済系賦活化酵素を結合させる方法は特に制限されず「共
有結合法「イオン結合法等の適宜の方法が用いられる。

例えばカルボジィミド試薬或いはウッドワード試薬と共
に上誌物質を材料に反応させれば容易に共有結合にて固
定化されるが、これらの方法に限定されるものではない
。また、上言己物質を材料にイオン結合させるには、上
読物質の水溶液に材料を浸簿すればよい。本発明に使用
するアンチトロンビン瓜は主に牛由釆のものを用いるが
、その他〜犬、家兎などに由来するものでもよい。

また、線溶系賦活化酵素は主に人由来のウ。キナーゼを
用いるが、ストレプトキナーゼを用いても良い。材料に
固定すべきへパリン、アンチトロンビンｍ及び線溶系賦
活化酵素の量について特に制限はないが、通常、材料面
積１の当りへパリン０．１〜１００山夕、アンチトロン
ビン血０．１〜１００仏タ及び線漆系賦活化酵素０．１
〜２００４夕を固定化すれば良好な抗凝固作用を示す人
工医療材料が得られる。

へパリンーアンチトロンビンｍ・及び線溶系賦活化酵素
の固定割合についても特に制限はない。へパリンーアン
チトロンビンｍ及び線溶系賦活化酵素の固定化はこれら
を個別に行ってもよいが、同時に行った方が操作が簡単
で有利である。本発明による抗血栓性材料は、使用目的
に応じて、材料を予め所要形状に成形しておけば、粒子
状、シート状、管状等いずれの形態でも調製でき、これ
に血液を接触させれば、トロンビン等が容易に捕捉され
、また、僅かに形成された血液凝固塊もウロキナーゼ等
の糠溶系賦活化作用により再熔解することができ「血液
の凝固が阻止され「正常な血液の流動状態が得られる。

トロンビンを捕捉した材料は、これをたとえばＩＮ酢酸
溶液で洗うことにより、トロンビン捕捉機能を再賦活で
きる。本発明の抗血栓性材料は以上のように、アルブミ
ンを固定化した材料上に抗凝血物質及び／又は線溶系競
活化酵素が固定化されている。

即ち、アルブミンの有する多数の官能基を利用するので
、抗凝血物質及び／又は線溶系鰍宿化酵素を隠和な条件
により簡単に多量に固定化することができ、高い抗血栓
性を有する材料を得ることができる。特に「材料自体が
僅かの官能基しか有さない場合でも、アルブミンを二次
的な担体として利用するので、材料の種類にかかわらず
抗血栓性の高い材料を得ることができる。更に、アルブ
ミンを固定化するに際しては、酵素の安定性等を考慮す
る必要がなく、固定化条件を厳しくしてもよいので、ア
ルブミンを多量に固定化することができる。また、例え
ば再生セルロースやエチレンービニルアルコール共重合
体は官能基として多数の水酸基を有するが、水酸基は臭
化シアン等による活性化処理を行なっても、十分な量の
抗凝血物質や線溶系賦活化酵素を固定化することが困難
である。しかし、本発明によれば、これらの材料の場合
にもアルブミンの官能基により多量の固定化が可能であ
る。アルブミン固定化材料は多数のカルポキシル基やア
ミ／基を有するため、抗凝血物質や線溶系賦活化酵素の
固定化に際して極めて隠和な条件下これらを高活性に維
持しつつ、多量に固定化することができる点も大きい利
点である。更に、本発明の抗血栓性材料においては、材
料に固定化したァルブミンが材料への血小板の粘着を抑
制する効果を有し〜従って、抗血栓性材料表面での血栓
の形成を有効に阻止するので、アルブミンに固定化され
た抗凝血物質の効果と相換って「相乗的に高い抗血栓性
を発揮する。

特に、抗凝血物質と線溶系競活化酵素を共存状態で固定
化すれば、血栓形成が著しく抑制されることは前記した
とおりである。以下に実施例により本発明を説明するが
、本発明はこれら実施例により何ら限定されるものでは
ない。

実施例 １ （ポリアミド担体へのウロキナーゼの固定化）○｝ 固
定化｛ａ｝ ポリアミドのアルブミンの固定化芳香族ポ
リアミドチューブ（内径１側Ｌ外径２柳）を長さ約５肌
に切断し、水で洗浄した後、ＩＮ塩酸／メタノール溶液
中に３０ｑｏの温度で３０分間浸漁、蝿拝し「部分加水
分解して活性化した。

水で洗浄後、エチルジメチルァミノプロピルカルボジィ
ミド塩酸塩（ＥＤＣ）１０ミリモルを含有する酢酸緩衝
液（５仇ｈＭ、ＰＨ４．８）２物上中に１５分間浸債、
燈拝した後、アルブミンを２重量％濃度で含有する上記
と同じ酢酸緩衝液２５Ｍを添加した。室温で燭拝しなが
ら、０．１Ｎ塩酸又は水酸化ナトリウム水溶液を逐次添
加してｐＨを４．８に調整した後、一夜放置してアルプ
ミンをポリアミドに固定化した。この後、水、２Ｍ塩化
ナトリウム水溶液、皿ｈＭトリスー塩酸緩衝液（ｐＨ９
．４）で順次洗浄した。‘ｂ｝ ポリアミドへのウロキ
ナーゼの固定化上記と同様にして活性化したポリアミド
を１０ミリモルのＥＤＣを含有する酢酸緩衝液（ｐＨ４
．８）２５の‘中に浸債、１５分間鷹梓した後、ウロキ
ナーゼ５０山単位を含む上記と同様のリン酸カリウム緩
衝液２５舷を添加し、‘ａ｝と同機にｐＨを調整した後
、一夜濃伴して、ゥロキナーゼを直接ポリアミド上に固
定化した。

この後、水と２Ｍ塩化ナトリウム水溶液により洗浄した
。‘ｃー アルブミン固定化ポリアミドへのウロキナー
ゼの固定化｛ａ）で得たアルブミン固定化ポリアミド上
に｛ｂ｝と全く同様にしてウロキナーゼを固定化した。

（２’固定化タンパク質量の測定 以上のようにして得た各試料を鮒塩酸水溶液に浸潰し、
５ぴ０の温度に２時間加溢して加水分解した。

上燈液中のタンパク質を山ｗひらの方法に従って定量し
た。結果を第１表に示すように、ポリアミドに直接ゥロ
キナーゼを固定化する場合に比べ、アルブミン固定化ポ
リアミドにウロキナーゼを固定化することにより、ウロ
キナーゼの固定化量を著しく多くすることができる。第
１表 ｛３｝ 酵素活性の測定 次に、上で得た固定化ウロキナーゼの活性を合成基質法
により測定した。

合成基質としてＣＩｕｔａｒｙｌ一ＧＩｙｃｙｌ一Ａｒ
ｇｊｎｙｌ−ｍｅ比ｙ−ｃｏ山ｍａｒｙｌ−ａｍｉｄｅ
を用い、これを５仇ｈＭのトリス−塩酸緩衝液（０．１
ＭＮａＣ１、１肌ＭＣａＣ１２「 ＰＨ８．０）に溶解
した（終濃度０．１ｍＭ）。

この溶液２の‘に固定化ゥロキナーゼを浸潰し、３７０
０の温度で３び分間反応させた後、１り重量％酢酸水溶
液３．０の‘を加えて反応を停止させ「蟹光分光光度計
（励起波長３８仇ｍ、反射波長４６仇ｍ）にて遊離した
ＡｍｊＭ−ｍｅｔｈｙｌ−Ｃｏｍｍａｒｉｎ（ＡＭＣ）
の濃度を測定した。

結果を第２表に示すように、ポリアミドに直接に固定化
されたウロキナーゼに比べ、アルブミン固定化ポリアミ
ドに固定化され第２表 たウロキナーゼが、第１表のウロキナーゼ固定化量に対
応して著しく高い活性を示す。

また、固定化ゥロキナーゼを天然基質プラスミノーゲン
に作用させ、活性化されたプラスミン活性を合成基質法
によって測定しても、アルブミン固定化ポリアミド‘こ
固定化されたウロキナーゼが高い活性を示した。

即ち、合成基質ｔｅｎ−ｂｕｔｙｌ−ｏ沙ｃａ‐ｒｂｏ
ｎｙｌ‐ｇｕｔａり１一１＄ｙｌ‐ｌｙｓｙｌ‐ＭＣＡ
Ｏ．２ｈＭを含有する前記と同じトリス−塩酸緩衝液０
．５戒に固定化ウ。キナーゼを含浸した後ｔ プラスミ
ノーゲン溶液０．５の‘を加え、３７０で１時間反応さ
せた。１７重量％酢酸水溶液２．０の‘を添加して反応
を停止させた後、前記と同様にして遊離ＡＭＣ濃度を測
定した。結果を第３表に示す。第３表 実施例 ２ （ポリイミド担体へのウロキナーゼの固定化）○｝固定
化【ａ｝ ポリィミドへのアルブミンの固定化１，２，
３，４一ブタンテトラカルボン酸とジアミンとの共縮合
によって得られたィミドイ〇率ほぼ１００％のポリイミ
ドフィルムの小片を水で洗浄後、Ｎａ２ＨＰ０４−Ｎａ
ＯＨ緩衝液（Ｎａ２ＨＰ０４ ０．１５Ｍ５０の‘、Ｎ
ａＯＨＯ．ＩＭ１５の乙、柑１１．０）に浸潰し、４０
ｑｏで９０分間澱拝して部分加水分解し、活性化した。

このポリアミド担体に実施例１‘ａ｝と同じ方法により
アルブミンを固定化した。｛ｂ｝ ポリイミドへのウロ
キナ−ゼの固定化ポリィミドを上記と同様に活性化した
後、実施例１‘ｂ｝と同様にして直接ウロキナーゼを固
定化した。

｛ｃ｝ アルプミソ固定化ポリィミドへのウロキナーゼ
の固定化｛ａ｝で得たアルブミン固定化ボリィミドに実
施例１‘ｂ｝と同様にしてウロキナーゼを固定化した。

‘２｝ 酵素活性の測定以上のようにして得た固定化ウ
ロキナーゼの活性を実施例１と同じく合成基質を用いて
測定した。

結果を第４表に示すように、本発明の固定化ゥロキナ−
ゼは著しく高い活性を示す。′ 第４表 実施例 ３ （エチレンービニルアルコール共重合体担体へのべパリ
ン、アンチトロンビンｍ及びウロキナーゼの共存固定化
）｛１）固定化 ビニルアルコール含有率７０モル％のエチレン−ピニル
アルコール共重合体（以下、単に共重合体という。

）の多孔質フィルムを約１側幅に細断し、乾燥重量で約
１９を水１００のとに懸濁し、鷹梓下に５〜ＩＯＮ水酸
化ナトリウム溶液を加えてｐＨを１１〜１２に保った。
これに臭化シアン溶液（４〜２４９／８０〜４８０の【
）を添加しながら、５〜１側水酸化ナトリウム溶液を加
えてｐＨを１１〜１２に保ち、ＰＨの低下が認められな
くまで続けた。この間、氷を加えることにより液温を２
０ｏ０前後に保った。反応は８〜１２分間で終了した。
反応終了後、速やかにガラスフィルターで炉過し、冷水
１そで過剰臭化シアンを洗浄除去して活性化共重合体を
得た。次に、この活性化共重合体１夕（表面積約８０の
）を０．１Ｍ炭酸水素ナトリウム溶液５奴とに懸濁させ
、これに、ヘパリン５０雌、アンチトロンビンｍｌｏ雌
及びウロキナーゼ１０雌を０．１Ｍ炭酸水素ナトリウム
溶液１０の‘‘こ溶解した溶液を加え、４℃で一夜燈拝
した。活性化共重合体の余剰活性基をブロックするため
、ＩＭエタノールアミン溶液（冊８．０）１０奴を加え
、４℃で１時間損拝した後、２Ｍ塩化ナトリウム溶液及
び０．１９Ｍ塩化ナトリウム溶液で順次洗浄し、ヘパリ
ンーアンチトロンビンｍおよびウロキナーゼ固定化材料
（以下、１−ＨＥＰ−ＡＴｍ−ＵＫと略称する。）を得
た。この材料には、担体１の当りへパリン０．５メタ、
アンチトロンビンｍｌ．３仏夕およびウロキナーゼ１．
０仏夕が固定化されていた。同様の方法により、活性化
共重合体ｌｃ虎当りへパリン２．０仏夕を固定化させた
へパリン固定化材（以下、１一ＨＥＰと略称する。

）、活性化共重合体１の当りアンチトロンビンｍ２．５
〃夕を固定化させたアンチトロンビンｍ固定化材料（以
下、１−ＡＴｍと略称する。）、活性化共重合体１の当
りゥロキナーゼ２．０仏夕を固定化させたウロキナーゼ
固定化材料（以下、１−ＵＫと略称する。）及び活性化
共重合体１の当りへパリン１．０仏夕とアンチトロンビ
ンｍ２．５仏夕を同時に固定化させたへパリンーアンチ
トロンビンｍ固定化材料（以下、１一ＨＥＰ−ＡＴｍと
略称する。）を得た。別に、活性化共重合体に３．１仏
夕／嫌の割合でアルブミンを固定化し（以下、１−山と
略称する。）、このアルブミン固定化担体を実施例１と
同様に処理してへパリン及びアンチトロンビンｍを固定
化（以下、１−ＡＩ一日ＥＰ−ＡＴｍと略称する。）し
た。この材料には担体１の当りへパリン２．８仏夕及び
アンチトロンビンｍ６．０〃夕が固定化されていた。珍
様にアルブミン固定化担体にその１の当りへパリン２．
４仏タ、アンチトロンビンｍ４．１ムタ及びウロキナー
ゼ２．７山夕を固定化した（以下、【一Ｎ−ＨＥＰ−Ａ
Ｔｍ−ＵＫと略称する。

）。尚、上記の固定化操作において、アンチトロンピン
ｍはへパリンの保護作用下に固定しなければ抗凝固作用
を起こさないのでｔ 革−ＡＴ囚の調製に際してはアン
チトロンビンｍに対して８倍量のアセチル化へパリンを
反応系中に共存せしめることによりアンチトロンビンｍ
の活性を保護しつつ、これのみを活性化共重合体に固定
化した。更に、活性化共重合体を、ヘパリン及びアンチ
トロンビンｍを添加せずに上記と同様に処理し、これを
コントロールとした。■ 抗凝血効果の測定 牛のクェン酸加血数（血液と３．８重量％クエン酸ナト
リウム溶液の容量比９：１混合物を３００仇ｐｍで１５
分間遠沈処理して得られた上燈液）０．２の上をガラス
製小試験管にとり、３７０に加湿した。

これに一定量の固定化材料を加え、直ちに１／４０Ｍ塩
化カルシウム溶液０．物上及び生理的等張食塩水０．５
のＺを添加し、３７℃恒温槽中で静かに糠とうし、血糠
が凝固するまでの時間を測定した。結果を第第５表 ５表に示す。

以上の結果から明らかなように、担体に直接抗凝血物質
や綾熔系賦活化酵素を固定化するよりも、担体にアルブ
ミンを固定化し「 このアルブミン上に固定化すれば多
量に固定化することができ、更に、ヘパリン、アンチト
ロンビンｍ及びウロキナーゼを共存状態で固定化するこ
とにより、抗血栓性が相乗的に高められる。

実施例 ４ （血小板の材料への粘着挙動） 実施例１，２及び３で得たアルブミン固定化材料に実施
例１に記載した方法によりへパリン及びアンチトロンビ
ンｍを固定化した。

各材料におけ第６表るへパリン及びアンチトロンビンｍ
の固定化量を第６表に示す。

抗凝血剤としてクエン酸ナトリウムを用いて成犬上肢静
脈より採取した血液（最終濃度０．３８％）を８庇で６
分間遠心分離し、得られた多血４・板血環を数滴上記各
試料片上に静かに滴下し「室温で３雌ト間放置後「試料
片を生理食塩水中で二，三回上下ごせて、粘着していな
い血小板を除いた。

次に、１％グルタルアルデヒド溶液（０．１Ｍ、ｐＨ７
．４のリン酸緩衝液に溶解）に浸潰し、４０ｑｏの温度
で２時間反応させて、血小板を固定化した。ア第７表ル
コール系で脱水乾燥し、その表面状態を走査型電子顕微
鏡で観察した。

各試料片０．０１６肋２当りの血小板の粘着数を第７表
に示す。この結果から、坦体にアルブミンを固定化する
ことにより、抗血栓性材料への血小板の粘着が著しく抑
えられることが明らかである。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ 材料表面に固定化されたアルブミン上に、（ａ）ヘ
   パリンとアンチトロンビンIII、及び（ｂ）ウロキナー
   ゼ又はストレプトキナーゼが固定化されていることを特
   徴とする抗血栓性材料。