JPS6053596B2 - アシラ−ゼの製造法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はアスペルギルス属に属するアシラーゼ生産菌株
を培養してアシラーゼを取得するに当り、脂肪酸又はそ
の金属塩（以下脂肪酸などという）を少くとも１種以上
含有する培地に培養することを特徴とするアシラーゼの
製造法に関する。

アシラーゼ（Ｅ、Ｃ、３．５．１．１４）は別名アミノ
アシラーゼとも称され、Ｎ−アシルーＬ−アミノ酸を加
水分解してＬ−アミノ酸を生成することから、ＤＬ−ア
ミノ酸のラセミ分割に用いられる酸素として工業的に重
要である。従来糸状菌によるアシラーゼの生産方法とし
ては道ら（特公昭３１−２８９１号公報および日本農芸
化学会誌第２捲、３４３〜３４５ページ、１９Ｍ年）の
アスペルギルス属、ペニシリウム属菌を小麦皺に培養す
る方法、千畑ら（ブレチンオブ ジ アグリカルチラル
ケミカル ソサイエテイー オブ ジャパン（Ｂｕｌ
ｌ、Ａｇｒ、Ｃｈｅｍ、Ｓｏｃ、Ｊａｐａｎ）第２１巻
、３００〜３０７ページ、１９５７年）のアスペルギル
ス属、ペニシリウム属、リゾープス属、ムコール属など
の菌株を皺培地あるいは皺ともみがらの混合培地に培養
する方法、稟ら（特公昭３５−１０６９２号公報）のア
スペルギルス属、ペニシリウム属菌を小麦皺に培養する
方法、興国ら（特公昭４０−２７３１０号公報）のアス
ペルギルス、オリーゼをアシルアミノ酸を含む小麦皺培
地に培養する方法などが知られている。

本発明者らはアスペルギルス属に属する菌株のアシラー
ゼの生産増強のため鋭意検討を続けた結果、培地中に炭
素数■乃至２０の脂肪酸又はその金属塩を添加すること
によつて生産性が増大することを見出した。

本発明は上記の知見にもとずき完成されたものでアシラ
ーゼの工業的、大量生産方法として極めて有用てある。
以下本発明の方法について詳しく説明する。本発明に用
いられるアシラーゼ生産菌株としては、アスペルギルス
属に属するアシラーゼ生産菌株であればいずれでもよく
、例えばアスペルギルス・オクラセウス（Ａｓｐｅｒｇ
ｉｌｕｓｏｃｈｒａｃｅｕｓ）ＩＦ０４０７０、アスペ
ルギルス・オリーゼ（Ａｓｐ。

”ｏｒｙ２ａｅ）ＩＡＭ２７５０、アスペルギルス、ソ
ーヤ（Ａｓｐ、ｓｏｊａｅ）ＩＦＯ４３９ｌ）アスペル
ギルス・オキサリウム（Ａｓｐ、ｏｘａｌｉｕｍ）ＩＦ
Ｏ５７４８などが例示される。これらの菌株のうち特に
生産性の高さからアスペルギルス●オクラセウスＩＦＯ
４Ｏ７Ｏが好ましい。これら菌株の培養に用いられる栄
養培地は炭素源、窒素源、無機塩等から成る通常の培地
であればよい。

例えば炭酸源としては皺、でん粉、米糠、グルコースな
ど、窒素源としてはペプトン、肉工キズ、酵母工キズ、
硝酸ナトリウム、硫安など、無機塩としては硫酸マグネ
シウム、硫酸マンガンなどが用いられる。培養形態は固
体培養、液体培養どちらでもよいが、アシラーゼの生産
性からは皺を基本とする固体培養が好ましい。アシラー
ゼの生産性を増強するために上記栄養培地に添加する炭
素数１４乃至２０の脂肪酸とはＣｌ４のミリスチン酸、
Ｃｌ６のパルミチン酸、Ｃｌ８のステアリン酸、オレイ
ン酸、リノール酸、リノレン酸、Ｃ２Ｏのアラキジン酸
などであり、飽和、不飽和を問わない。

又これら脂肪酸の金属塩、例えばナトリウム塩、カリウ
ム塩、マグネシウム塩などでも良く、さらにこれらの混
合物である天然の脂肪酸や石けんなどでもよい。これら
脂肪酸などのうちアシラーゼ増産のため特に好ましいの
は飽和脂肪酸であるミリスチン酸、ステアリン酸、パル
ミチン酸又はこれらの金属塩である。本発明の方法にお
いて脂肪酸を用いる場合は培地ＰＨを菌の生育に適した
条件にするため中和しなければならない。

又、脂肪酸はそれ自身親水性でないため培地中に均一に
分散させるのが困難である。従つて脂肪酸よりは脂肪酸
金属塩を利用した方がより好都合である。これら脂肪酸
など培地への添加濃度は、脂肪酸一金属塩を例として説
明すると、固体培養の場合は０．１％以上３０％以下、
好ましくは１％乃至１５％、液体培養の場合は０．１％
以上３％以下、好ましくは０．５乃至２％である（いず
れも重量パーセント、以下これに同じ）。

脂肪酸を利用する場合は．脂肪酸金属塩の場合と当量の
濃度になるようにすればよい。脂肪酸などを培地に添加
することによるアシラーゼの増産は、これら添加物の栄
養源としての意味とともに培地ＰＨが酵素産生に適した
範囲に維持一されることによるものと考えられる。

このＰＨを好適な範囲に保つ作用は弱アルカリ性の塩類
の添加によつてもある程度得られる。これら塩類として
は、それを構成する酸の解離定数が比較的低い弱酸又は
有機酸から成る塩類が好ましく、例えばリン酸ナトリウ
ム、リン酸カリウム、炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリ
ウム、フマル酸ナトリウム、乳酸ナトリウムなどが例示
される。すなわちこれら無機又は有機の塩類を培地に適
量加えて、酸素産生時のＰＨを約７．５〜８．５好まし
くは７．８〜８．２の範囲内に維持することによつても
アシラーゼの増産は多少可能である。この場合、本発明
に使用される脂肪酸などを併用添加すると効果はさらに
高ま・る。逆に言うと、これら塩類と脂肪酸などの併用
添加により、脂肪酸などの添加量をその単独使用の場合
の添加量よりも少なくすることができて、しかも同等の
効果が得られる。すなわち本方法を用いることにより高
価な脂肪酸などの使用量を減することができる。本発明
の方法の別の利点はアシラーゼの生産性に対し、培地殺
菌条件の影響がなくなる点にある。

通常微生物の培養においては殺菌条件が緩和なほど好ま
しい結果が得られる場合が多い。本発明の方法における
培地殺菌はおおむね蒸気圧１．２ｋｇＩｃＦ１１１３０
分乃至１．３ｋ９１ｃＩｔ１７紛の範囲内で行なわれ、
従来苛酷な条件になるほどアシラーゼ生産性が低下して
いたものが、脂肪酸などを添加することによつてその影
響が全くなくなつた。本発明の微生物の培養法は、通常
の糸状菌の培養法に従えばよい。

例えば、培養温度は２０〜３５７Ｃ望ましくは２２〜３
０℃、培養期間は１〜７日間である。本発明の方法によ
る培養物からアシラーゼを取得する方法は公知の方法を
適宜組合せて行えばよい。

例えば固体培養麹を水性媒質により抽出してアシラーゼ
を含む抽出液を得る。該抽出液を限外淵過、減圧濃縮な
どの方法で濃縮したのち、硫安などによる塩析又はエタ
ノールなどによる有機溶媒沈澱により精製し、粗酵素粉
末を得る。さらに、必要に応じ、イオン交換、ゲルろ過
、透析などにより精製品を得ることができる。液体培養
の場合はアシラーゼが菌体内に蓄積されるため、例えば
アクロモバクター・ルナータスが産生する酵素−Ａによ
つて抽出する方法（特公昭５７−１３２７１号公報）に
従つてあらかじめアシラーゼを抽出したのち、菌体を沖
別するのがよい。その後の精製は前記固体培養抽出液の
場合と同様に操作することができる。以下試験例及び実
施例により本発明の詳細な説明する。

なおアシラーゼの活性はＮ−アセチルーＤＬ−メチオニ
ン（ＰＨ８．Ｏ、５×１０−４ＭＣ０Ｃ１２含有）を基
質として３７℃にて酸素反応を行い、ニンヒドリン比色
法によつて生成するＬ−メチオニンを定量し、３紛間に
１μＭＯｌ（７）Ｌ−メチオニンを生成する酵素活性を
１単位とした。試験例１ 小麦鈑５ｙに水５ｍ１及び第１表に示す各種脂肪酸金属
塩を各濃度添加し、よく混和したのち１００ｍ１容の三
角フラスコに移し１．２ｋ９１ｃ１１１３紛蒸気殺菌し
た。

次にアスペルギルス・オクラセウスＩＦＯ４Ｏ７Ｏの保
存菌株を接種し、３０℃、５日間培養した。培養後の麹
に水１００ｍ１を加えて約加時間抽出を行い、抽出液の
アシラーゼ活性を測定した。脂肪酸金属塩無添加を１０
０％としたときの相対活性を第１表に示す。なおノンサ
ールＳＮ−１は日本油脂製のステアリン酸石ケンであり
、ＳＳ−４０Ｎは花王石鹸製のステアリン酸を主成分と
する石けんで、その組成はステアリン酸、パルミチン酸
、ミリスチン酸がそれぞれ６５％、３０％、５％の割合
である。ＮＳソーブは花王石鹸製のオレイン酸を主成分
とする石けんで、その組成はオレイン酸、パルミチン酸
、ステアリン酸がそれぞれ４０％、３５％、２５％の割
合である。第１表の結果によると脂肪酸塩を培地に添加
することによつて本菌株のアシラーゼ生産能が高まるこ
とが明らかである。

特に効果の高いものはミリスチン酸ナトリウム、パルミ
チン酸ナトリウーム、ステアリン酸ナトリウムなどの飽
和脂肪酸塩及びこれらを含む商品の石けんである。オレ
イン酸、リノール酸、リノレン酸などの不飽和脂肪酸の
塩はその二重結合の数の多い程菌株の生育が阻害され、
効果は低くなる。試験例２ 小麦皺５ｙに水５ｍ１、ステアリン酸ナトリウム０．５
ｙをよく混和したのち１００ｍ１容の三角フラスコに移
し０．７ｋｇＩｃｒ１１７α号蒸気殺菌した。

これに第２表に示すアスペルギルス属の各種菌株を接種
し、−試験例１と同様に操作した。なお対照としてステ
アリン酸ナトリウム無添加のものについても同様に操作
した。抽出液のアシラーゼ活性を第２表に示す。第２表
から明らかなようにアスペルギルス・オクラセウスＩＦ
′０４０７０の他のアスペルギルス属菌にも脂肪酸金属
塩添加によるアシラーゼの生産増が認められる。

試験例３小麦皺５ｆに水５ＷＬｔ及びノンサールＳＮ−
１、各種無機、有機の塩類を第３表に示す割合で加えよ
く混和し、以下試験例１と同様に操作した。

抽出液の相対活性を第３表に示す。第３表から明らかな
ように脂肪酸金属塩と同表に例示する塩類を併用添加す
ることにより、より少い脂肪酸金属塩の添加で同等の効
果が得られることがわかる。

試験例４ 小麦皺５ｇに水３．５ｍ１１ステアリン酸又はオレイン
酸０．５ｙおよび第４表に示す各種濃度のカセイソーダ
水溶液１．５ｍ１を加えよく混和し、試験例１と同様に
操作した。

脂肪酸無添加を１００％としたときの相対活性を第４表
に示す。脂肪酸を用いる場合はアルカリを併用添加する
ことにより、アシラーゼの増産ができることが第４表に
示す結果かられかる。

試験例５ 小麦皺５ｙに水５ｍｔおよびステアリン酸ナトリウム０
．５ｙ又はオレイン酸ナトリウム０．５ｙを加えよく混
和し、第５表に示す各種条件で殺菌したのち試験例１と
同様に操作した。

抽出液の相対活性を第５表に示す。脂肪酸金属塩無添加
の場合、殺菌条件が厳しくなるに従つてアシラーゼの生
産性が低下するが、それらを添加した場合は全く影響が
認められない。

試験例６ 下記に示す組成の培地にステアリン酸ナトリウム、オレ
イン酸ナトリウム又はノンサールをそれぞれ１％加え５
００ｍｔ容坂ロフラスコに入れ、１．２ｋｇＩＣ！Ｉｌ
３紛殺菌したのち同じ組成の培地に培養して調製したア
スペルギルス・オクラセウスＩＦ′０４０７０の種培養
液を接種した。

グルコース ３ｇ／１００ｍ１コーンスチ
ープリカー ２硝酸ナトリウム
０．２硫酸マグネシウム ０．０５
ＰＨ６．５３０ ℃、５日間培養後、培養液にアクロモバクター・ルナー
タスの産生する酵素−Ａの１．５％水溶液２ｍ１を加え
てアシラーゼを抽出せしめた。

抽出液の活性は、対照（脂肪酸塩無添加）を１００％と
するとステアリン酸ナトリウム、オレイン酸ナトリウム
、ノンサールを加えた場合はそれぞれ１５４％、１３２
％、１５５％であつた。実施例１小麦皺１ｋ９にノンサ
ール５０ｆ１リン酸二ナトリウム（無水）２０ｇおよび
水０．５ｆを加えよく混和して、５０×７０ｃｍのアル
ミ製麹蓋へ盛りつけ１．２ｋ９１ｄ１７紛殺菌した。

あらかじめ１０％小麦皺懸濁液培地に３０℃、２日間培
養したアスペルギルス・オクラセウスＩＦＯ４Ｏ７Ｏの
種培養液０．３ｅを接種し、混合し３０℃、５日間培養
した。出麹を粉砕し、これに水２′を加えて１時間抽出
したのちろ過により酵素液を得た。残査に、さらに水２
′を加えて同様の操作を行い、計３ｅの酵素液を得た。
該液のアシラーゼ活性は１５３ｕＩｍｔであつた。なお
ノンサール無添加の他は上記と同様に操作した対照の酵
素液の活性は９６ｕＩｍｔであつた。該酵素液３ｅを限
外ろ過膜（旭化成製、 Ｎ■４０１０型）で５００ｍ１まで濃縮し、次にエタノ
ール３００ｍｔを添加し不純物を析出せしめ、遠心分離
により沈澱を除き清澄液を得た。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ アスペルギルス属に属するアシラーゼ生産菌株を炭
   素数１４乃至２０の直鎖状脂肪酸又はその金属塩を少く
   とも１種以上含有する培地に培養し、該培養物からアシ
   ラーゼを取得することを特徴とするアシラーゼの製造法
   。 ２ 炭素数１４乃至２０の直鎖状脂肪酸又はその金属塩
   に加えて塩類を培地に含有せしめる特許請求の範囲第１
   項記載のアシラーゼの製造法。 ３ それを構成する酸が弱酸又は有機酸である塩類を培
   地に含有せしめる特許請求の範囲第２項記載のアシラー
   ゼの製造法。