JPS604938B2 - 免疫学的試薬及びその使用方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は一般には免疫沈殿反応の範囲を増強することが
できる免疫学的試薬に関する。

更に詳細には、本発明は種々の免疫学的アッセィ法に利
用することができる免疫学的試薬溶液に関する。本発明
は又免疫学的アッセィ法、特に抗体−抗原錯体を生成す
る抗体と抗原との反応を含むこれら免疫学的アッセィ法
に関し、それの不溶化は本発明試薬のアッセィ法の利用
により実質的に増加される。アツセイにおいて１段階又
はその他の段階で、且つ異なる目的で、できるだけ多く
の抗原−抗体鈴体の不落化を必要とする広汎な方法学の
多数の免疫学的アッセィ法がある。

例えば、鰭体の不溶化は電気泳敷分析、酵素アッセィ、
放射線免疫ァツセィ（ＲＩＡ）及び比濁アツセィの如き
例証的重要な従来の免疫学的アツセィ技術において重要
な役割を演じ、且つ多くの研究がこれらのアッセィを改
善するため錯体の不溶化を増大させる開発方法に向けら
れた。普通、鈴体の不溶化は、単離された反応生成物か
未反応の反応体を意味深長な診断学的アッセィを提供す
るため別々に分析できるよう特定アッセィに含まれる未
反応の免疫学的反応体から免疫学的反応生成物を単離す
るために必要である。例えば、比濁分析を含む免疫学的
方法に対して、試料の温層及び比滋計器の読みを取る前
に試料をポリエチレングリコール重合体溶液で希釈する
ことが既に知られている。

ポリエチレングリコールは懸濁粒子の濃度を増加させる
ことにより比濁分析を改善し、このようにして分析を改
善するが、試料中の懸濁粒子の不満足な濃度による不適
当な試験範囲又は感度の故に多くの生物学的成分の満足
な分析を行なうことができないという問題が残る。本発
明の広い目的は、ポリエチレングリコール単独から得ら
れるものを越えて抗体−抗原簿体の不溶化を著しく増加
せしめ、次いで比濁定量法か他の定量法が使用されるに
せよ「 ポリエチレングリコール単独では可能でない生
学的成分の分析を許すため試料中の懸濁粒子の濃度を増
加せしめるのに有効な改善された免疫学的試薬を提供す
ることにより前述の問題を解決するにある。更に詳細に
は、本発明は、少なくともポリエチレングリコール溶液
より成る免疫学的試薬において、該試薬がポリエチレン
グリコールとこれ以外の非イオン表面活性剤の混合物の
水溶液より成り、前記水溶液が使用中、約３〜６重量％
の該混合物を含有し且つかかる範囲内で約０．７〜１．
７の範囲の計算ＨＬＢ価（親水性−親油性バランス価）
を有して成ることを特徴とする。

重要なことは、例えば免疫学的アッセィ法で「使用中」
でない場合、水溶液は３％以下及び６％以上の混合物濃
度を有することができるが、それにも係らず使用前又は
「使用中」に約３〜６％の範囲内の濃度を有するように
調整された混合物の濃度を与えることは本発明の目的に
有用である。それ故に、追加の特許請求の範囲で使用し
た「使用中」の用語により、濃度範囲が３〜６％の規定
範囲外の場合、アッセィ手順間又はそれ以前にこれらの
限界に調整される限り、その混合物濃度は最初に必ずし
も約３〜６％の範囲内にあることを要しない試薬をも包
含することは本発明者等の主張である。本発明者等は又
抗体−抗原鍔体を生成させるたＺめの抗体と抗原との間
の反応を含む免疫学的アッセィ法を提供するものであり
、該方法は前記反応により生成される抗原−抗体錆体の
不溶化の範囲を実質的に増加させる本発明試薬をその中
で利用することを特徴とする。

都合良くは、試薬を比濁、酵素、霧気泳敷又は放射線免
疫アッセィを遂行するための試験媒質内に導入する。

例えば、比濁アッセィ法が抗体−抗原錯体の形態での生
物学的成分を分析するために導入される場合、試薬及び
生物学的成分の懸濁粒子は最初温直されその後比濁分析
が遂行される。

この方法によれば、光源は液体試料を通過するように成
されかくして光線は懸濁粒子を通じて導かれる。これら
光線は粒子を打つ場合、それら粒子は光源から例えば直
角の如き所定角度で散乱又は拡散され次いで光電池によ
り受け止められる。この散乱光は粒子濃度の量に直接に
比例し、順次そのようにして計器面上で正確に測定され
る電気信号に転換される。比濁分析に適当な計器の例は
／・ィランド・し−ザ−・ネフェロメータ−ＰＤＱＴＭ
（ＨｙｌａｎｄいｓｅｒＮｅｐｈｅｌｏｍｅｔｅｒ
ＰＤＱＴＭ Ｈｙｌａｎｄいｂｏｒａｔ
ｏｒｉｅｓ）；アミンコーフルオロコロリメータ−（Ａ
ｍｉｎｃｏ一ＦＩ側ｍｃｏｌｏｒｉｍｅにｒ、Ａｍｅｒ
ｉｃａｎｌｎｓｔｍｍｅｎｔＣｏｍｐａｎｙ）；アミン
コーボウマン・スベクトロホトフルオロメーター（ＳＰ
Ｆ）（Ａｍｉｎｃｏ−ＢｏｗｍａｎＳｐｅｃｔｒｏｐｈ
ｏｔｏ−ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｅｒ（ＳＰＦ））及び付属
のフルオロネフェロメーターを有するオート・アナラィ
ザーロ（ＡｕｔｏＡＭ１ｙｚｅｒロ、Ｔｅｃｈｎｉｃｏ
ｒｌｎｓｔｒ山ｍｅｎｔｓＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）で
ある。

これらの比濁原理及び装置により、臨床技術士は、例え
ば免疫グロブリン１ｇＧ、１ｇＡ、１ｇＭ、トランスフ
ェリン、補体Ｃ３、ハプトグロビン、Ｑ，一抗トリプシ
ン、８−リポたん白質、アルプミン、Ｑ２ −マクログ
ロブリン、Ｑ，一酸糖たん白質及び例えばトリグリセリ
ド、リポたん白質、及び例えばトリグリセリド、リポた
ん白質及び繊毛ゴナドトロピンの如き種々のその他の生
物学的成分の如き、低濃度の広汎な種類の特殊たん白質
の正確な定量を行なうことができる。

本発明による試薬の使用かち得られる最も重要な利点は
｛ａ｝温層時間が著しく短縮され、且つ｛ｂ｝大なる濃
度の不溶化鈴体粒子が結果として生じる改善された試験
領域及び感度と共に短時間の温暦時間で得られることで
ある。

これらの利点をアッセィ間の或る時点での抗原−抗体鍔
体の増進された不落化により利益を受ける任意免疫学的
アツセイ法に適用する。又利点をアッセィ手順間の或る
時点で抗原−抗体鈴体の不溶イリ段階に依存する免疫学
的アッセイ法に適用する。先に注目した如く、試薬の水
溶液は使用中、ポリエチレングリコールと非イオン表面
活性剤の混合物を約３〜６重量％含有するのに加えて、
又約０．７〜１．７の範囲の計算されたＨＬＢ価を有す
べきである。

ＨＬＢ価は所定の表面活性剤の親水性−親油性バランス
（従って「ＨＬＢ」）の良く確立された尺度である。

表面活性剤同定のＨＬＢ系はアトラス・ケミカル社（Ａ
ｔｌａｓＣｈｅｍｉｃａｌｌｎｄ瓜ｔｒｉｅｓ、Ｉｎｃ
．）により開発され、且つ化粧品及び製薬学的製品にお
けるアトラス表面活性剤及びソルビトールの使用に対す
る手引き（ＧｕｉｄｅｔｏｔｈｅＵｓｅｏｆＡｔｌａｓ
ＳｕＭａｃｔａｎｔｓ ａｎｄ Ｓｏｒｂｉｔｏｌ
ｉｎ Ｃｏｓｍｅｔｉｃａ池Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃ
ａＩＰｒｏｄ此ｔｓ（１９６５））と題するアトラス刊
行物の２８〜３６頁に詳細に記載され、前記刊行物はこ
れを参照してここに組み込ょまれている。夫々の界面活
性剤はＨＬＢ数を指定されている。ＨＬＢ数が低いほど
該表面活性剤はより親油性であり、他方該数が高いほど
該表面活性剤は親水性である。任意所定の表面活性剤の
ＨＬＢ価を確立する方法は良く知られており、且０つ例
えばアトラスＨＬＢ系「Ｔｈｅ Ａｔｌａｓ ＨＬＢＳ
＄ｔｅｍ（ＣｏｄｅＬＤ−９７）」と題する被澄された
アトラス社刊行物に記載されている。多数の表面活性剤
のＨＬＢ価は又、文献、特に問題の表面活性剤の製造に
より発行された文献に広く被澄されている。例えば本発
明の試薬に存在する如き、表面活性剤配合物のＨＬＢ価
は、配合物中における夫々の表面活性剤の濃度の関数で
あり、従って個々の表面活性剤の濃度を該配合物のＨＬ
Ｂ価を計算するのに考慮しなければならない。

配合物のＨＬＢ価は、公認された方法に従って、該配合
物中に存在する夫々の表面活性剤の指定されたＨＬＢ価
を問題の組成物中におけるそれの濃度で乗ずることによ
り計算される。例えば本発明の試薬が１重量％のポリエ
チレングリコール（ＨＬＢ−２０）及び３０．５のＨＬ
Ｂを有する３重量％の非イオン表面活性剤を含有する場
合、試薬のＨＬＢ価は下記の如く計算される：０．０１
×２０ −０．２ ０．０３×３０．５＝０．９１５ 計 １．１１５・・・試薬のＨＬＢ価 所定の試薬が本発明試薬の０．７〜１．７の範囲内に入
るＨＬＢ価を有するかどうかを決めるためには、配合物
中の夫々の成分の量に基づいて、問題の成分の発表され
たＨＬＢ価を使用するかアトラス法により決定されたＨ
ＬＢ価を使用して、前述した如き計算を容易に行なうこ
とができる。

本発明は‘１｝非イオン表面活性剤とポリエチレングリ
コールの混合物が該試薬がアッセィに使用される時に３
〜６重量％の範囲内となり、且つ■試薬の計算ＨＬＢ価
が同時に０．７〜１．７の範囲内となる場合、広汎な種
類の非イオン表面活性剤のポリエチレングリコールと関
連した使用を意図するものである。使用時に、ポリエチ
レングリコールー非イオン表面活性剤混合物が試薬の３
％より小の濃度、又は試薬が約０．７より４・のＨＬＢ
価を有する場合、免疫学的アッセイを成功させるに必要
な望ましい量の抗原−抗体錆体を不溶化することが難し
くなる。又、混合物が試薬の６％より大の濃度、又は試
薬が１．７より大のＨＬＢ価を有する場合、望ましい抗
原−抗体鈴体以外の他の蛋白質が不溶化され、これによ
ってアッセィの選択性を損ない、その結果を無意味なも
のとする。勿論、種々の理由で、試薬溶液をそれが必須
の３〜６％のポリエチレングリコールと非イオン表面活
性剤の混合物を含有せず、又は必須の０．７〜１．７の
ＨＬＢ価を有しないようなふうに調整し且つ市販するこ
とができる。

貧弱な貯蔵性が一つのかかる理由であることができる。
しかし乍ら、先に注目した如く、かかる溶液は、免疫学
的アッセィ技術におけるそれらの使用中のある時点で、
又はそれ以前に、３〜６％の範囲且つ約０．７〜１．７
の ．ＨＬＢ価に調整を要する。この理由で、必須の３
〜６％の前記混合物又は約０．７〜１．７のＨＬＢ価を
含有しないが、免疫学的試験手順間に又はそれ以前にこ
れらの値に容易に調整することができる試薬は、それら
試薬がアッセィ手順それ自体間に要求される濃度及びＨ
ＬＢ範囲の特定パラメータ以外に最初あっても、本発明
の範囲内である。例えば、市販の試薬溶液は、濃度及び
ＨＬＢ価の特定パラメータが約３〜６％及び０．７〜１
．７の計算されたＨＬＢ価まで溶液をもたらす目的で、
免疫学的アッセィ法の遂行前に夫々希釈、濃縮、又はそ
の他の調整段階を必要とする。

かかる環境でも、市販された溶液は、なお本発明の範囲
内となる。このようにして、試薬を例えば８％の如き、
６％より高い混合物濃度で市販することができ、それは
免疫学的アッセィ手順間の或る適当な時点かそれ以前か
に３〜６％の範囲に希釈される。同様に０．７〜１．７
の範囲以外の計算ＨＬＢ価を有すが、試薬溶液を０．７
〜１．７の計算ＸＬＢ範囲にもたらすため免疫学的ァッ
セィ手順間の或る適当な時点で、又はそれ以前に試薬溶
液がどうかにかして変化させられる必要条件を有する試
薬を市販することができる。若干の場合において試薬は
試験に使用される抗血清と一緒に適当なしベルまで希釈
され、‐−方他の場合にはそれを試料で又或る場合には
試料及び抗血清の両者で希釈することができる。

重要な点は免疫学的アツセィ手順間の或る時点で、普遍
抗原−抗体反応と同時かそれ以前に、３〜６％の組み合
わせたポリエチレングリコールと非イオン表面活性剤の
必須レベル、及び０．７〜１．７の必須ＨＬＢ価を、ア
ッセィ手順中適当に作用させるため本発明試薬に与えね
ばならぬということである。これらの必須のパラメータ
を与えねばならないアッセィ手順中の時点は含まれる特
定手順により変化させることができる。例えば比濁分析
に対して、６％を越えるポリエチレングリコールと非イ
オン表面活性剤の濃度及び０．７〜１．７の範囲以外の
ＨＬＢ価で本発明の試薬を調整し且つ市販することが便
利である。次いで、比濁分析で使用の直前に「試薬を３
〜６％、好ましくは約４％のポリエチレングリコール及
び非イオン表面活性剤の濃度、及び０．７〜１．７の範
囲の計算ＨＬＢ価を与えるため分析で使用する抗血清で
希釈する。混合物中におけるポリエチレングリコール及
び非イオン表面活性剤の相対的割合は使用される表面活
性剤に大きく依存し、広汎な限界内で変化させることが
できる。

例示すれば、混合物は約１０〜９の重量％のポリエチレ
ングリコール及び１０〜９の重量％の非イオン表面活性
剤を含有する。好ましくは、混合物は約１５〜８５％の
ポリエチレングリコール及び１５〜８５％の非イオン表
面活性剤を含有する。混合物のポリエチレングリコール
成分として１種又はそれ以上の異なった形態又は種類の
ポリエチレングリコールを使用することができる。

一般に、使用されるポリエチレングリコール重合体は、
約２００〜１００００、好ましくは約４０００〜６００
０の分子量を有する。これらの材料は、例えばュニオ＊
ン・カーバイト（ＵｎｉｏｎＣａｒｂｉｄｅ）社からカ
ーボワツクス（ＣＡＲＢＯＷＡＸ）４０００又は６００
０として、ダウ・ケミカル社（Ｄｏｗ Ｃｈｅｍｉｃａ
ｌＣｏｍｐａｎｙ）からＰＥＧ４０００又は６０００と
して入手することができる。約４０００の分子量の範囲
が特に好ましい。混合物の非イオン表面活性剤成分は、
３〜６％の混合物濃度で０．７〜１．７、且つ好ましく
は約０．７〜１．３の計算ＨＬＢ価を試薬溶液中で生ず
る任意の非イオン表面活性剤であることができる。

解説すれば、非イオン表面活性剤それ自体のＨＬＢ価は
約１０〜３０以上の範囲であることができる。好適な非
イオン表面活性剤は酸化エチレンとポリオキシプロピレ
ンのブロック共重合体である。この格別な重合体及びそ
の調整については米国特許第２６７４６１ｙ号‘こ記載
されている。これらのブロ、ック共重合体は酸化エチレ
ンをポリオキシプロピレン重合体と縮合させることによ
り一般に調製され且つ下記の構造式で表わすことができ
る。日○（ＣＨ２Ｃ比○）ａ（Ｃ鶴ＣＨＣＨ２０）ｂ（
ＣＨ２Ｃ＆○）ｃＨ本発明の目的に対して、これらのブ
ロック共重合体は、同機に米国特許第３４５０５０２号
、第３５７７５２２号及び第３５９０１２５号に記載さ
れる如く、分子中に少なくとも５０％の酸化エチレン及
び少なくとも９５０のポリオキシプロピレン疎水基分子
量を含有するのが望ましい。かかる適当なブロック共重
合体を例示すると、ワィアンドット・ケミカル社（Ｗ鼠
ｎｄｏｔｔｅＣｈｅｍｉｃａＩＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ
）から市販されているＦ−３８及びＦ−６８プルロニツ
ク■ポリオールがある。

Ｆ−滋は分子中に８０％のポリオキシェチレン親水ユニ
ットを含有し、且つポリオキシブロピレン疎水基は９５
０の分子量を有する。Ｆ−３８は好適な非イオン表面活
性剤である。又Ｆ−６８は分子中に８０％のポリエチレ
ン親水ユニットを含有するが疎水基は１７５０の分子量
を有する。これら２種のプルロニツク■ポリオールの全
分子量は夫々４７５０及び８７５０である。又プルロニ
ック■Ｌ−１２５は有用なことが見出されている。これ
らポリオールのそれ以上の記載はワィアンドット・ケミ
カル社の報文「ｍｅＰ１ｍｏｎｉｃＧｒｉｄ、第６版」
に見出され、該物質はそれを参考にして明細書に組み込
まれている。プルロニック非イオン表面活性剤の場合、
約２０〜４の重量％のポリエチレングリコール及び約８
０〜６の重量％の酸化エチレンとポリオキシプロピレン
重合体をブロック共重合体より成る混合物が一般に好ま
しい。

極めて好適な試薬溶液は約４０００の分子量を有するポ
リエチレングリコールの約１重量部及びプルロニツクＦ
−３幻材料の約３重量部を含有する。

この溶液は３〜６％の望ましいレベルの上か下かの食塩
水溶媒（例えば０．９％ＮａＣＩ）中で調整することが
でき次いで、必要に応じて３〜６％の望ましいレベルに
調製される。溶液を食塩水中重合体温合物の８％溶液と
して調製し、次いでそれを免疫学的アッセィ手順で使用
する以前に抗血清（実施例１及び５参照）又は他の適当
な希釈剤で希釈する。このようにして希釈した試薬は約
１％のポリエチレングリコール及び３％のＦ一３８を含
有する。その１．１１５のＨＬＢ価を下記の如くして計
算することができる：１多 ＰＥＧ：０．０１×２○＊
＝○．２３％ Ｆ−３８：〇．〇３×３０．５＊＊＝
〇．９１５計１‐１１５＊ 文献からＰＥＧのＨＬＢは
２０である＊＊ 文献からＦ−３８のＨＬＢは３０．５
である広汎な種類のその他の非イオン表面活性剤を、そ
れら表面活性剤が３〜６％の混合物濃度で０．７〜１．
７の望ましいＨＬＢ価を与える場合、又本発明の試薬溶
液中のポリエチレングリコールを補うため使用すること
ができる。

例えば、ＢＡＳＦワィアンドット社（ＢＡＳＦ Ｗ渡ｎ
ｄｏｔｔｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）＊から入手する
ことができ、且つ「‘‘ＴｅｃｈｎｉｃａｌＤａｔａ
ｏｎ ＴｅｔｒｏｎｉＣ ■ Ｓｅｒｉｅｓ Ｎｏ
ｎｉｏｎｉｃＳｍねｃｔａｎＧ”、ＢＡＳＦ Ｗ鱗ｎｄ
ｏｔｔｅＢｒｏｃｈｕｒｅ」及び米国特許第２９７９５
２８号（前記刊行物及び特許の記載を明細書中に引用）
に記載されたテトロニツク■（Ｔｅｔｍｎｉｃ■）系列
の非イオン表面活性剤、特にテトロニツク■７０７、９
０＆１１０７、１３０７及び１５０８として分類された
これらのものは、全く適当なことが見出されている。テ
トロニツク■製品はエチレンジアミンを基体とじ且つ下
記の一般式を有する：テトロニツク■系列の分子量は約
１６５０〜２６０００以上に変化することができる。

一層好ましいテトロニック■表面活性剤は約１５０００
〜２７０００の範囲の分子量及び約２０〜３０．５のＨ
ＬＢ価を有する。混合物中のポリエチレングリコールの
テトロニック■表面活性剤に対する割合は、前述した如
く広汎に変化することができる。有用なその他の非イオ
ン系はまたＢＡＳＦーワィアンドットにより発表された
プルラフアツク■（ｐＬＵＲＡＦＡＣ■）系列の製品、
特にプルラフアツク■１７Ｒ８ ２球＆Ｄ２５ Ａ３８
およびＡ３９として識別されているこれらのものである
。

プルラフアック■製品は、「″ＴｅｃｈｎｉｃａｌＤａ
ｔａｏｎＴｙｐｉｃａｌＰｈｙｓｉｃａｌ Ｐｒｏｐｅ
ｒｔｉｅｓ ｏｆ ＰＬＵＲＡＦＡＣ ■Ｎｏｎｉｏｎ
ｉｃ Ｓｕがａｃｔａｎｓ″ 、 ＢＡＳＦ Ｗｙ
ａｎｄｏｔｔｅｂｒｏｃｈｕｒｅ」に詳細に記載されて
いる直鎖、第一脂肪族オキシアルキル化アルコールであ
る。好ましいプルラファック■製品は約１０〜２０のＨ
ＬＢ価を有しかつポリエチレングリコールに対し広く変
化する比率で使用することができる。他他の適当な非イ
オン表面活性剤には、グリセリンモノステァレート及び
アルキルアリールスルホン酸塩の系を包含する。好まし
いグリセリンモノステアレートは商標アーラセルｌ■１
６５（ＡＲＬＡＣＥＬ■１６５）（ＨＬＢ：１１．０）
としてアトラス社（ＡｔｌａｓＩｎｄｕｓｔｒｉｅｓ、
Ｉｎｃ．）から入手することができ、一方典型的有用な
アルキルアリールスルホン酸塩は又同社から商標Ｇ−３
３００（ＨＬＢ＝１１．７）として入手することができ
る。非イオン表面活性剤についての前述の記載は単なる
例記である。

この理由は免疫学的アッセィ手順で使用された場合約３
〜６％のポリエチレングリコールと表面活性剤の混合物
を含有する試薬が約０．７〜１．７の溶液中に存在する
個々の成分の値にもとず〈計算ＨＬＢ価を有し、かつ望
まない成分を不溶化することなく又は任意にその他の方
法でアッセィ手順に致命的に干渉することなく、該アッ
セィを改善するために望まれる程度に所望の抗原−抗体
錯体の不溶化を増進させる効果を生ずる試薬を与える場
合本発明の範囲内に入るからである。勿論、必須の混合
物の濃度及び溶液のＨＬＢ価が蓬せられた場合、１種以
上の表面活性剤がポリエチレングリコールと共に存在す
ることができる。

本発明で使用する非イオン表面活性剤を選択するには、
又、少なくとも試薬溶液が免疫学的アッセィ手順で最初
使用される時に透明な溶液を与え得るものを使用しなけ
ればならない。

これは試薬が試験結果を妨げず、又は生物学的試料成分
又はアッセィ系で使用される生物学的試薬の不特定沈殿
を生じないことを確実にする。本発明の試薬系は、或る
時又はその他の時に、理由はなんであれ、抗原−抗体反
応によりアッセィ手順間に生成される抗原−抗体鍔体を
不溶化する段階を必要とする多数の従来の免疫学的アッ
セィ法における改善として広汎な実用を見出す。

かかるアツセィ法は当業者に熟知されており、ここで詳
細に記載することを要しない。これら種々のアッセィ法
における本発明の適応性及び有効性、及び本発明試薬を
かかる手順で如何に使用するかの詳細はこの明細書の記
載より当業者に明らかとなり且つこのようにしてこれら
特性をここで過剰に繰り返し提供しない。例えば、本発
明試薬を、蟹光又は比色検出用の透明上燈液を生ぜしめ
るため抗原−抗体鍔体の沈殿に依存する任意系を増進さ
せるのに使用することができる。試薬を又、比濁、酵素
又はその他のアッセィ系用の生物学的流体又は試薬（例
えば、脂質、塩、及び無関係のたんぱく質）に見出され
る妨害物質を除去するために使用することができる。こ
れは、これらの反応体を洗浄し且つ再懸濁させる目的で
反応溶液からの反応体の除去により蓬せられる。特に、
本発明試薬は不溶性抗原−抗体錆体の相対的濃度を増加
し且つ所定のアッセィ系の試験範囲及び感度を増加させ
るために利用することができる。

これらの原理を比濁法による免疫鍔体からの定量的光散
乱に適用することができ、現在これは本発明の好適例で
ある。本発明試薬を使用する比鰯分析は種々の免疫グロ
プリンの分析で特に有用である。しかし乍ら、例えば放
射線免疫拡散（ＲＩＤ）、酵素分析、及び例えば免疫電
気泳動（ＩＥＰ）、逆電気泳動（ＣＥＰ）、及び電気免
疫拡散（ＥＩＤ）の種々の型式の露気泳動技術の如き、
沈殿抗体に基づくその他の試験系でこれらの試薬を利用
することができる。本発明の試薬を、例えば放射線免疫
アッセィ（ＲＩＡ）に普通使用される抗原一抗体共沈の
主要相互反応に依存する免疫学的アッセィを増進させる
のに使用することができる。

本発明のこの増進させた不溶化特性を、当業者により良
く理解されている方法におけるＲＩＡ、比濁、及び蟹光
アッセィの担体として使用「される不活性粒子に抗体又
は抗原を付着させる種々の方法学に又利用することがで
きる。種々の放射線免疫アッセィ技術は体液中に見出さ
れる比較的小さい濃度の生物学的成分を定量するために
採用されている。

ラベルト免疫抗原−抗体鰭体を製造するために、同位体
ラベルド抗原又は抗体を対応する抗原又は抗血清と反応
させる。次いで普通には、これらの鍔体を不溶性担体、
沈殿試薬又はその他の既に知られた技術により不溶性に
しなければならない。遊離又は不反応のラベルド抗原又
は抗体は洗浄技術により除去することができる。次いで
沈殿鰭体の放射性濃度をガンマ法又は液体シンチレーシ
ョン計数により定量する。この型式の分析に対して使用
される計器の例はオート・ガンマ・カウンター（Ａｕｔ
ｏＧａｍｍａＣｏ肌ｔｅｒ、Ｎ肌ｌｅａｒＣｈｉｃａｇ
ｏ、Ｉｎｃ．）である。本発明の試薬は必須、錯体の不
溶イリ段階を増進させるのに有用であり、このようにし
て分析を改善する。実施例７で放射線免疫アッセィ手順
における本発明試薬の使用を詳述する。酵素技術は又、
体液中に見出される小濃度の生物学的成分を定量するた
めに採用される。

酵素ラベルド抗原又は抗体を免疫ラベルド抗原−抗体鍔
体を生ぜしめるため特殊な抗体又は抗原と反応させる。
これらの鍔体は不溶性担体、沈殿試薬又はその他の技術
により不溶性にされる。遊離又は不反応の酵素ラベルド
抗体又は抗原は洗浄技術により除去される。結合又は反
応した酵素は分光光度計又は姿光光度計で測定すること
ができる着色又は蟹光性上燈液を生ぜしめるため適当な
基体と反応を生ずることができる。この目的で有用な計
器の例はべックマンＤＢスベクトロホトメータ‐（茂ｃ
ｋｍａｎ ＤＢ Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ
、ＢｅｃｋｍａｎｌｎｓｔｍｍｅｎｔＣｏｍｐａｎｙ）
及びアミンコーバウマンスベクトロホトフルオ０メータ
ー（Ａｍｉｎｃｏ一ＢｂＷｍａｎ Ｓｐｅｃｈｏｐｈｏ
のｆｌｕｏｒｏｍｅｔｅｒ、Ａｎｅｒｉｃａｎｌｎｓｔ
ｍｍｅｎｔＣｏｍｐａｎｙ）である。本発明の試薬は又
必須の鈴体不溶イり段階を増進させるために有用であり
、かくして分析を改善する。比濁分析における試薬の有
用さは前述の如く詳細に検討されており、且つ実施例５
で更に例示されている。

今や当業者に取り、本発明の改善された免疫学的試薬が
免疫学的アッセィ手順の分野で応汎な有用性を有するこ
とが明らかである。

改善された試薬を使用し、臨床技術士は、例えば免疫グ
ロプリン１ｇＧ、１ｇＡ、１ｇＭ、トランスフェリン、
補体Ｃ３、パプトグロビン、Ｑ，一抗トリプシン、８−
リポたんぱく質、アルブミン、Ｑ２−マクログロブリン
、Ｑ，一酸糖たんぱく質、及び例えばトリヨードチオニ
ン（Ｔ３）、チロキシン（Ｔ４）、トリグリセリド、繊
毛ゴナドトロピンリポたんぱく質の如きその他の種々の
生物学的成分、及びその定量が本発明により生ずる増進
された不落化効果から得をするその他の多くの成分の如
き、広範囲の濃度の多くの特殊たんぱく質の正確な定量
を行なうことができる。本発明で有用性を見出すたいて
いの適用において、望まれる生物学的試験成分又は成分
は本発明の水性試薬溶液に添加され、例えば室温（２０
〜２５℃）で約１時間の如く、所定時間温暦され、次い
で例えば比濁分析の場合比濁計の如き、適当な計装化上
で読む。

試料の結果を未知の濃度を定量するため対照試料と比較
する。次に本発明の実施例につき説明する。

実施例 １ ４０００の分子量を有するポリエチレングリコール２５
重量部をプルロニックＦ−３８７５重量部に添加して試
薬溶液を調製し、次いで混合物を普通の塩水（０．９％
ＮａＣＩ）に前記混合物の８重量％まで溶解した。

この溶液は、例えば抗血清で実施例５の段階３における
如く４％の混合物濃度（ＨＬＢ比一１．１１５）に希釈
し、免疫学的アツセイ手順に直接に使用するか、それを
使用直前まで８％の形態で保持することができた。実施
例 ２ 分子量６０００のポリエチレングリコールを分子量４０
００の材料の当量と置換したことを除いて、実施例１に
繰り返した。

実施例 ３ プルロニックＦ−６８で当量のＦ−斑を置換したことを
除き実施例１を繰り返した。

実施例 ４ 広汎な種類の試薬溶液を調整するため一連の実験におい
て異なる量でＦ−３８を、テトロニック７０７、９０＆
１１０７、１３０７、１５０８；プルラフアツク１７
Ｒ＆ ２球＆ Ｄ２ふ Ａ聡およびＡ３９：プルロニツ
４クＬ１２５、アーラセル１６５；およびＧ−３００
０で置換したことを除き、実施例１を繰り返した。

実施例 ５ 実施例１〜４で調製した免疫学的試薬を免疫グロプリン
（１ｇＡ、１ｇＧ、１尊Ｍ）、補体Ｃ３およびトランス
フェリンの別々の比濁アッセィに使用し、各アッセィを
以下の如く行なった：１ それぞれの前記生物学成分用
対照標準（既に知られたアッセイの）を塩水中１：１０
０に希釈した。

２ 未知のものを次いで同様に塩水中１：１００に希釈
した。

３ １ｇＧ、１ｇＭ、１ｇＡ、Ｃ３およびトランスフヱ
リンに対する予め希釈した抗血清を実施例１、２、３ま
たは４からの８％の免疫学的試薬でそれぞれ１：２に希
釈し（場合により）かつ溶液中ポリエチレングリコール
と非イオン表面活性剤の４％濃度およびすべての場合に
０．７〜１．７間の計算ＨＬＢを生ぜしめるために転倒
により混合した。

４ ０．４５ｒミリポアフイルタ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ
ｆｉＭｒ）を通じて櫨過した。

５ 適当に標識付けたブランク、対照標準＃１、＃２、
＃３、＃４、＃５、＃６および未知のものの一連の試験
管（ＩＱ舷×７５側処分可能な培養管）を調整した。

６ 各試験管に、段階３で調製した抗血清と試薬の希釈
混合物１の‘を添加した。

７ １ｇＧ、１ｇＡおよびトランスフェリン用の適当な
管に２５ｒその対照および未知の希釈剤を添加した（１
ｇＭおよびＣ３に対して１００一そ）。

８ 適当なブランク管に相当して２５または１００Ａそ
の塩水を収容した。

９ 試験管を転倒により混合し次いで室温（２０〜２５
ｑ０）で１時間温遣した。

１０ 試料ブランクを、（場合により）８％の溶液を抗
血清の代りに塩水で希釈したことを除いて段階３におけ
る如くして調整した、実施例１〜４からの渡過試薬１の
‘を使用することにより調整した。

ブランクを前の段階（５および６）における如く同一の
標識付けした管に入れた。１１ 同一の対照および試料
容積を前（段階７）の如くそれぞれの管に添加した。

１２ すべての管をレーザー・ネフェロメーター・ＰＤ
ＱＴＭ（ Ｌａｓｅｒ Ｎｅｐｈｅｌｏｍｅｔｅｒ Ｐ
ＤＱＴＭ 、ＨｙｌａｎｄＬａ戊ｒａｔｏｒｉｅｓ）で
光散乱相対％を読んだ。

１３ ブランクを読み次いで計器により反応値から電子
的に減じた。

１４ 対照結果を光散乱相対％対対照濃度として線形グ
ラフ紙上に画いた。

１５ 未知の値を対照曲線から読むことにより決定した
。

当実施例で使用した本発明の免疫学的試薬は、ポリエチ
レングリコールのみを含有する試薬より実質的に大なる
抗原−抗体鍵体、広範囲にわたるいっそうの直線性およ
び大なる感度を示した。

実施例 ６この実施例では、前記実施例５において得ら
れた試薬が広範囲にわたる直線性および大なる感度を示
すことを、さらに支持するための実験を行つ。

ポリエチレングリコール単独、非イオン表面活性剤単独
、およびポリエチレングリコールと非イオン表面活性剤
の組合せで、塩水溶液に溶解した溶液を調製した。

次いで各溶液について次に示す試験をした。‘ａ’ 試
験する抗原に対し最適濃度の特定抗体を含有する抗血清
につき１対１の容量に溶液を希釈した。

その結果、本発明のポリエチレングリコールと非イオン
表面活性剤の混合物の場合、約３〜６重量％の混合物を
含有し０．７〜１．７のＨＬＢ価を有する溶液となり、
ポリエチレングリコール単独または非イオン表面活性剤
単独の場合に＊は、合計した場合に本発明のポリエチレ
ングリコールと非イオン表面活性剤の混合物中の重合体
の全量に等しい十分な重合体を含有する溶液となる。｛
け 既知レベルの所定の抗原を含有する溶液２５山夕を
先の溶液Ｗ１羽と混合した。

これを既知の抗原レベルを変化させた数種の抗原溶液に
対してくり返した。抗原を加えない以外は同じ方法でブ
ランクを調整した。‘ｃ’次に、得られた溶液‘ｂ｝と
ブランクを、前述のレーザー・ネフェロメーターＰＤＱ
ＴＭに置き、十分間室温で温遣した。

‘ｄ｝ ブランクと溶液の光散乱％を測定し記録した。

謙取つた値はブランクに対して自動的に補正した。各試
料に対して１回以上光散乱％を読取った場合は平均した
。その結果、種々の非イオン表面活性剤の数値が求めら
れた。

実験結果を第１〜５表および第１〜５図に示す。各デー
タ一はネフェロメータ−によって観察された光散乱の範
囲によって測定した抗原−抗体鍔体の不溶イ鶴範囲を示
す。第１表には、本発明のポリエチレングリコールを１
重量％およびプルロニツクＦ−３８を３重量％含有し、
全重合体含量が４重量％である溶液について示した。

．第 １ 表 まず、広範囲の１や濃度にっし、て１重量％のポリエチ
レングリコール（ＰＥＧ）単独により生成した抗原−抗
体銭体の不溶化範囲を測定した｛１’。

次いで、同じ範囲の１ｇＧ濃度について３重量％のプル
ロニツクＦ−滋単独によって生成した抗原一抗体鍔体の
不溶化範囲を測定した■。次いで、これら２種の重合体
、１重量％のポリエチレングリコールおよび３重量％の
プルロニックＦ−３８を合わせて４重量％の混合物とす
るために、‘１１と｛２）の測定値を加算した｛３’。
次に、本発明の１重量％のポリエチレングリコールおよ
び３重量％のプルロニックＦ−３８の混合物によって生
成した抗原−抗体鈴体の不溶化範囲を実際に測定した‘
４’。

そこで、計算側３’と実測値【４｝を比較すると、実測
値‘４１の方が直線的に大きく増加している。当業者が
認めるように分析する抗原または免疫種の光散乱％と濃
度の関係が直線的であることは意義がある。

直線の範囲が大きい程、アッセイの検出範囲は広くなる
。従って免疫反応の間に本発明の１重量％のポリエチレ
ングリコールと３重量％のプルロニックＦ−総量合体混
合物が存在すると、アッセィの免疫検出範囲は大幅に改
良される。特に、ポリエチレングリコール単独【１）お
よびプルロニックＦ−斑単独■の場合１ｇＧ３７．５の
９／ｄ‘でも検出値が小さいが、本発明の混合物■では
１ｇＧＩＯ雌′ｄ‘で検出できるので、１やの量が少な
くてすむ。またネフェロメーターの平均光散乱％を大き
い値で競取ることができるので、アッセイの感度と再生
を改善できる利点がある。同様に、ポリエチレングリコ
ールと他の重合体との組合せを変えて、第２〜５表およ
び第２〜５図に示した。

第２表 第３表 第４表 第５表 第２〜５表においても、第１表と同様に計算値‘３’よ
りも測定値【４｝の方が直線的な結果が得られた。

特に１ｇＧが６００〜１２００の９／ののアツセィ範囲
で顕著である。実施例 ７ この実施例では人の甲状腺刺戟ホルモン （ＨＴＳＨ）の定量のための放射線免疫アツセィ手順に
おける本発明の免疫学的試薬の使用を記載する。

本発明の免疫学的試薬の試料を０．９％の塩分水溶液中
ポリエチレングリコールの５％溶液８．４の‘を６％プ
ルロニックＦ−滋非イオン表面活性剤２０泌と混合する
ことにより調製した。

放射線免疫アツセイを下記の如くして遂行した：人の繊
毛ゴナドトロピン（ＨＣＧ）に吸収させた０．０６０の
‘のウサギ抗一日ＴＳＨを種々の強度の０．２００の‘
のＨＴＳＨ標準と混合した。

０．０５０の‘の燐酸塩緩衝剤、ｐＨ７．４を次いで混
合物に添加し、次いで該混合物を３７つ０で２時間温層
した。

この時点で、１１２５で標識付けされた０．１００の‘
のＨＴＳＨを添加し次いで混合物を３７℃で３時間さら
に溢遣した。次いで先に調製した本発明の１．０のとの
試薬を添加しかつ混合物を室温で１時間温遣した。混合
物への添加に際し試薬の希釈により、ポリエチレングリ
コールおよびＦ−３８の濃度は１．４および４．ａ重量
％からそれぞれ１および３％に減じた。混合物を１００
０×９で１０分間遠心分離した。遠心分離した固体の洗
浄を要する場合には、洗浄液溶液は試薬がアッセィで最
初に使用された時の本発明試薬と同一濃度、すなわち１
％のポリエチレングリコールおよび３％のＦ−３８と同
一の濃度を含有しなければならない。上燈液をデカント
し次いで沈殿物をカウントした。この手順を種々の異な
ったＨＴＳＨ標準に対して繰り返しかつ標準曲線を種々
の沈殿物中でのカウント対相当するＨＴＳＨ標準の濃度
を画くことにより得られる。標準曲線が一度得られると
、アッセィはＨＴＳＨ標準が試験試料により置き換えら
れることを除いて、前述した手順を使用し、未知の試料
について遂行される。

試料中のＨＴＳＨレベルを標準曲線上の沈殿物カウント
の所在から容易に定量する。本発明試薬溶液の使用はポ
リエチレングリコ−ルのみを使用する試薬から得られる
ものを越え生成された沈殿物の範囲を増進し、かつ改善
された放射線免疫アツセィをもたらす。比較例 ４重量％のプルロニックＦ−３が単独、および４重量％
のポリエチレングリコール単独の場合の抗原−抗体銭体
不溶化に対する効果を比較した。

この結果を第６、７表および第６，７図に示す。第６表
第７表 このデータ‐から、４重量％のプルロニツクＦ−滋単独
の場合の方が、４重量％のポリエチレングリコール単独
の場合よりも不溶化が優れているといえる。

第６、７表ともに６００〜１２００肌ｐ／ｄ‘でプルロ
ニックＦ−斑の方がデータ一の直線化が改善されている
。従って、例えば約４重量％の酸化エチレンとポリオキ
シプロピレン重合体のブロック共重合体を含有する水溶
液を用いても、ポリエチレングリコールの存在なしで適
当な比濁アツセィ結果を達成することができる。

この結果は、一般にポリエチレングリコールが最上のも
のであると考えられているのに対して予期しない結果と
言える。しかしながら、前述したように本発明のブロッ
ク共重合体とポリエチレングリコールの混合物の場合の
方が、一層直線的なグラフが得られるので、最適の結果
を得るために好ましい。

【図面の簡単な説明】

第１〜５図は本発明実施例による各１ｇＧレベル（雌／
ｄ‘）における光散乱％の実測値と計算値を示すグラフ
である。 第６，７図は４重量％プルロニツクＦ一３８単独および
４重量％ポリエチレングリコール単独の場合の各１ｇＧ
レベル（肌９／ｄ‘）における平均光散乱％の実測値を
示すグラフである。第１図第２図 第３図 第４図 第５図 第６図 第７図

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 少なくともポリエチレングリコール溶液より成る免
   疫学的試薬において、該試薬が前記ポリエチレングリコ
   ールとこれ以外の非イオン表面活性剤との混合物の水溶
   液より成り、前記水溶液が使用中、約３〜６重量％の該
   混合物を含有し且つかかる範囲内で約０．７〜１．７の
   範囲の計算ＨＬＢ価（親水性−親油性バランス価）を有
   して成ることを特徴とする免疫学的試薬。 ２ 前記混合物濃度が最初前記３〜６％の濃度の範囲で
   なくとも、前記濃度を前記範囲内に調整するため、該水
   溶液に抗血清を含有させて成ることを特徴とする特許請
   求の範囲第１項記載の免疫学的試薬。 ３ 前記非イオン表面活性剤が（ａ）酸化エチレンとポ
   リオキシプロピレンのブロツク共重合体、（ｂ）直鎖第
   一級脂肪族オキシアルキル化アルコール、（ｃ）グリセ
   リンモノステアレート、（ｄ）アルキルアリールスルホ
   ネート又は（ｅ）米国特許第２９７９５２８号記載のポ
   リオールより成ることを特徴とする特許請求の範囲第１
   項又は第２項記載の免疫学的試薬。 ４ ポリエチレングリコールが約４０００〜６０００の
   分子量を有し、且つ非イオン表面活性剤が酸化エチレン
   とポリオキシプロピレンのブロツク共重合体より成り、
   溶液のＨＬＢ価が約０．７〜１．３より成ることを特徴
   とする特許請求の範囲第１項又は第２項に記載の免疫学
   的試薬。 ５ 水溶液が約２０〜４０重量％のポリエチレングリコ
   ールと約８０〜６０重量％の酸化エチレンとポリオキシ
   プロピレン重合体のブロツク共重合体を含有して成るこ
   とを特徴とする特許請求の範囲第１項又は第２項記載の
   免疫学的試薬。 ６ 前記混合物の濃度が約４重量％であり且つ前記混合
   物が約２５重量％のポリエチレングリコールと約７５重
   量％の前記ブロツク共重合体を含有して成ることを特徴
   とする特許請求の範囲第５項記載の免疫学的試薬。 ７ 抗体−抗原錯体を生成させるための抗体と抗原との
   反応を含む免疫学的アツセイ法において、前記反応によ
   り生成された抗原−抗体錯体の不溶化を実質的に増加さ
   せるため、ポリエチレングリコールとこれ以外の非イオ
   ン表面活性剤との混合物の水溶液より成り、前記水溶液
   が使用中約３〜６重量％の該混合物を含有し且つかかる
   範囲内で約０．７〜１．７の範囲の計算ＨＬＢ価（親水
   性−親油性バランス価）を有する少なくともポリエチレ
   ングリコール溶液より成る免疫学的試薬を使用すること
   を特徴とする免疫学的アツセイ法。 ８ 前記試薬を比濁、酵素、電気泳動又は放射線免疫ア
   ツセイを遂行するために利用することを特徴とする特許
   請求の範囲第７項記載の免疫学的アツセイ法。 ９ 前記抗原、抗体及び試薬を、前記抗体−抗原錯体の
   微小濃度の関数である光散乱測定を行うことにより比濁
   分析を行なう前に前記抗体−抗原錯体を生成するために
   温置することを特徴とする特許請求の範囲第７項記載の
   免疫学的アツセイ法。 １０ 前記試薬、及び免疫グロブリンの形態の前記抗体
   及び抗原を、不溶化免疫グロブリンの微小濃度の関数で
   ある光散乱測定を行なうことにより比濁分析を実施する
   以前に不溶化免疫グロブリンの抗体−抗原錯体を生ぜし
   めるため温置することを特徴とする特許請求の範囲第７
   項記載の免疫学的アツセイ法。