JPS6053600B2 - コリンオキシダ−ゼを用いる分析法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、新規なコリンオキシダーゼを用いてなるコリ
ンまたはベタインアルデヒドを含有する液体の分析に関
する。

従来、コリンを酸化してベタインアルデヒドとする公知
の酵素としては、酵素番号１．１．９９．１コリンニ（
アクセプター）オキシドレダクターゼ〔ＣｈＯｌｌｎｅ
： （ＡｃｃｅｐｔＯｒ）０ｘｉｄ０ｒｅｄｕｃｔａｓ
ｅ〕、常用名コリンデヒドロゲナーゼ（ＣｈＯｌｉｎｅ
ｄｅｈｙｄｒＯｇｅｎｅａｓｅ）〔酵素名・酵素反応記
号一覧表７５頁（１９６１）国際酵素委員会報告、共立
出版〕が挙られ、この酵素は次式で示す反応を触媒する
。

〔式中、Ａはフラピンアデニンジヌクレオチド５（ＦＡ
Ｄ）、チトクロームＣなどの呼吸鎖成分、フエナジンメ
トサルフエート、フエリサイアナイド２●６ージクロル
フェノールインドフェノール、メチレンブルーなどの酸
化還元色素を示す〕〔メソウズ●イン●エンチモロジー
（ＭｅｔｈＯｄｓｉｎｌＥｒｌＺｙｒｒｌＯｌＯｇｙ）
■、５６２−５７０（１９６２）アカデミツゅク●ブレ
ス（ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ）〕。上記反応におい
て、Ａが呼吸鎖成分であるＦＡＤの場合には、コリンの
酸化反応は次式に示す通り進行すると推定されている。

即ちコリンによつて還元されたＦＡＤ（ＦＡＤＨ２）は
電気をチトクローム系に伝達し、伝達された電子は最終
的に酸素に渡されて水を生成する（これはコリンオキシ
ダーゼ系とも呼ばれる）〔メソウズ・イン・エンチモロ
ジー（ＭｅｔｈＯｄｓｉｎＥｎｚｙｍＯｌＯｇｙ）Ｉ、
６７４−６７８（１９５５）アカデミツク・ブレス（Ａ
ｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ）〕。

以上の如く、公知の、コリンのベタインアルデヒドへの
酵素的酸化反応は、種々の電子受容体を伴つて進行する
ものであつて、動物ではミトコンドリアの呼吸鎖、微生
物、例えばシュードモナス エルギノーサ（Ｐｅｓｅｕ
ｄＯｍＯｎａｓａｅｒｕｇｉｎＯｓａ）Ａ−１６菌株で
は、その細胞膜に結合している電子伝達系の成分が関与
して行なわれると報告されている〔アグリカルチユラル
・アンド バイオロジカル ケミストリー（Ａｇｒｉｃ
ｕｌｔｕｒａｌａｎｄＢｉＯｌＯｇｊｃａｌＣｈｅｍｉ
ｓｔｒｙ）３９、１５１３−１５１４（１９７５）、日
本農芸化学会講演要旨集５１、１００（１９７６）日本
農芸化学会〕。

また、上記コリンデヒドロゲナーゼによつてコリンから
生成したベタインアルデヒドは、酵素番号１．２．１．
８ベタインアルデヒドニＮＡＤオキシドレダクターゼ（
ＢｅｔａｉｎａＩｄｅｈｙｄｅ：ＮＡＤＯｘｉｄＯｒｅ
ｄｕｃｔａｓｅ）常用名ベタインアルデヒドデヒドロゲ
ナーゼ（Ｂｅｔａｉｎｅａｌｄｅｈｙｄｅｄｅｈｙｄｒ
Ｏ？Ｎａｓｅ）〔酵素名一酵素反応記号一覧表７６（１
９６１）国際酵素委員会報告、共立出版〕によつて、次
式に示す通りの反応によりベタインまで酸化される。（
なお、ＮＡＤはニコチナミドアデニンジヌクレオチド、
ＮＡＤＰはニコチナミドアドニンジヌクレオチドホスフ
エートおよびＮＡＤＨ２、ＮＡＤＰＨ２は各々の還元体
を略称したものである。）〔酵素研究法第２巻第４２５
−４２６（１９５６）朝倉書店、メソウズ●イン エン
チモロジー（ＭｅｔｈＯｄｓｉｎＥゼ声０１０舒）１１
６７４−６７８（１９６２）アカデミツク●ブレス（Ａ
ｃａｄｅｍｊｃＰｒｅｓｓ）、日本農芸化学会講演要旨
集５１、１００（１９７６）日本農芸化学会〕このベタ
インアルデヒドデヒドロゲナーゼは、シュードモナス・
エルギノーサＡ−１６菌株より単離、精製され、その分
子量は約１４５０００（ゲルｐ過法）、等電点は５．１
、至適ＰＨは８．０〜９．へ安定ＰＨは７．５ｆｊ′近
であることが確認されている。本発明者らは、鹿児島県
川辺群川辺町高田のさつまいも畑より分離したアースロ
バクター（ＡｒｔｈｒＯｂａｃｔｅｒ）属に属する細菌
Ｂ−０５７７菌株が、その菌体内に、コリンのベタイン
への酸化反応を触媒する酵素を生産することを見い出し
、該酵素を単一にまで精製した。

この酵素は、等電点４．６（キャリア・アンホライトを
用いる電気泳動法）、分子量約８４０００±２１００（
セフアデツクスＧ−１５０ゲル枦過法）の物理的性状を
有し、コリンおよびベタインアルデヒドに基質特異性を
示し、その酵素反応において補酵素の添加を必要とせす
、基質を直接酵素と反応せしめ、１モルのコリンをベタ
インアルデヒドを経由してベタインまで酸化して２モル
の過酸化水素を生成せしめ、また１モルのベタインアル
デヒドをベタインまで酸化して１モルの過酸化水素を生
成せしめる反応を触媒するものであつて、その基質特異
性および酵素反応からコリンオキシダーゼと命名し、新
規なコリンオキシダーゼであることを見い出した。

上記の細菌Ｂ−０５７爛株の肉眼的および顕微鏡的観察
に基く各種培地上における培養の特徴は、次に記載する
通りである。

Ａ肉眼的観察 ２６℃、１８〜２４ＪＩ１間培養の結果、次の通りであ
る。

１肉汁寒天平板培養 発育は良好、円形で周囲はなめらかであ り、光沢
を有するコンベツクス（ＣＯｎｖｅｘ） 状となる。

集落の色は灰白色（Ｈｕｅｌチａ）から淡黄色（Ｈｕｅ
ｌ←）に変化する。拡散性色素は産生しない。２肉汁寒
天斜面培養 発育は良好て、線状に生育し光沢を有する。

集落の色は灰白色（Ｈｕｅｌ）ａ）から淡黄色（Ｈｕｅ
ｌト）に変化する。拡散性色素は産出しない。３肉汁液
体培養 表面発育において、菌膜を形成しないか、もしくは形
成しても非常にうすい。

その培養液は一様に混濁後沈澱を生じるが透明にはなら
ない。４肉汁ゼラチン穿刺培養 表面のみ発育し、その発育は良好である。

ゼラチンを液化しない。５リトマス◆ミルク 発育は弱く、２週間位でペプトン化する。

軟かい凝固またはアルカリ化する場合もある。

リトマスは還元しない。（４）色の表示記載は１９５師
コンテイナー・コーポレイシヨン オブ アメリカ（Ｃ
ＯｎｔａｉｎｅｒＣＯｒｐＯｒａｔｉＯｎＯｆＡｍｅｒ
ｉｃａ）発行「カラー●ハーモニ●マニュアル（ＣＯｌ
ＯｒＨａｒｍＯｎｙＭａｎｌｌａり」の表示法に従つた
。

Ｂ顕微鏡的観察１細胞の形、大きさ 肉汁寒天平板培養による、若い細胞（６時間）は桿状
で、大きさは０．５〜０．８×１．５〜２．０μで、古
い細胞（１峙間）は球状（４）．５〜０．８μ）も存在
する。

２多形性 肉汁液体培養において、Ｔ字型、Ｙ字型の細胞を観察
することがある。

３運動性 なし（軟寒天培地にて観察）。

４胞子 なし。

５グラム染色 若い細胞は陽性、古い細胞は陰性である。

６抗酸性染色 陰性 Ｃ次に生理学的性質を記載する。

硝酸塩の還元 陰 性脱窒反応
陰 性■けスト
陰性ＶＰテスト
陰 性インドールの生成
陰 性硫化水素の生成 弱陽性ス
ターチの加水分解 弱陽性クエン酸の
利用コーザー（ＫＯｓｅｒ）培地 陰 性ク
リステンゼン（Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ）培地陽 性硝
酸塩の利用 陰 性アンモニウ
ム塩の利用 陰 性色素の生成
陰 性ウレアーゼ
陽 性オキシダーゼ
弱陽性カタラーゼ 陽 性生育
ＰＨ範囲 ４．０〜１１．０生育温
度範囲 ５〜３ＴＣ酸素に対する態
度 好気性セルロースの加水分解
陰 性力ティンの加水分解
陰 性０−Ｆテスト（注１） ０（酸化的分解
）糖より酸の産性（ガスは産生しない）（注２）１週間
以内グルコース、イノシトール２週間以内 セロビオース、エリスリトール、フラクトース、マルト
ース、マンニトール、マンノース、ソルビトール、シユ
クロース、トレハロース、スターチ、酸を作らないもの Ｌ−アラビノース、ヅルシトールに、エスクリン、ガラ
クトース、グリセリン、ラクトース、メレジトース、メ
リビオース、サリシン、ソルボース、キシロース、注１
；０−Ｆテスト用培地 本細菌Ｂ−０５７爛株は、ペプトンを含む培地では酸を
産生しないため、変法培地（組成：ＮＨｉＨ２ＰＯ４ｌ
ｙｌイーストエキス粉末１ｙ，．ＫＣ１０．２ｙ．．Ｍ
ｇＳ０４・７Ｈ２００．２ｙ１グルコース１０ｙ１細菌
用寒天末２ｇ、蒸留水１′、ＰＨ７．２）を用いた。

注２： 基礎培地（組成：ＮＨ４Ｈ２ＰＯ４ｌｙｌイーストエキ
ス粉末１ｙ．．ＫＣ１０．２ｙ．．ＭｇＳ０４・７Ｈ２
００．２ｙ１細菌用寒天末２ｙ１蒸留水１′、ＰＨ７．
２）を用いた。

以上の諸性質、特にグラム陽性菌、非抗酸性、非運動性
の桿菌または球菌で、分枝することがあるが、線維状に
はならず、糖を酸化的に分解し、カタラーゼ陽性、オキ
シダーゼ弱陽性でセルロースを分解しない性質を示す本
細菌Ｂ−０５７漕株は、バージース●マニュアル●オブ
●デイタミネイテイブ●バクテリオロジー（Ｂａｒｇｅ
ｙ５ｓｍａｎＬ］ＡｌＯｆＤｅｔｅｒｍｊｎａｔｉｖｅ
ＢａｃｔｅｒｉＯｌＯｇｙ）１９７４によればコリネホ
ーム・グループ●バクテリア（ＣＯｒｙｎｅｆＯｒｍｇ
ｒＯｕｐＢａｃｔｅｒｉａ）のアースロバクター属に属
するものと認められた。

なお、アースロバクター属と他のコリネホーム・グルー
プ・バクテリアとを比較すれば、明らかに次の点で大別
される。

コリネバクテリウム（ＣＯｒｙｒｌｅｂａｃｔｅｒｉｕ
ｍ） ：糖を発酵的に分解するロチア（ＲＯｔｈｌａ）
：線維状となり、糖を発酵的に分解するクルチア（Ｋｕ
ｒｔｈｉａ）：糖より酸を発生しないセルロ卒ナス（Ｃ
ｅｌｌＬｌｌＯｍＯｒｌａＳ） ：セルロース分解能を
有するプレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉ
ｕｍ） ：糖を発酵的に分解するミクロバクテリウム（
ＭｉｃｒＯｂａｃｔｅｒｉｕｍ） ：糖を発酵的に分解
するプロピオニバクテリウム （ＰｒＯｐｉＯｎｉｂａｃｔｅｒｉＬｌｎｌ） ：嫌気
的細菌フバクテリウム（Ｆｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ） ：
嫌気的細菌アースロバクター（ＡｒｔｈｒＯｂａｃｔｅ
ｒ） ：糖に酸化的に分解する以上の通り、本細菌Ｂ−
０５７爛株はアースロバャゞクター属に属する菌と認め
られ、またバージース・マニュアル・オブ●デイタミネ
イテイブ●バクテリオロジー１９７４によれば、アース
ロバクター属は７種に分けられることが報告されており
、これらの種についてその標準菌株を併行試験および文
献記載の事項に基き、次の通りの結果を得た。

なお、培養温度は２６℃であり、使用菌株およびその略
号は次の通りである。アースロバクター シンプレツク
ス （ＡｒｔｈｒＯｌ）Ａｃｔｅｒｓｉｍｐｌｅｘ）■ＦＯ
ｌ２Ｏ６９（以下８と略す）アースロバクター グロビ
フオーミス （ＡｒｔｈｒＯｂａｃｔｅｒｇｌＯｂｉｆＯｒｍｉｓ）
ＩＦＯｌ２ｌ３７（以下Ｇと略す）アースロバクター●
シテレウス（ＡｒｔｈｒＯｂａｃｔｅｒｃｉｔｒｅｕｓ
）ＩＦＯｌ２９５７（以下Ｃと略す）アースロバクター
ツメツセンス（ＡｒｔｈｒＯｂａｃｔｅｒｔｕｎｌｅ
ｓｃｅｒｌｓ）ＩＦＯｌ２９６Ｏ（以下Ｔｕと略す）ア
ースロバクター ターレゲンス （Ａｒ″ＴｈｒＯｂａｃｔｅｒｔｅｒｒｅ？Ｎｓ）ＩＦ
Ｏｌ２９６ｌ（以下Ｔｅと略す）アースロバクター●ヅ
ユオデカデイス （Ａｒ′ＴｈｒＯｂａｃｔｅｒｄｕＯｄｅｃａｄｉｓ）
ＩＦＯｌ２９５９（以下Ｄと略す）アースロバクター
フラベツセンス （Ａｒ″ＴｈｒＯｂａｃｔｅｒｆｌａｖｅｓｃｅｎｓ）
（以下Ｆと略す）なお、ＤおよびＦの菌については、バ
ージース●マニュアル●オブ●デイタミネイテイブ●バ
クテリオロジイー１９７４に記載の事項のみによるもの
である。

またＤ菌株は、普通寒天培地では生Ｉｉず―−ーー以上
の比較実験の結果において、本細菌Ｂ一０５７爛株は、
集落の色、スターチ分解能、一部の糖よりの酸の産生能
を除いてアースロバクター・グロビフオーミスＩＦＯｌ
２ｌ３７に一致している。

またアースロバクター・グロビフオーミスは普通寒天培
地などでは特有の色素は産出しない菌株が多いが、非水
溶性のレモン様の黄色の色素を産生する菌株もある点、
さらに本細菌Ｂ−０５７溝株およびアースロバクター●
グロビフオーミスＩＦＯｌ２ｌ３７の両菌株ともスター
チより酸を産生するスターチ分解能の点、さらにまたア
ースロバクター・グロビフオーミスＩＦＯｌ２ｌ３７は
、本細菌Ｂ−０５７爛株が酸を産生する糖のうち、エリ
スリトールを除く全部の糖から酸を産生する酸産生能の
点より、本細菌Ｂ−０５７７菌株をアースロバクター・
グロビフオーミスに属するものと同定し、アースロバク
ター●グロビフオーミスＢ−０５７７（ＡｒｔｈｒＯｂ
ａｃｔｅｒｇｌＯｂｉｆＯｒｍｌｌｓＢ−０５７７）と
命名した。また本菌は工業技術院微生物工業技術研究所
に微生物受託番号「ＦＥＲＭ−ＰＮＯ．３５ｌ８」とし
て寄託されている。またこの新規な酵素コリンオキシダ
ーゼはコリおよびベタインアルデヒドをその基質とする
酵素であるため、種々の確認試験などの定量手段などを
用いることにより、コリンまたはベタインアルデヒドを
含有する液体にコリンオキシダーゼを作用せしめ、次い
で生成する過酸化水素の定量、生成するベタインの定量
、消費された酸素の定量を行なうことによりコリンまた
はベタインアルデヒドを含有してなる液体の分析をなし
得るものであることを見い出した。

本発明は上記の知見に基いて完成されたもので、少なく
とも下記の１基質特異性、２酵素作用を有してなるコリ
ンオキシダーゼ１基質特異性：ー般式 （式中、Ｒ１は−ＣｌＩ２ＯＨ基または−ＣＨＯ基を示
す。

）で表わされる化合物 ２酵素作用：反応式〔１〕および／または〔■〕 をコリンまたはベタインアルデヒドを含有する液体に作
用せしめ、次いで反応によつて生成する過酸化水素、ベ
タインまたは消費される酸素を測定してなるコリンまた
はベタインアルデヒドを含有する液体の分析に係る発明
である。

本発明におけるコリンオキシダーゼとしては、上記の基
質特異性、酵素作用を有するものであればよく、その元
素分析値、添加物による阻害、活性化など多少の相異を
示すものであつても上記の性状、作用を有するものは本
発明のそれに包含されるものであり、このコリンオキシ
ダーゼを得るための使用菌としては上記の菌はその一例
である。また本発明の製法における使用菌としては、上
記の菌はその一例であつて、アースロバクター属に属す
るコリンオキシダーゼ生産能力を有するものであればす
べて本発明において使用できる。

もちろん微生物は、自然的、人工的に変異を起こしやす
く、本菌も例外ではないが、これらの変異株であつても
コリンオキシダーゼの生産能力を失わない限り本発明に
使用し得ることはいうまでもないことである。まず本酵
素を得るに当つて、アースロバクター属に属するコリン
オキシダーゼ生産菌による製法について例示すれば、次
の如くである。即ちアスロバクター属に属するコリンオ
キシダーゼ生産菌を、抗生物質、酵素などを生産する通
常の方法で培養する。培養の形態は液体培養でも固体培
養でもよいが、工業的にはコリンオキシダーゼ生産菌の
細胞をその生産用培地に接種し、深部通気攪拌培養を行
なうのが有利である。培地の栄養源としては、微生物の
培養に通常用いられるものが広く使用される。窒素源と
しては利用可能な窒素化合物であればよく、例えばコー
ン●スチープ・りカー、大豆粉、ペプトン、種々の肉工
キズ、酵母工キズ、硫安、塩化アンモニウムなどが使用
される。炭素源としては、同化可能な炭素化合物であれ
ばよく、例えば糖蜜、ブドウ糖、スターチ加水分解物な
どが使用される。その他、食塩、塩化カリウム、硫酸マ
グネシウム、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム
などの種々の無機塩やディスホームＢＣ−５１Ｙ１同Ｃ
Ａ−２００１同ＣＡ−３３０（商品名：日産油脂社製）
などの消泡剤が必要に応じて使用される。また、培地中
にコリンを添加せしめることによつて、培養時コリンオ
キシダーゼの生産能を上昇せしめることが好ましい。こ
のコリンの添加量としては約０．５〜１％程度であり、
この添加によりコリンオキシダーゼの生産性は少なくと
も１０ｆ８以上上昇する。培養温度は菌が発育し、コリ
ンオキシダーゼを生産する範囲内で適宜変更し得るが、
特に好ましくは２５〜３０℃である。培養時間は条件に
よつて異なるが、通常１５〜５叫間程度であつて、コリ
ンオキシダーゼが最高力価に達する時期をみはからつて
適当な時期に培養を終了すればよい。かくして得られた
培養物中において、コリンオキシダーゼはその菌体内に
含有、蓄積されている。

この様にして得られた培養物中よりコリンオキシダーゼ
を抽出し、粗製のコリンオキシダーゼ含有液を得るため
に、例示すれば、まず培養物を固液分離し、得られる湿
菌体を、必要に応じてトリスー塩酸緩衝液などの溶液に
懸濁せしめ、次いで、リゾチーム処理、超音波処理、フ
レンチプレス処理などの種々の菌体処理手段を適宜選択
組合せればよい。

特に、リゾチーム処理により、その収率およびその比活
性は良好となる。次いでこの粗製のコリンオキシダーゼ
含有液を、さらに公知の、蛋白質、酵素などの単離、精
製手段を用いて処理することにより精製されたコリンオ
キシダーゼを得ることができる。

例えば、粗製のコリンオキシダーゼ含有液に、アセトン
、メタノール、エタノール、イソプロパノールなどの有
機溶媒による分別沈澱法、硫安などによる塩析法などを
用いて水溶液から沈澱せしめ、回収すればよい。さらに
この沈澱物を、例えば電気泳動法などにて単一の帯を示
すまで精製すればよく、その精製手段としては目的とす
るコリンオキシダーゼの性質を利用した手段を用いれば
よく、例えば上記の沈澱物をトリスー塩酸緩衝液などの
媒体に溶解し、これをジエチルアミノエチル−セルロー
ス、−デキストランゲル架橋体などの陰イオン゛交換体
、デキストランゲル、ポリアクリルアマイドゲルなどの
ゲル枦過剤によるクロマトグラフ法を行なえばよい。ま
たこれらの手段を適宜組合せて、精製すればよく、次い
でこれを真空凍結乾燥手段などにより乾燥してコリンオ
キシダーゼの精製粉末を得る。このアースロバクター●
グロビフオーミスＢ一０５７７より得られるコリンオキ
シダーゼは次下に述べる理化学的性質を有するものであ
る。

（１）作用 コリンを酸化してベタインアルデヒドとなし、ベタイン
アルデヒドを酸化してベタインとする。

コリンの場合には、１モルのコリンより１モルのベタイ
ンアルデヒドおよび１モルの過酸化水素を生成し、さら
にこのベタインアルデヒドより１モルのベタインおよび
１モルの過酸化水素を生成する。

即ち、１モルのコリンより１モルのベタインおよび２モ
ルの過酸化水素を生成する。またベタインアルデヒドの
場合には、１モルのベタインアルデヒドより１モルのベ
タインおよび１モルの過酸化水素を生成する。

（２）力価の測定法 ０．２Ｍトリスー塩酸緩衝液（ＰＨ８．Ｏ）０．０５Ｔ
ｎ１１３ｍ９１ｍ１の４−アミノアンチピリン０．０５
ｍ１、０．１％フェノール０．０１ｍ１、２ｕ．Ｉｍ９
パーオキシダーゼ（ＰｅｒＯｘｉｄａｓｅ）０．１０、
０．１Ｍ塩化コリン０．１０ｍ１および蒸留水０．１０
ｍ１よりなる反応液０．５０ｍ１に、−酵素溶液５μ′
加え、３ｒＣにて５分間反応させた後これに２．５ｍ１
゛のエタノールを加えて反応を止める。

比色は４８０ｒ１ＷＬで行い、酵素活性は、１分間に１
μＭＯｌｅの過酸化水素を生成する活性を１単位（１Ｕ
ｎ１ｔ１１Ｕ．）とする。また力価の，算出は次式に従
う。酵素活性（Ｕ．Ｉｍｌ）＝ΔＡ４８Ｏ／Ｍｉｎ×１
４（なお、ΔＡ４８Ｏは４８０ｒ１７ＴＬの波長におけ
る１分間の吸光度変化を示す）（３）基質特異性 上記の力価の測定法における測定法を利用して、その反
応液中の塩化コリンの代りに、種々の基質（ベタインア
ルデヒド、Ｎ−メチルアミノエタノール、Ｎ●Ｎ−ジメ
チルエタノーノアミン、モノエタノールアミン、ジエタ
ノールアＪミン、トリエタノールアミン）を用いて、コ
リンに対する相対活性を求めた。

その結果、この酵素は、少なくともコリン、ベタインア
ルデヒドに高い活性を示すものと認められる。

（４）至適ＰＨ トリスー塩酸緩衝液を用いて、コリンオキシダーゼのコ
リンに対する酵素活性を測定した結果、第１図に示す通
りであつて、その至適ＰＨは８付近と認められる。

（５）至適温度 上記の力価の測定法における測定法を利用して、その温
度条件を変えて酵素反応を行ない、コリンオキシダーゼ
のコリンに対する酵素活性を測定した結果、第２図に示
す通りであつて、その至適温度は４（代）付近と認めら
れる。

（６）ＰＨ安定性ＰＨ６〜７はジメチルグルタル酸緩衝
液、ＰＨ７〜８はトリスー塩酸緩衝液、ＰＨ９〜１０は
グリシンー水酸化ナトリウム緩衝液を用いた。

２５ｗＬＭの各ＰＨの緩衝液０．１ｍ１に、酵素溶液（
酵素蛋白質濃度１０μＹｌｍｌ）５μ′を加え、３７℃
にて３０分間放置する。

次いでこれに、０．５Ｍトリスー塩酸緩衝液（ＰＨ８．
Ｏ）０．０５ｍ１を加えてＰＨを調節した後、反応液を
加えて、上記の力価の測定法に従つて、コリンオキシダ
ーゼのコリンに対する酵素活性を測定した結果、第３図
に示す通りであつて、そのＰＨ安定性は８付近と認めら
れる。（７）熱安定性 酵素蛋白質１０μＹｌｍｌを含有してなる１０Ｔｒ１．
Ｍトリスー塩酸緩衝液（ＰＨ８．Ｏ）１ｍ１を各温度に
て１紛間放置し、次いで上記の力価の測定法に従つて、
コリンオキシダーゼのコリンに対する酵素活性（残存活
性）を測定した結果、第４図に示す通りであつて、酵素
は、４０℃付辺では安定であり、４０℃付近を超える温
度では急速に低下するものと認められる。

（８）種々の物質に対する影響 上記の力価の測定法において、種々の添加物を加えて、
コリンオキシダーゼのコリンに対する酵素活性を測定し
た結果、次の通りである。

なお、添加物の内、金属塩の添加量は５ｍＭであり、界
面活性剤の添加量は０．１％ＷｌＶである。トリトン（
ＴｒｌｔＯｎ）Ｘ−１００（界面活性剤：商品名：和光
純薬工業社製） ９５．５アデカトール（Ａ
ｄｅｋａｔＯＩ）ＳＯ−１２０（界面活性．剤：商品名
：旭電化工業社製） １０５．７ラウリル硫酸ナ
トリウム ９４．３デオキシコール酸ナト
リウム ９４．３ツウイーン（Ｔｗｅｅｎ）２
０（界面活性剤：商品名：和光純薬工業社製）
９６．６．ラウリルベンゼンスルホン酸ナトリウ
ム９１．０カチオンＤＴ２Ｏ５（界面活性剤：商品名：
日産油脂社製） ６５．９
（添加物なし） １００．０（
９）分子量８４０００±２１００〔セフアデツクスＧ−
１５０（商品名：フアルマシア社製）ゲル？過法により
測定〕（１ａ）等電点 ４・６（キャリア・アンホライトを用いる電気泳動法に
より測定）１１）電気泳動 ポリアクリルアミドゲル（ＰＨ８．３）を用い、ディス
ク電気泳動法を用いた。

まず、コリンオキシダーゼを電気泳動せしめ、その泳動
終了後のゲルをアミドブラックにて染色した結果、第５
図の１に示す通り、濃青色の一本の帯のみ認められた。

また、コリンオキシダーゼを電気泳動せしめ、その泳動
終了後のゲルを、下記組成よりなる反応液反応液組成（
ただし、上記反応液組成中、呈色試液とは０．１Ｍトリ
スー塩酸緩衝液１０Ｔｎｔ１５ｍ９１ｍ１０−ジアニジ
ン・エタノール溶液０．３Ｔ！Ｌｔｌパーオキシダーゼ
１０Ｕ．よりなる組成の試液を示し、基質溶液とは基質
である塩化コリンまたはベタインアルデヒドの水溶液を
示す。

）に浸し、３ｒＣ１２０〜３紛間放置して、現われる帯
を確認した。その結果、基質溶液として塩化コリンを用
いた酵素反応生成物による染色は、第５図の２に示す通
りであつて、赤色の一本の帯が認められ、また基質溶液
としてベタインアルデヒドを用いた酵素反応生成物によ
る染色は、第５図の３に示す通りであつて、赤色の一本
の帯が認められた。さらに、これらの染色されたゲルは
水洗後７％酢酸に浸し固定する。さらにまた、この第５
図の１，２，３より明らかな通り、ゲル上に示された泳
動度は全て同一であり、単一の帯を認めることにより、
このコリンオキシダーゼは単一の蛋白質であることか確
認された。

１２）作用機序の確認試験 コリンあるいはベタインアルデヒドを０．０１〜０．０
５μＭＯｌｅｌトリスー塩酸緩衝液（ＰＨ８．Ｏ）１０
μＭＯＩｅｌ４−アミノアンチピリン１５０μｙ１フェ
ノール１００Ｐｙ１パーオキシダーゼ０．２Ｌ１．、コ
リンオキシダーゼ０．２５Ｕ．を含有する反応液０．５
ｍｌを、３７℃、２紛間反応せしめ、しかる後２．５ｍ
１のエタノールを加えて４８０ｒ１ｒｒ１，にて吸光度
を測定した。

また、コリン、ベタインアルデヒドの代りに、定量の過
酸化水素を加えて同様に行なつて、検量線を求めた。

その結果は第６図に示す通りであつて、図中、Ｏ−０は
基質としてコリンを用いた場合の測定結果であり、●−
●は基質としてベタインアルデヒドを用いた測定結果で
あり、さらにΔ−Δは基質の代りに過酸化水素を用いた
検量線を示す測定結果であり、これらの図は酵素がコリ
ン１モルより過酸化水素２モルを生成する反応およびベ
タインアルデヒド１モルより過酸化水素１モルを生成す
る反応を触媒することを示すものである。

また上記試料にて、酵素電極を用いて酸素の消費量を測
定した結果、コリン１モルが酸化されるとき酸素２モル
が消費され、ベタインアルデヒド１モルが酸化されると
き酸素１モルが消費されることを確認した。さらに上記
試料の反応終了物より生成したベタインの定量は、該反
応終了物をまずＰＨｌに調節し、次いでこれを活性炭処
理した後１０酷濃縮して、これをライネツケ塩（Ｒｅｉ
ｎｅｃｋｅＳａｌｔ）法により定量して行つた、コリン
１モルよりベタイン１モル、ベタインアルデヒド１モル
よりベタイン１モルが生成されることを確認した。

以上の通り、このコリンオキシダーゼは、コリンおよび
ベタインアルデヒドに作用して酸化せしめる際、補酵素
を必要とせず、直接酸素と反応せしめ、過酸化水素を生
成せしめること、またその分子量が８４０００±２１０
０１その等電点が４．６であることなどの理化学的性質
より、公知のコリンデヒドロゲナーゼやベタインアルデ
ヒドゲナーゼと異なつたものと認められ、このコリンオ
キシダーゼは新規な酵素と認められる。

また上記の理化学的性質の酵素の作用機序の確認試験に
使用した定量手段はその一例であるが、以下に述べる通
り、このコリンオキシダーゼは上記の確認試験と同様な
定量手段、例えば過酸化水素の定量、生成するベタイン
の定量、消費された酸素の定量などの手段を用いること
により、コリンまたはベタインアルデヒドを含有してな
る液体の分析を可能ならしめたものである。

またこの酵素はコリンやベタインアルデヒドの試薬の純
度測定、コリンやベタインアルデヒドの誘導体を分解せ
しめて生成するコリンやベタインアルデヒドを測定して
なるコリンやベタインアルデヒドの誘導体の定量、コリ
ンやベタインアルデヒドの誘導体を分解してコリンやベ
タインアルデヒドを生成せしめる酵素の活性測定などの
酵素的定量の方法を提供するものである。

本発明に使用されるコリンまたはベタインアルデヒドを
含有してなる液体とは、コリンまたはベタインアルデヒ
ドそのものの水または水性媒体の溶液であつてもよく、
またコリンまたはベタインアルデヒドの誘導体であつて
、この誘導体よりコリンまたはベタインアルデヒドを遊
離せしめたものであつてもよい。

また上記水性媒体として、好ましくは、コリンオキシダ
ーゼに対し阻害効果を及ぼさない、例えばトリスー塩酸
緩衝液が挙げられる。さらにコリンの誘導体としては、
例えば生体内においてリン脂質として知られている、リ
ゾレシチン、レシチン、スフィンゴミエリンさらにアセ
チルコリン、シチジンリン酸コリン、ホスホリルコリン
などの生体内成分や、ベンゾイルコリン、プロピオニル
コリン、ブチリルコリン、サクシニルコリンなどの合成
物であつて、要は化学的または酵素的手段にてコリンを
遊離し得るそれらの誘導体であればよい。またこれらの
誘導体よりコリンを遊離せしめる手段としては、例えば
アル”カリ分解又は酸分解などの化学的手段が挙られ、
またクロストリジウム●ウエルチ（ＣｌＯｓｔｒｉｄｉ
ｕｒｎｗｅｌｃｈｉｉ）、バチルス セレウス（Ｂａｃ
ｉｌｌｕｓｃｅｒｅｕｓ）などのホスホリパーゼＣ（Ｐ
ｈＯｓｐｈＯｌｌｐａｓｅＣ）と牛、プタ、ニワトリの
小・腸粘膜、牛の肝臓、エシエリシア・コリー（ＥｓＯ
ｈｅｒｉｃｈｉａｃＯｌｌ）などのアルカリホスファタ
ーゼ（ＡｌｋａｌｉｎｅｐｈＯｓｐｈａｔａｓｅ）との
組合せ、キャベツ、ストレプトマイセス●ハチジヨウエ
ンシス（ＳｔｒｅｐｔＯｍｙｃｅｓｈａｃｈｉｊＯｅｒ
ｌｓｉｓ）Ａｌｌ４λストレプ）トマイセス●クロモフ
スカス（ＳｔｒｅｐｔＯｍｙｃｅｓＣｈｒＯｍＯｆＬｌ
ＳＣＵＳ）Ａ−０８４８などのホスホリパーゼＤ（Ｐｈ
ＯｓｈＯｌｉｐａｓｅＤ）、牛血球、電気ウナギ、馬血
清、人血清などのコリンエステラーゼ（ＣｈＯｌｌｎｅ
ｅｓｔｅｒａｓｅ）などの酵素的手段が＄６Ｌる。

なお上記の酵素およびその由来は何んら限定されるもの
でなく、各々ホスホリパーゼＣ１アルカリホスファター
ゼ、ホスホリパーゼＤ１コリンエステラーゼの活性を有
しているものであればよい。さらに詳しく述べれば、例
えばホスホリパーゼＣとアルカリホスファターゼによる
レシチンに対する反応は、次式に示す通りであつて、レ
シチンはホスホリパーゼＣにより、ジグリセリドとホス
ホリルコリンに加水分解され、さらにこのホスホリルコ
リンはアルカリホスファターゼにより無機リン酸とコリ
ンに分解されるものである。

またホスホリパーゼＤによるレシチンに対する反応は次
式に示す通りであり、レシチンはホスホリパーゼＤによ
りホスフアチジン酸とコリンに加水分解されるものであ
る。

さらにコリンエステラーゼによるベンゾイルリンに対す
る反応は、次式に示す通りであり、ベンゾイルコリンは
コリンエステラーゼにより安息香酸とコリンとに分解さ
れるものである。

上記の酢酸は一例であつて、さらにコリンまたはベタイ
ンアルデヒドの誘導体よりコリンまたはベタインアルデ
ヒドを遊離し得る手段であれば、如何なる手段であって
もよい。なお、これらの前処理を必要とするコリンまた
はベタインアルデヒドの誘導体を用いて対応する酵素を
作用せしめるに当って、その処理は別の工程として先に
行なってコリンまたはベタインアルデヒドを遊離せしめ
、これをコリンまたはベタインアルデヒドを含有する液
体としてもよく、または上記の酵素反応が短時間てある
ため、別工程とすることなく、対応する酵素および目的
とするコリンオキシダーゼとを同時に加えて、以下に述
べる操作を行なう。この様にして用意された、コリンま
たはベタインアルデヒドを含有する液体に、コリンオキ
シダーゼを作用せしめるのであるが、このコリンオキシ
ダーゼは、緩衝液に溶解した溶液であつてもよく、さら
にその酵素活性を劣化せしめない状態にて、マイクロカ
プセル化手段、樹脂または多糖類などとの共有結合手段
、吸着手段などの公知の酵素固定化手段を施したものて
あつてもよい。

またこのコリンオキシダーゼの添加量としては、試料の
量などによつて異なるが、酵素による反応時間を好適な
短時間とせしめるに、１単位以上であればよく、好まし
くは１．５〜５単位程度である。また用いるコリンオキ
シダーゼの比活性は高いものほど反応にとつて良好であ
ることは言うまでもないことてあるが必すしも最高純度
のものを要求するものではない。このようにして、該液
体にコリンオキシダーゼを添加して、一定時間インキユ
ベイトした該液体中には、過酸化水素およびベタインが
生成され、対応した酸素の減少が起きる。

次いで、これらの過酸化水素、ベタイン、酸素の測定を
行なうのであるが、酸素の測定については、上記した通
り、酸素電極を用いる方法が最も簡便であり、ベタイン
についても一例として上記したライネツケ塩法が好まし
く、またベタインをエステル化してガスクロマトグラフ
ィーなどによる測定方法もある。また過酸化水素の測定
法としては好ましくは過酸化水素と反応してその色調に
変化を生する１種もしくは２種以上の呈色剤からなるシ
ステムによつて、比色測定によつて測定することが好ま
しい。測定する方法としては、例えば、生成する過酸化
水素と反応して安定した赤色を形成する４価のチタン化
合物とキシレノールオレンジによる反応、或はフェノー
ル、４−アミノアンチピリンおよびパーオキシダーゼに
よる反応などを利用する方法などが挙られる。このフェ
ノール、４−アミノアンチピリン、パーオキシダーゼに
よる反応を利用する過酸化水素の測定において、フェノ
ールはコリンオキシダーゼの活性を阻害するため、最小
限の濃度とすることが好ましく、また４−アミノアンチ
ピリンは生成する過酸化水素量に対し１１２モル以上、
好ましくは２モル以上、さらにパーオキシダーゼは０．
１ｕ以上、好ましくは０．２〜０．５Ｕ程度使用するこ
とが望ましい。さらにまた４−アミノアンチピリンの代
りに４−アミノフエナゾーンを用いてもよく、これらの
各試薬は溶液としてあらかじめ混合、調製すればよい。
このようにして呈色せしめた色調を適当な波長にて測定
し、その検量線より存在する過酸化水量を定量し、存在
するコリンまたはベタインアルデヒドもしくはコリンの
誘導体またはベタインアルデヒドの誘導体の定量、また
はコリンの誘導体を加水分解する酵素活性などの定量を
行なう。また上記の方法以外に、２●６ージクロルフェ
ノールインドフェノールとパーオキシダーゼの組合せに
よる過酸化水素の定量測定、グアヤク脂とパーオキシダ
ーゼの組合せによる過酸化水素の定量測定、ホモバニリ
ン酸とパーオキシダーゼの組合せによる過酸化水素の定
量測定など種々の方法が挙げられる。上記の過酸化水素
、ベタイン、酸素の定量において、特に過酸化水素の定
量、さらに過酸化水素をパーオキシダーゼおよび呈色剤
によつて定量する方法が簡便かつ正確てあるため好まし
い。

従つて、この過酸化水素、ベタイン、酸素の測定値、お
よびそれらの検量線より、使用した液体中のコリンまた
はベタインアルデヒドの量的関係を求めればよく、コリ
ンまたはベタインアルデヒドそのものである試薬などの
純度測定においては・そのままの値から容易に求められ
、コリンなどの誘導体を用いて酵素などにて処理した場
合においては、測定値からコリン誘導体の量的関係を求
めるか、測定値から使用した酵素活性の関係を求めるこ
とによつて分析されるものである。また上記分析法は、
コリンオキシダーゼによるコリンのベタインアルデヒド
を経由したベタインへの酸化反応を利用した分析手段を
挙けたものであるが、またこの酸化反応過程の中間生成
物たるベタインアルデヒドまたはその生成量に対応する
）過酸化水素を定量してコリンの定量を行つてもよい。

しかしこの生成したベタインアルデヒドはさらにコリン
オキシダーゼにより酸化され過酸化水素を生じるため、
測定誤差を生じる欠点を有しており、そのため生成した
ベタインアルデとドがコリンオキシダーゼによつて次工
程の酸化作用を受けないような反応阻害剤、例えばベタ
インアルデヒドと容易にシッフ塩基などを形成する阻害
剤やベタインアルデヒドデヒドロゲナーゼとＮＡＤまた
はＮ，ＡＤＰとによる反応系路を変更せしめるコリンオ
キシダーゼのベタインへの阻害剤を添加するなどの方法
が推定される。さらに、これらの分析法において使用さ
れる種々の組成は適宜選択変更されるものであつて、ま
たこの分析法はその分析の目的に応じて、それぞれ適宜
選択された組成を有するキットとして組立てられるもの
である。

また上記の分析法において使用する、リン脂質よりコリ
ンを遊離せしめるホスホリパーゼＤについて詳しく述べ
る。使用するホスホリパーゼＤとしては、ストレプトマ
イセス●ハチジヨウエンシスＡｌｌ４廂株やストレプト
マイセス●クロモフスカスＡ−０８４８菌株由来の酵素
が挙られ、これらの菌株は、工業技術院微生物工業技術
研究所に各々微生物受託番号「ＦＥＲＭ−ＰＮＯ．ｌ３
２９」（特開昭４８−９９３８６号）、「ＦＥＲＭ，−
ＰＮＯ．３５ｌ９」として寄託されている。特にストレ
プトマイセス・クロモフスカスＡ−０８４８菌株「ＦＥ
ＲＭ−ＰＮＯ．３５ｌ９」の菌学的性状、培養手段、精
製手段、さらに得られるホスホリパーゼＤの理化学性質
などを述べれば、次の通りである。菌学的性状（ａ）形
態 肉眼観察によれば、胞子を形成した気菌糸は灰色を呈し
、基生菌糸は黄褐色ないし黄橙色を呈し、可溶性色素は
通常生成しない。

スターチ、無機塩寒天培地上で、３０℃、１０〜１５日
間培養観察し、顕微鏡観察した所見は次の通りである。

気菌糸は直径０．６〜０．８μ、波状で単純分枝をなし
て伸長し、多数の胞子の連鎖を形成する。こ胞子の連鎖
は通常ゆるく１〜３回巻いた螺旋を形成（Ｓｐｉｒａｌ
ｅｓ）し、まれに４〜５回巻いた螺旋もみられ、またと
きには波状または直状で螺旋を形成しないもの（ＲＦ）
もみられる。胞子は球形ないし楕円形で、大きさは０．
６〜０．８×０．７ｔ〜０．９μであり、表面にとげ状
の突起を形成している。基生菌糸は分枝をもつて屈曲状
に伸長し、直径０．４〜０．６μで、菌糸の分裂や胞子
の着生は認められない。鞭毛胞子や胞子のうの着生も認
められない。ｂ）全菌体分析によるジアミノピメリン酸
の分析ベネツツ（Ｂｅｎｌｌｅｔｔ′ｓ）培地で６日間
振盪培養した菌体をベツカー（Ｂｅｃｋｅｒ）らの方法
〔アプライド マイクロバイオロジー（Ａｐｐｌｌｅｄ
ＭｉｃｒＯｂｌＯｌＯｇｙ）？（５）４２１〜４２３（
１９６４）〕で分析した結果、ＬＬ−ジアミノピメリン
酸が検出され、メソ（ＭｅｓＯ）一型は検出されなかつ
た。

→ 下記の培地を用い、３０℃、２０日間培養観察した
性状は、次に示す通りであつて、色の表示は「カラー●
ハーモニ●マニュアル」に従つた。

（１）シユクロース・削酸塩寒天培地 生育：僅少、無
色。

気菌糸：僅少。

可溶性色素：生じない。

（２）グリセリン・硝酸塩寒天培地 生育：中程度ないし良好、パステル・オレンジ（Ｐａ
ｓｔｅＩＯｒ′Ａｎｇｅ；４１ｃ）。

気菌糸：生じない、ないし僅少。 可溶性色素；ヌー
ド●タン（ＮｕｄｅＴａｎ；招０、僅かに生じる。

（３）グルコース・アスパラギン寒天培地 生育：中程
度、バンプー（ＢａｎｂＯＯ；２ｆｂ）ないしアンパー
（Ａｍｂｅｒ；３ｐｅ）。

気菌糸：貧弱ないし中程度、ホワイト （Ｗｈｉｔｅ；ａ）。

可溶性色素：生じない。

（４） グリセリン・アスパラギン寒天培地 生育：中
程度、ゴールデン・ブラウン（ＧＯＩｄｅｎＢｒＯｗｎ
；３ｐｇ−３ｐｉ）。

気菌糸：中程度、シルバー・グレイ（ＳｉｌｖｅｒＧ
ｒａｙ；３ｆｅ）ないしナチユラル（Ｎａｔｕｒ′ａｌ
；３ｄｃ）。

可溶性色素：生じない。

（５）スターチ・無機塩寒天培地 生育；中程度ないし良好、ゴーデン・ブラウン（３ｐ
ｉ）ないしクロブ・ブラウン（ＣｌＯｖｅＢｒＯｗｒｌ
；３ｐ１）。

気菌糸：中程度ないし良好、シルバー・グレイ（３ｆ
ｅ）ないしナチユラル（３ｄｃ）、一部ホワイト（ａ）
。

可溶性色素：生じない。

（６）チロシン寒天培地 生育：中程度ないし良好、ゴーデン・ブラウン（３ｐｇ
−３ｐｉ）。

気菌糸：中程度ないし良好、シルバーグレイ（３ｆｅ）
ないしナチユラル（３ｄｃ）。

可溶性色素：生じない。 こ（７）グ
リセリン●スターチ●グルタメイト寒天培地生育：中程
度ないし良好、ルスト・タン （ＲｕｓｔＴａｎ５ｇｃ）ないしメイプル（Ｍａｐｌｅ
；４１ｅ）。

１気菌糸：中程度、オイスター・ホワイ
ト（０ｙｓｔｅｒＷｈｉｔｅ；ｂ）ないしライト・グレ
イ（Ｌｔ．Ｇｒａｙ；Ｃ）。

可溶性色素：生じない。

（８）オート・ミル寒天培地 １生育：
中程度ないし良好、マスタード・コールド（Ｍｕｓｔａ
ｒｄＧＯｌｄ；２ｒ１ｅ）ないしゴーデン・ブラウン（
３ｐｇ）。

気菌糸：中程度ないし良好、ナチユラル （３ｄｃ）ないしベイジ・ブラウン（Ｂｅｉｇｅ２Ｂｒ
Ｏｗｎ；３１ｇ）。

可溶性色素：生じない。

（９） イースト・麦芽寒天培地 生育：中程度ないし良好、アンパー （３１ｃ）ないしイエロー●メイプル（ＹｅｌｌＯｗ二
ＭａｐＩｅ；３ｎｇ）０気菌糸：中程度、シルバー・グ
レイ （３ｆｅ）ないしベイジ・ブラウン（３１ｇ）ないしベ
イジ（３ｇｃ）。

可溶性色素：生じない。

（１０）栄養寒天培地 生育：中程度、アンパー（３ｐｅ）。

気菌糸：僅少ないし貧弱、ホワイト（ａ）。

可溶性色素：生じない。（１１）ペプトン・イースト・
鉄寒天培地生育：中程度ないし良好、無色、裏面：ゴー
ルデン●ブラウン（３ｐｇ）。

気菌糸：生じない。

可溶性色素：ゴールデン・ブラウン（３ｐｇ−３ｐｉ）
。

（１２）トリプトン・イーストエキス培地生育：良好、
アンパー（３ｒ１ｃ−３ｐｃ）。

気菌糸：生じない。可溶性色素：生じない、ないしゴー
ルデ ン・ブラウン（３ｐｇ）。

（１３）グルコース●ペプトン●ゼラチン培地 生育：
貧弱、ゴールデン●ブラウン（３ｐｇ）。

気菌糸：生じない。

可溶性色素：ゴールデン・ブラウン （３ｐｉ）。

（１４）脱脂乳培地 生育：良好ないし極めて良好、ライト・アンパー（Ｌ
ｔＡｍｂｅｒ；３ｊｃ）ないしライト●タン（ＬｔＴａ
ｎ；３ｇｃ）。

気菌糸：生じない。

可溶性色素：メイプル（４１ｅ）ないしパステル●オ
レンジ（４１ｃ）。

（ｄ）生理的性状 （１）メラニン様色素の生成：ペプトン●イースト 鉄
寒天培地で陽性、トリプトン・イーストエキス培地で凝
陽性、チロシン寒天培地で陰性。

（２）ゼラチンの液化：グルコース●ペプトン●ゼラチ
ン培地で陽性。

（３）スターチの加水分解：スターチ・無機塩寒天培地
で陽性。

（４）脱脂乳：凝固；陰性、ペプトン化：陽性（５）炭
素源の同化性：Ｄ−グルコース、Ｌ−アラビノース、Ｄ
−マンニット、Ｌ−ラムノース、Ｄ−キシロースは陽性
、イノシトール、ラフィノースは凝陽性、シユクロース
は陰性。

（６）生育温度：１０〜４ＴＣ 以上の通り、本菌株は分裂を生じない真性の基生菌糸よ
り、多数の胞子の連鎖をもつ気菌糸を生じ、また菌糸の
直径および胞子の大きさ、さらに細胞壁にＬＬ−ジアミ
ノピメリン酸を含有することなどよりストレプトマイセ
ス属に属するものと認められる。

また本菌株の特徴として、気菌糸は灰色を呈し、胞子の
連鎖は主として螺旋を形成し、胞子の表面はとげ状を呈
し、基生菌糸は黄褐・色ないし黄橙色で、通常可溶性色
素を生成せず、メラニン様色素はペプトン・イースト・
鉄寒天培地で生成し、チロシン寒天培地では生成しない
こと、および炭素源の同化能は比較的広範囲に及んでい
ることなどが挙られ、このような挿凄を有ナる菌種を種
々の文献より検索すれば、ストレプトマイセス●クロモ
フスカス〔プロブレムス●オブ・クラシフイケイシヨン
・オブ・アクチノマイセテスーアンダゴニスツ（ＰｒＯ
ｂｌｅｍｓＯｆｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉＯｎＯｆａＣ
ｔｉｒＫ）ＭｙＣｅｔｅＳ−ＡｎｔａｇＯｎｉｓｔｓ）
１７６−１７７（１９５７）、インターナショナル・ジ
ャーナル●オブ●システマテイク●バクテリオロジー（
ＩｎｔｅｒｒｌａｔｉＯｒｌａＩＪＯＵｒ′ＴｌａｌＯ
ｆＳｙｓｔｅｍｔｉｃＢａｃｔｅｒｌＯｌＯｇｙ）？４
）３０７−３０９（１９６８）、アプライド マイクロ
バイオロジー（ＡｐｐｌｌｅｄＭｉｃｒＯｂｌＯｌＯｇ
ｙ）？５２−７９（１９５８）〕が類似菌４として挙ら
れ、さらに本菌株とストレプトマイセス・クロモフスカ
スとを詳細に比較すれば、形態的にはストレプトマイセ
ス●クロモフスカスの方が螺旋の形成がやや良好なこと
、培養的性状においてグリセリン・スターチ・グルタメ
イト寒天培地およびグリセリン・硝酸塩培地上で可溶性
色素の生成の有無などの相違が両菌株の比較実験にて認
められたものの、これらの多少の相違は菌株間の相違と
認め、他の諸性状においてはよく一致していることより
、本菌株をストレプトマイセス●クロモフスカス（プレ
オブラソエンスカラ●エト●オル）プリダム●エン●オ
ル〔ＳｔｒｅｐｔＯｍｙｃｅｓＣｈｒＯｍＯｆｌｌＳＣ
ＵＳ（ＰｒｅＯｂｒａｚｈｅｎｓ′Ｋａｙａｅｔａｌ）
Ｐｒｉｄｈａｍｅｔａｌ〕に属するものと同定し、本菌
株をストレプトマイセス・クロモフスカスＡ−０８４８
と命名した。次いで、本菌株を培養してホスホリパーゼ
Ｄを得るに当つて、本菌株を、酵素を生産する通常の方
法で培養すればよく、その培養の形態は通常液体培養を
行なうが、工業的には深部通，気攪拌培養を行なうのが
有利である。培地の栄養源としては、微生物の培養に通
常用いられるものが広く使用され得る。炭素源としては
同化可能な炭素化合物であればよく、例えばブドウ糖、
シヨ糖、乳糖、スターチ、デキストリン、糖蜜、グリセ
リンなどが使用される。窒素源としては、利用可能な窒
素化合物であればよく、例えばコーン・スチープ・りカ
ー、大豆粉、綿実粉、小麦グルテン、ペプトン、肉工キ
ズ、酵母工キズ、乾燥酵母、力ティン加水分解物などが
使用される。その他、リン酸塩、マグネシウム、カルシ
ウム、カリウム、鉄、マンガン、亜鉛などの塩類が必要
に応じて使用される。培養温度は本菌が発育し、ホスホ
リパーゼＤを生産する範囲内で適宜変更し得るが、特に
好ましくは２５〜３０℃であり、また培養時間は条件に
よつて異なるが、ホスホリパーゼＤが最高力価に達する
時期をみはからつて適当な時期ノに培養を終了すればよ
く、通常、２〜４日程度である。このようにして得られ
た培養物からホスホリパーゼＤを採取するのであるが、
本酵素は水に易溶性であつて、主として培養液中に存在
する。培養液中に存在するホスホリパーゼＤは、培養戸
液を濃縮するか、もしくは濃縮することなく可溶性塩類
、例えば硫安などで半飽和または飽和沈澱させるか、ま
たは親水性有機溶媒、例えばメタノール、エタノール、
アセトンなどを添加することにより沈澱させることがで
きる。沈澱物は水または緩衝液に溶解し、半透膜で透析
することにより低分子不純物を除去することができる。
また吸着剤、イオン交換体あるいはゲルろ過剤などを用
いて不純物を除去してもよい。これらの手段により得ら
れる酵素溶液を、減圧濃縮、凍結乾燥などの操作により
処理して固形の粗製ホスホリパーゼＤを得ることができ
る。さらにこの粗製ホスホリパーゼＤは、蛋白質、酵素
などの精製に通常用いられる手段、例えば吸着剤、イオ
ン交換体、ゲル淵過剤などを用いて精製され、さらにジ
エチルアミノエチルセルロースおよびデキストランゲル
架橋体（商品名：セフアデツクスＧ−５０）カラムクロ
マトグラフィーにより精製される。次にホスホリパーゼ
Ｄの理化学性質について述べる。（１）作用 リン脂質のリン酸と含窒素塩基とのエステル結合に作
用してリン化合物と相当する含窒素塩基と遊離する。

レシチンについての作用を例示すれば次式の通りである
。（２）力価の測定法０．２Ｍトリスー塩酸緩衝液（Ｐ
Ｈ８．Ｏ）０．１ｍ１１１０ｒｒＬ，Ｍレシチンエマル
ジョン０．１ｍ１１０．１Ｍ塩化力１ルシウム０．０５
ｍ１１１％トリトンＸ−１０００．１ｎｔ１水０．１ｍ
１よりなる反応液に、酵素溶液０．０５ｍ１を加え３Ｔ
Ｃ１１紛間反応させた後、５分間煮沸して反応を停止し
た。

次いで反応液を３７℃まで冷却し、これに、４−アミノ
アンチピリン１（３ｍｇノＭＬ）０．１ｍ１、２Ｕ．Ｉ
ｍ１パーオキシダーゼ０．１Ｔｎｔ．．０，１％フェノ
ール０．１ｎｔ１１２ｕ．Ｉｍ１コリンオキシダーゼ０
．１ｍ１、水０．１ｍ１を加えて３７℃、２０分間反応
せしめた後１％トリトンＸ−１００２ｍ１を加え、５０
０ｒ１ＷＬの吸光度を求めた。ホスホリ２パーゼＤｌｌ
単位（Ｕｎｉｔ．Ｕ．）は１分間に１ｐｍ０１ｅのコリ
ンを生成せしめる酵素活性と定めた。また力価の算出は
次式に従つた。 Ｕ．Ｉｍｌ＝ΔＡ５ＯＯ×０．５５ （式中、ΔＡ５ＯＯは５００ｎｒｎ，における吸光度を
示＝す）（３）基質特異性 上記の力価の測定の反応液において、基質としてレシチ
ン、リゾレシチン、スフィンゴミエリンのエマルジョン
（１０ｍＭ．．０．１ｍ１）を用，い、同様の操作を行
ない、コリンの定量をして、リゾレシチンに対する酵素
作用を１００として相対活性を求めた。

４．、一，−．（４）ＰＨ安定性ＰＨ５：
酢酸緩衝液、ＰＨ６〜７：ジメチルグルタル酸一水酸化
ナトリウム緩衝剤、ＰＨ８〜９：トリスー塩酸緩衝液、
ＰＨｌＯ：グリシンー水酸化ナトリウＬ緩衝液（各々１
０ｍＭ）の各ＰＨで、酵素溶液（１ｍｇＩｍ１）を、３
７℃、６０分間インキユベイトした後、上記の力価の測
定法に従つてホスホリパーゼＤの活性を求めた結果、第
７図に示す通り、酵素はＰＨ７〜９で比較的安定である
と認められる。

））至適ＰＨ ＰＨ６〜７．５：ジメチルグルタール酸一水酸化ナトリ
ウム緩衝液、ＰＨ７〜９：トリスー塩酸緩衝液、ＰＨ９
〜１０：グリシンー水酸化ナトリウム緩衝液の各々の緩
衝液を用い、上記の力価の測定法に従つてホスホリパー
ゼＤの活性を求めた結果、第８図に示す通りであつて、
その至適ＰＨは７．５〜８付近と認められる。

。３）熱安定性 １０７ＴＬＭトリスー塩酸緩衝液（ＰＨ８．Ｏ）、酵素
溶液濃度（１ｍ９１ｍｔ）の条件で、４０、５０、６０
、７へ８０℃の各々の温度にて１紛間インキユベイトし
た後、上記の力価の測定法に従つてホスホリパーゼＤの
活性を求めた結果、第９図に示す通りであつて、酵素は
７０℃まで安定である。

７）血清リン脂質への作用 条件１の試料 ０．２Ｍトリスー塩酸緩衝液（ＰＨ８．Ｏ） ０．２ｍ
１市販品血清 ０．５ｍ１０．１
ＭＣａＣ１２０．Ｉｍ１６０ｕ．Ｉｎｔホスホリパーゼ
ＤＯ．ｌｍｌ蒸留水 ０．１
ｍ１条件２の試料０．２Ｍトリスー塩酸緩衝液（ＰＨ８
．Ｏ） ０．２ＴｒＬ１市販品血清
０．５７７！ＴＯ．ｌＭＣａＣｌ２Ｏ．ｌｍｌ６Ｏ
Ｕ．ｌｎＬホスホリパーゼＤＯ．ｌｌｎｔホスフアチジ
ン酸ホスファターゼ 加，蒸留水
０．１ｎｔ条件３の試料０．２Ｍトリスー塩
酸緩衝液（ＰＨ８．Ｏ） ０．２ｎｔ市販品血清
０．５ｍ１０．１Ｍｃａｃ１２０．１
Ｔ１Ｌｔ蒸留水 ０．２ｆｔ
Ｚなお、上記各条件における試料に用いた、市販品血清
はハイランド（Ｈｙｌａｎｄ）社製の製品であり、ホス
フアチジン酸ホスファターゼはストレプトマイセス リ
ラビリス（ＳｔｒｅｐｔＯｍｙｃｅｓｍｉｒａｂｉｌｉ
ｓ）Ａ−２３１３菌株より得られたホスフアチジン酸ホ
スファターゼ（特開昭５０−１４２７（９）号）である
。

上記の条件で、１、２および３の試料を３７℃、３紛間
反応せしめた後、各々にクロロホルム；メタノール（２
：１）６ｍ１、次いで水１ｍ１を加えて充分混合し、３
０００ｒｐｍ１１紛間遠心分離し、そのクロロホルム層
を回収した。

このクロロホルム層を減圧乾固し、シリカゲルＧ（東京
化成工業社製）にて薄層クロマトグラフィーを行ない（
展開溶媒；クロロホルムニメタノールニ水＝６５：２５
：３）、プレート乾燥後、モリブデンブルー試薬により
、リン脂質の確認を行なつた。また、標準リン脂質とし
て、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジル
コリン、スフィンゴミエリン、リゾホスフアチジルコリ
ン、ホスフアチジン酸を用いて、上記と同一の条件で薄
層クロマトグラフィーを行なつた。その結果は、第１０
図に示す通りであつて、１は条件１の試料のスポット、
２は条件２の試料のスポット、３は条件３の試料のスポ
ット、４はホスファチジルエタノールアミン、ホスファ
チジルコリン、スフィンゴミエリンおよびリソホスフア
チジルコリンよりなる標準リン脂質のスポット、５はホ
スフアチジン酸である標準−リン脂質のスポットを示し
、Ａは標準リン脂質より判明したホスファチジルエタノ
ールアミンのスポット、Ｂは同様ホスファチジルコリン
、Ｃは同様スフィンゴミエリン、Ｄは同様ホスフアチジ
ン酸、Ｅは同様リゾホスフアチジルコリンを示す。

第１０図より、血清（条件３の試料）中にはホスファチ
ジルエタノールアミン、ホスファチジルコリン、スフィ
ンゴミエリンおよびリゾホスフアチジルコリンが存在す
ることが明らかである。この血清にホスホリパーゼＤ，
を作用せしめる（条件１の試料）とホスフアチジン酸の
み存在する。さらにこの血清にホスホリパーゼＤおよび
ホスフアチジン酸ホスファターゼを作用せしめる（条件
２の試料）と全くスポットが見られないことより、血清
中のリン脂質はホスホリパーゼＤによりホスフアチジン
酸にまで分解され、さらにこのホスフアチジン酸がホス
フアチジン酸ホスファターゼにより無機リン酸とジグリ
セリドに分解されたと推定される。またこの結果は、こ
のホスホリパーゼＤが、血清中のホスフアチジンエタノ
ールアミンをも基質とし得る酵素であることを示してい
る。このホスホリパーゼＤ即ちストレプトマイセス・ク
ロモフスカスＡ−０８４８菌株より得られるホスホリパ
ーゼＤは、ストレプトマイセス●ハチジヨウエンシスＡ
ｌｌ４３菌株より得られるホスホリパーゼＤ（特開昭４
８−９９３８６号）よりも至適ＰＨ，．ＰＨ安定性、熱
安定性においてより優れており、さらにストレプトマイ
セス・ハチジヨウエンシスＡｌｌ４３菌株はホスホリパ
ーゼＤのほかにホスホリパーゼＣをも生産する（特開昭
４９一５５８９３号）ため、ほぼ完全な精製を行なわな
い限り、その最終標品にホスホリパーゼＣの混入を伴い
、これによる副反応を生じる欠点を有している。

従つて、本発明に使用されるリン脂質の分析定量用のホ
スホリパーゼＤとしてはストレプトマイセス・クロモフ
スカスＡ−０８５８菌株より得られるホスホリパーゼＤ
が好ましい。次に、本発明におけるコリンオキシダーゼ
の製法およびその酵素を用いてなる種々の分析法、分析
用組成物について具体的に述べるが、本発明はこれらに
よつて何んら限定されるものではない。実施例１コリン
１．０％、ＫＣｌＯ．５％、Ｋ２ＨＰＯ４Ｏ．ｌ％、Ｍ
ｇＳＯ４・７Ｈ２００．０５％、酵母工キズ０．２５％
、フイシユ●ソルブル（ＦｉｓｈｓＯｌｕｂｌｅ）１．
０％、デスホームＣＡ−２２００．１％よりなる培地１
００ｍ１（ＰＨ７．２）を５００ｍｔ容三角フラスコに
加え、１２０℃、２紛間滅菌処理し、次いでこれにアー
ス［：］／くクター・グロビフオーミスＢ−０５７７菌
株を接種し、３０℃、１日間培養して種菌を得た。

次いで、この種菌を、上記と同一組成を有す培養液１０
ｅを有してなる滅菌後の３０′容シャー・フアメンター
に移植し、３０゜Ｃ１２日間、２００ｒ′Ｐｍｌ２Ｏｅ
Ｉｍｉｎの滅菌空気の条件下通気攪拌培養し、得られる
培養液を塩心分離して集菌し、この菌体を１０７Ｔｔ．
Ｍトリスー塩酸緩衝液（ＰＨ８．Ｏ）、２７ｎＭＥＤＴ
Ａ（エチレンジアミンテトラアセテイクアシド）、１％
ＫＣｌよりなる溶液１ｅにて洗浄した。この洗浄菌体を
１ｅの１０７ＴＬＭリン酸緩衝液（ＰＨ７．Ｏ）、２７
ｎＭＥＤＴＡ１１％ＫＣｌよりなる溶液に懸濁し、これ
にリゾチーム（長瀬産業社製、塩化リゾチーム）２００
ｍｇを加え、３７帽℃、３吟間攪拌した。リゾチーム処
理後、溶液を５０００ｒ′Ｐｍｌｌ紛間遠心分離し、得
られた上清液にアセトン１ｅを加えて析出する不純物を
遠心にて除去し、さらにこれにアセトンを加えて６５％
アセトン濃度とし、次いで５０００ｒｐｍ１１紛間遠心
分離１して沈澱物を回収し、これを４０ｍｔの１０ｍ，
Ｍトリスー塩酸緩衝液（ＰＨ８．Ｏ）、２ｍＭＥＤＴＡ
１１％ＫＣｌよりなる溶液に溶解し、不溶部分は遠心し
て除去した。次いでこれに６０ｍ１の飽和硫安溶液を加
えて１５分間攪拌した後、１２０００ｒ′Ｐｍにて１紛
間遠心分離を行い、得られた沈澱物を１５ｍｔの１０７
ｎＭリン酸緩衝液（ＰＨ７．Ｏ）、２ｍ，ＭＥＤＴＡよ
りなる溶液に溶解し、これを流速３０ｍＬ１ｈｒにてセ
フアデツクスＧ−２５（ＳｅｐｈａｄｅｘＧ−２５）の
カラムに通じて脱塩した後、得られた溶液を、ＰＨ７．
Ｏで緩衝化したＤＥＡＥ−セルロースカラム（カラム径
２．０×７．０ｃｒ１ｔ）に通じて酵素を吸着せしめ、
さらに０．２Ｍ〜０．５Ｍ（７）ＫＣｌのイオン強度勾
配を用いて溶出せしめた。約０．４ＭＫＣ１濃度での溶
出画分を回収して活性画分１７２ＷＬｔを得た（流速；
１．４ｍ１Ｉｍｉｎ１１フラクシヨンニ６ｍ１）。さら
にこの活性画分１７２ｍ１を透析膜（セルロースアセテ
ート）にて７時間透析せしめ（外液；５ｗ１，Ｍリン酸
緩衝液、２７７１．ＭＥＤＴＡよりなる溶液）、次いで
この透析液を凍結乾燥した。得られた凍結乾燥物を、１
０ｍ１の１０ｍ，Ｍトリスー塩酸緩衝液（ＰＨ８．Ｏ）
、２ＴｒＬ，ＭＥＤＴＡ１１％ＫＣｌよりなる溶液に溶
解せしめた後、セフアデツクスＧ−２００を用いたカラ
ムクロマトグラフィーを行ない（カラム径：２．８×９
．５Ｇ１流速；０．１８Ｔｎｔ１ｍｉｎ１１フラクシヨ
ンニ６ｍ１）、そのフラクシヨンＮＯ．４２〜４８の活
性画分を回収し、凍結乾燥した。次いで同様のセフアデ
ツクス操作を行つた。この得られた凍結乾燥物は、先の
電気泳動の結果において述べた通り、唯一の蛋白質の帯
を示すものであつた。また各採取工程における、コリン
オキシダーゼの全活性、全蛋白質量、比活性は上記表に
示す通りである。

実施例２ （コリンの定量） 過酸化水素０．０１〜０．０５μＭＯｌｅｌトリスー塩
酸緩衝液（ＰＨ８．Ｏ）１０μＭＯｌｅｌ４−アミノア
ンチピリン１５０ｐｙ１フェノール２００Ｐｙ１パーオ
キシダーゼ０．２Ｌ］、コリンオキシダーゼ０．２５Ｕ
．を含有する反応液０．５ｍ１を、３７℃にて２紛間反
応せしめた後エタノール２．５ｍ１を加えて４８０ｒ１
ＴｒＬにおける吸光度を測定して、過酸化水素の検量線
を得た。

次いで、上記の反応液中の過酸緩水素の代りに塩化コリ
ンを加え、同様に行なつてその吸光度を測定し、過酸化
水素の検量線よりコリンを定量した。

実施例３ （ベタインアルデヒドの定量） 上記実施例２のコリンの代りにベタインアルデヒドを用
いて同様に行なうことにより、ベタインアルデヒド試薬
のベタインアルデヒド純度を測定した。

実施例４ （リン脂質の定量） 下記組成を有する反応液に、 反応液組成 ０．２Ｍトリスー塩酸緩衝液（ＰＨ８．Ｏ） ０．１
５ｍ１３ｍ９１ｍ１４−アミノアンチピリン ０．５
０ｍ１０．１％フェノール ０．
３０ｍ１１％トリトンＸ−１０００．３０ｍ１１０ｍ，
ＭＣａＣ１２０．３０ｍ１１５ＵＩｍ１コリンオキシダ
ーゼ αノとノシリカゲルカラムクロマトグ
ラフィーにより精製した卵黄レシチン或は市販品血清（
ハイランド社製）を各々添加し、３７℃、２０分間反応
せしめた後、５００ｒ１瓦にて比色測定した結果、第１
１図および第１２図に示す通りである（第１１図は卵黄
レシチンに対する測定結果を示し、第１２図は市販品血
清に対する測定結果を示す。

この第１１図（卵黄レシチンの測定結果）と先の過酸化
水素の検量線とより、卵黄レシチン中の遊離されたコリ
ン量が算出され、さらにこのコリン量より卵黄レシチン
のモル数が求められる。同様、この第１２図（血清の測
定結果）と先の過酸化水素の検量線とより血清中のリン
脂質が定量される。なお、上記方法に用いたホスホリパ
ーゼＤは、ストレプトマイセス●クロモフスカスＡ−０
８４８菌株より得られたホスホリパーゼＤであつて、そ
の使用量は一般に０．５Ｕ．以上、好ましくは１〜５Ｕ
．程度である。実施例５（コリンエステラーゼの測定） 下記組成を有する反応に、 反応液組成 生理食塩水にて１嗟養釈したヒト血清（健康人より採取
）を加え、３ｒＣ１３紛間反応せしめ、次いでこれに０
．２ｍＭネオスチグミン溶液（コリンエーステラーゼ阻
害剤）３．０ｍ１加えた後さらに室温下１紛間放置して
５００ｎＴｒ１，にて比色測定した結果、第１３図に示
す通りであつて、血清中コリンエステラーゼ活性は、反
応液中のベンゾイルコリンより遊離されたコリンの量よ
り（コリンはコリンオ・キシダーゼ、パーオキシダーゼ
、４−アミノアンチピリン、フェノール系により定量）
測定されたものであつて、この吸光度より血清中コリン
エステラーゼの活性が求められる。

またコリンエステラーゼの活性は、血清１．０ｍ１中の
酵素が３ｒＣで１分間に２μＭＯｌｅの過酸化水素を生
じたとき、１Ｕ．として表わすことができる。活性Ｕ．
Ｉｍｌ＝ΔＡ５ＯＯ／Ｍｉｎ×４．８上記コリンエステ
ラーゼ、ベンゾイルコリンの組合せの代りに他のコリン
誘導体の加水分解酵素および他のコリン誘導体を組合せ
て用いることにより種々の酵素活性の測定や、コリン誘
導体の定量に使用し得る反応系を設定し得る。

”参考例１ペプトン２％、ラクトース２％、ＮａＣｌＯ
．ｌ％、ＫＨ２ＰＯ４Ｏ．Ｏ５％、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２
００．０５％、デスホーｍｌ℃−５１Ｙ０．５％よりな
る組成の培地１００ｍ１を有する５００ｍ１容三角フラ
スコ（１２００Ｃ１２紛間滅菌処理）にストレプトマイ
セス●クロモフスカスー０８４８菌株を接種し、２６℃
、３日間培養して種菌を得、これを上記と同一組成より
なる培地２０ｅを有する３０ｅ容シャー●フアーメンタ
ーに移植し、２６℃、２日間、３００ｒ′Ｐｍｌ２Ｏｅ
ｌｍｉｎの条件下通気攪拌培養した。

この培養液は０．５Ｕ１ｍＬの活性を示す。この培養物
を遠心分離して得た培養戸液１８ｅ番３′になるまで減
圧濃縮し、この濃縮液にアセトン２．４ｆを加え、生じ
た沈澱物を遠心分離して除去した。得られた上清液にさ
らにアセトン２ｅを加えて生じた沈澱物を遠心分離にて
回収し、これを５００ｍ１の精製水に溶解せしめた後、
これにアセトン３５０ｍ１加えて沈澱する不純物を遠心
分離により除去し、その上清液にアセトン３３０ｍ１を
加えて生じた沈澱物を遠心分離により回収し、これを２
００ｍ１の精製水に溶解した。これに、飽和硫安溶液２
００ｍ１を加えて生じた沈澱物を遠心分離により回収し
た後、これを５０ｍ１の精製水に溶解し、セフアデツク
スＧ−２５により脱塩した後凍結乾燥して５ｕ．１Ｔｒ
Ｌ９の活性を有する粗製ホスホリパーゼＤの粉末７００
ｍ９を得た。本発明においては、この粗製ホスホリパー
ゼＤをそのまま利用したものであつて、必ずしも完全に
精製したものを必要とするものではなく、またこの粗製
ホスホリパーゼＤは上記記載の一般的手段にて精製し、
この精製ホスホリパーゼＤを用いてもよい。

【図面の簡単な説明】

第１図はコリンオキシダーゼの至適ＰＨを示し、第２図
はコリンオキシダーゼの至適温度を示し、第３図はコリ
ンオキシダーゼのＰＨ安定性を示し、第４図はコリンオ
キシダーゼの熱安定性を示し、第５図はコリンオキシダ
ーゼの電気泳動図を示し、第６図はコリン●ベタインア
ルデヒドおよび過酸化水素の検量線を示し、第７図はホ
スホリパーゼＤのＰＨ安定性を示し、第８図はホスホリ
パーゼＤの至適ＰＨを示し、第９図はホスホリパーゼＤ
の熱安定性を示し、第１０図はホスホリパーゼＤの血清
リン脂質の分解作用を示す薄層クロマトグラムを示し、
第１１図は卵黄レシチンの定量結果を示し、第１２図は
血清リン脂質の定量結果を示し、第１３図はヒト血清コ
リンエステラーゼ活性の測定結果を示す。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ コリンまたはベタインアルデヒドを含有する液体に
   、コリンオキシダーゼを作用せしめ、次いで生成する過
   酸化水素、ベタインまたは消費される酸素を測定するこ
   とを特徴とする液体の分析法。 ２ コリンまたはベタインアルデヒドを含有する液体が
   、コリンまたはベタインアルデヒド、またはコリンの誘
   導体またはベタインアルデヒドの誘導体とそれらを遊離
   せしめる物質から選ばれる液体である特許請求の範囲第
   １項記載の液体の分析法。 ３ コリンの誘導体がリン脂質である特許請求の範囲第
   ２項記載の液体の分析法。 ４ リン脂質がレシチン、リゾレシチンまたはスフィン
   ゴミエリンである特許請求の範囲第３項記載の液体の分
   析法。 ５ 遊離せしめる物質がホスホリパーゼＤである特許請
   求の範囲第２項記載の分析法。 ６ ホスホリパーゼＤがストレプトマイセス・クロモフ
   スカスＡ−０８４８菌株より得られる酵素である特許請
   求の範囲第５項記載の液体の分析法。 ７ コリンの誘導体がベンゾイル−コリンである特許請
   求の範囲第２項記載の液体の分析法。 ８ 遊離せしめる物質がコリンエステラーゼである特許
   請求の範囲第２項記載の液体の分析法。 ９ 測定において、過酸化水素を測定してなる特許請求
   の範囲第１項、第２項、第３項、第４項、第５項、第６
   項、第７項または第８項記載の液体の分析法。 １０ 過酸化水素の測定において、過酸化水素と反応し
   てその色調に変化を生する１種もしくは２種以上の呈色
   剤からなるシステムによつて測定する特許請求の範囲第
   ９項記載の液体の分析法。 １１ 過酸化水素の測定において、パーオキシダーゼを
   用いてなる特許請求の範囲第１０項記載の液体の分析法
   。 １２ ０．２〜０．５ｕのパーオキシダーゼを使用して
   なる特許請求の範囲第１１項記載の液体の分析法。 １３ 呈色剤が生成された過酸化水素１モルに対して２
   モル以上である特許請求の範囲第１０項、第１１項また
   は第１２項記載の液体の分析法。 １４ 呈色剤が４−アミノアンチピリン、フェノール、
   パーオキシダーゼからなる特許請求の範囲第１０項、第
   １１項、第１２項または第１３項記載の液体の分析法。 １５ １．５〜５ｕのコリンオキシダーゼを使用してな
   る特許請求の範囲第１項記載の液体の分析法。１６ リ
   ン脂質、ホスホリパーゼＤ、コリンオキシダーゼ、４−
   アミノアンチピリン、フェノールおよびパーオキシダー
   ゼよりなる特許請求の範囲第１項から第１５項のいずれ
   かの液体の分析法。 １７ リン脂質が生体成分よりなる液体である特許請求
   の範囲第３項または第１６項記載の液体の分析法。