JPS6055779B2

JPS6055779B2 - 新生物診断用試薬の製法

Info

Publication number: JPS6055779B2
Application number: JP50107228A
Authority: JP
Inventors: 勝石井
Original assignee: Eisai Co Ltd
Current assignee: Eisai Co Ltd
Priority date: 1975-09-04
Filing date: 1975-09-04
Publication date: 1985-12-06
Also published as: JPS5241221A

Description

【発明の詳細な説明】本発明は、新生物診断用試薬の製法に関するも。

のである。さらに詳しくは、凝集反応に基づく免疫学的
検出方法（ＰＨＡ−ＨＩ法、ＲＰＨＡ法）により新生物
の診断を行なう際に用いられる、ＮＥＡまたはＮＥＡ抗
体を結合した微粒子の製法に関するものである。人間に
おける新生物に固有の抗原物質を研究することは、新生
物の発生原因、予防、処理および診断法にとり重要な課
題である。

近年、新生物に固有の抗原物質を探求する試みがなされ
、若干の抗原物質が報告されている。例えば原発性肝細
胞癌に対するａ−フエトプロテインあるいは線傷に対す
るカルシノエンブロニツクアンチゲン（ＣＥＡ）な
どてある。しかしこれらの抗原物質は、ある特定の臓器
、系統器官あるいは病理組織学形態の新生物に限定され
ている。この理由か−ら、広範囲に諸種臓器および病理
組織学形態の新生物に共通した新生物固有の抗原物質の
存在を探求し、この抗原物質に対する固有の抗体を作製
し、さらにこの特異抗体を用いた抗源検出法を確立する
ことは、人間に発生した諸種新生物の存在診断、予防お
よび処置に活気的な進歩を促すことが期待される。本発
明者は、広範囲の諸種新生物に共通した固ｎの存在を探
求した結果、新規な抗原物質である！ＢＭを見い出した
。

本発明のＮＥＡとはｎｅｏｐｌａｓｍｅｍｂｒｙｏｎｉ
ｃｎｔｉ厚ｎの略称であり、本発明者が命名したものコ
ある。

ＮＥＡは次に示す性状を有する。

ｉＮＨＡは、ＮＥＡに対する抗体を用いたウクロタニー
試験法で、胎児組織（主に小腸および大腸）、胎児血清
、羊水、胎便、諸種新生物（主に悪性新生物）組織、な
らびに当該患者血清および腹水中に存在する事が証明で
きる。

しかし、ウクロニー試験法では、新生物患者の非新生物
組織、正常人血清、非新生物患者の血清および腹水には
ＮＥＡの存在を証明する事ができない。さらに、ＮＥＡ
に対する抗血清を非新生物患者組織抽出抗源、正常人血
清、非新生物患者血清で中和吸収操作しても、ＮＥＡ抗
体活性の失活または減弱は認められず、胎児組織抽出液
、胎児血清、ある種の悪性新生物組織抽出液またはその
患者血清を用いた吸収操作によりＮＥＡ抗体活性は失活
または減弱することがウクロニー試験法で証明される。

したがつてＮＥＡは、胎児および新生物に共通した特異
抗原である。

２ＮＥＡは、セルローズアセテート膜、ペビコンＣ−８
７０（塩化ビニル、酢酸ビニル複合体）、寒天ゲル、澱
粉などを支持体とするＰＨ８、ｅｌ、イオン強度０．０
２５〜０．１のバルビタール緩衝液を用いた電気泳動で
γグロブリン分画に泳動され、既知の免疫グロブリンＧ
，Ａ，Ｍ．ＤおよびＥ）、その他の血清γグロブリンと
免疫学的に異なる事が、ウクタロニー試験法、免疫電気
泳動法で証明される。

３ＮＥＡの吸収係数はＥ？？２８０＝０．９３６である
。

なお蛋白量は牛血清アルブミンを標準としてローリー法
（ＬＯｗｒｙ法）によつて測定した。４ＮＥＡは、セフ
アデツクスＧ−２００（商標フアーマシア社）を用いた
カラムクロマトグラフィーによる分子量測定の結果、分
子量１０００００±２００００の蛋白質である。

５ＮＥＡは、塩基性陰イオン交換体を用いたクロマトグ
ラフィーによりイオン強度０．０５、ＰＨ７．Ｏの緩衝
液で展関すると免疫グロブリンＧとともにイオン交換体
に吸着せれずに溶出される性状を有する。

６ＮＥＡの等電点はＰＨ９．ｌ〜９．４である。

７ＮＥＡは、ＰＨ７．Ｏ、２．６モル硫酸アンモニウム
溶液中て沈澱する性状を有する。

以上に述べたように、ＮＥＡは新生物の特異抗原であり
、血清中のＮＥＡの存在を調べる事により新生物の診断
を行なう事ができる。

本発明の試薬は、凝集反応（ＰＨＡ−ＨＩ法、ＲＰＨＡ
法）によりＮＥＡの検出を行なう際に用いられる。

本発明の試薬は、ＮＥＡまたはＮＥＡ抗体を微小粒子に
結合させる事により得る。

本発明に用いる微小粒子としては、ＰＨＡ−ＨＩ法、Ｒ
ＰＨＡ法において通常用いられる物を使用する事ができ
る。

咄乳類および鳥類の血球が特に好ましいが、その他ポリ
スチレンラテックス、ポリエステルラテックス、塩化ビ
ニル、ベントナイト、ガラスビーズ等の約１〜１μの粒
子も使用する事ができる。

ＮＥＡは前記したＮＥＡ含有組成物を通常のタンパク分
画精製法を用いて得られる。ＮＥＡ抗体は、動物にＮＥ
ＡまたはＮＥＡＩ：．ＮＥＡ抗体との複合体を免疫して
得られる。微小粒子とＮＥＡまたはＮＥＡ抗体を結合さ
せるには、通常用いられる試薬を使用する。

例えばグルタールアルデヒド、ホルムアルデヒド、タン
ニン酸、ビスジアゾダイズドベンチジン、塩化クロム、
カルボジイミドなどがあげられる。本発明の試薬の一般
的製造方法を、羊赤血球を使用した場合について説明す
ると次のようになる。

羊赤血球を燐酸緩衝生理食塩水に約５％濃度に懸濁させ
、これに燐酸緩衝生理食塩水で１〜５％に調製したグル
タールアルデヒド溶液を１１熔量加え室温で３〜７時間
かくはんする。

生理食塩水で洗浄後、燐酸緩衝生理食塩水を加えて５％
グルノタールアルデヒド羊赤血球を作製する。これに０
．００１〜０．０２％のタンニン酸溶液を等量加えて５
〜２紛間かくはん後、生理食塩水て洗浄する。

燐酸緩衝生理食塩水を加えて５％グルタールアルデヒド
、タンニン酸処理羊赤血球を作製する。この血球にＮＥ
Ａ抗体を結合させるには、精製したＮＥＡ抗体（５μｙ
〜１ＴＬ９／Ｍｔ）を等量加えて室温で１０〜６紛かく
はんする。またＮＥＡを結合させるには、精製したＮＥ
Ａ（１μｙ〜１ｍ９／ｍｌ）を等量加えて室温で１０〜
６紛かくはんす”る。本発明のＮＥＡまたはＮＥＡ抗体
を結合させた微小粒子を用いて血清中のＮＥＡを検出す
るには次のように行なう。

ＮＥＡ抗体一微小粒子および被覆血清を試験管中で混和
すると、血清中にＮＥＡが存在すればＮＥＡ．ｌ５ＮＥ
Ａ抗体が反応して凝集反応が起り、その結果管底には自
然沈降とは異なる凝集による管底像を肉眼的に認める。

また血清がＮＥＡを含まないかあるいはＮＥＡの濃度が
本試薬の感度以下であれば、ＮＥＡ抗体一微小粒子は自
然沈下し、リングが底管に観察される。ＮＥＡ一微小粒
子の場合には、ＮＥＡ抗体の存在により、上記と同じ凝
集反応が起きるが、この反応系に遊離のＮＥＡが共存す
ると凝集反応が阻害される。したがつてあらかじめ被検
血清にＮＥＡ抗体を適当量加えた後、それにＮＥＡ一微
小粒子を加え、凝集の有無を観察する事により血清中の
ＮＥＡを検出する。次に実施列および実施例を示し、本
発明をさらに詳しく説明する。実験例１癌組織からのＮＥＡの部分精製凍結された１００ｆの乳癌摘出組織をサイの目に切り、
ホモジナイザー中で５倍容の生理的食塩水を加えて４℃
で１紛間均質化した。

これに、さらに等量の生理的食塩水（窒化ソーダを０．
０５％享有する）を加え、４℃で絽時間攪拌して蛋白質
を抽出した後、５００踵力（Ｇ）で３紛間遠心分離した
。最土層にある脂肪層を除去し、上澄液を採取した。得
られた上澄液を２００鍾力（Ｇ）で３紛間再度遠心分離
し、最上層の少量の脂肪層を除去し、上澄液を採集した
。この上澄液を透析用セルローズチューブに入れ、ポリ
エチレングリコール（平均分子量約１５０００）液中で
、約２紛の１容に濃縮した。濃縮液の蛋白濃度はローリ
ー・フオリン（ＬＯＩｙ一ＦＯｌｌｎ）法で測定した結
果７３ｍ９／Ｍｔであつた。この濃縮液３ｍ１を、セフ
アデツクスＧ−２００を充てんした直径２．６ｃｒｎ１
長さ（社）ｏ（床容量４６０ｍ１）のカラムによりＰＨ
８．ｆ）ｓイオン強度０．０５のバルビタール緩衝液中
でゲル沖過を行い、溶出液を分取した。溶出時２８０（
７）ｍμの分光光度計で４つのピークがみられた。

即ち第１のピークはα２−マクログロブリン、免疫グロ
ブリンＭ１β−リボ蛋白などを含む１？以上の蛋白を含
む分画、第２のピークは免疫グロブリンを含む？グロブ
リン分画、第３のピークはアルブミンを含む４．５Ｓ分
画、第４のピークは、さらに小さな分子量の物質を含む
分画であつた。

ＮＥＡは第２分画と第３分画の中間に溶出された。即ち
分子量１２００００〜８００００の分画にＮＥＡの約９
０％が溶出された。第２および第３ピークを除く、第２
と第３ピーク間の溶出液を採集し、粗ＮＥＡ分画とした
。以上の採作を繰返して粗ＮＥＡ分画を集め、この粗Ｎ
ＥＡ分画液を限外淵過膜（通過可能分子量１００００以
下）を用いて、原組織量の約１紛１容に濃縮した。次い
で、長さ３３ｃｍ１幅８ｃｍ１厚さ２αの電気泳動槽に
支持体としてペピコンＣ−８７０を充填し、ｐ［１８．
ｅ１ｓイオン強度０．０５のバルビタール緩衝液を使用
し、前記泳動層の陰極側より１０ｃｍの部位に設けた試
料溝に粗ＮＥＡ分画濃縮液５ｍ１を注入し、８０ｎ１Ａ
定電流で１６時間泳動した。試料溝より陰極側へ３〜７
ａｎの距離にＮＥＡは存在するため、この区域の支持体
を切離し、１００ｍ１のＰＨ７．５．Ｏ．Ｏ５モル燐酸
緩衝生理食塩水を加え攪拌した後、３０００ｒｐｍ１紛
遠心分離して上澄液を採集した。この上澄液に、さらに
１００ｍ１の同じ緩衝液を加え攪拌後、同条件て遠心分
離し上澄液を採取した。この採取液中にわずかに混入す
るペピコンＣ−８７０を除去するため、採取液をガラス
フィルターでろ過した。約２００ｍ１の沖液をプロテイ
ンバッグ〔カール●シユライヒヤー（Ｃａｒｌ，Ｓｃｈ
ｌｅｉｃｈｅｒ）社製ＵＩｔｒａｈｉｌｓｅｎＮＯ．ｌ
Ｏへ通過可能分子量２５０００〕を用い、５ｍＬに濃縮
した。

上記と同じ操作を５回行ない、得られた濃縮液を４℃で
保存した。得られたＮＥＡの電気易動度は免疫グロブリ
ンＧとほぼ同じ易動度を示した。本標品中には夾雑蛋白
として免疫グロブリンＧおよびＡが、ウクタロニー試験
法および免疫電気泳動法により認められた。なお、以上
の方法によりＮＥＡは、最初の生理的食塩水による抽出
液中のＮＥＡより計算して約５０％が回収された事にな
り、また、精製度は約１０皓であつた。実験例２癌患者腹水からのＮＥＡの部分精製胃癌患者の腹水２ｅを限外ｐ過膜（通過可能分子量１５
０００）を用いて５００ｍ１に濃縮し、この濃縮液を３
吟間２００００重力（Ｇ）で遠心分離して上澄液を採取
した。

上澄液にＰＨ７．５、０．０５モル燐酸緩衝生理食塩水
を加えて全量１ｅ（蛋白量約３％）とした。これに硫酸
アンモニウムを加えて１．５モル硫酸アンモニウム溶液
とし、水酸化ナトリウムを添加してＰＨ７．Ｏに調整し
た。この溶液を６紛放置後、３０分間１００００ｒ′Ｐ
ｍで遠心分離した。上澄液を採集し、硫酸アンモニウム
を加えて２．６モル硫酸アンモニウム溶液となし、６０
分後に３０分間１０００併Ｐｍで遠心分離した。沈澱物
中にＮＥＡの６０％以上が採集された。沈澱物をＰＨ８
．伝イオン強度０．０５のバルビタール緩衝液に溶解し
、全量を２００ｍ１とした。この溶液を同じ緩衝液を用
いてセフアデツクスＧ−５０（商標、フアルマシア社）
によりゲル沖過を行ない、最初に溶出される蛋白分画を
採集し、硫安の脱塩、バルビタール緩衝化を行なつた。
この硫安分画液の蛋白濃度を約７０ｍｇ／ｍｌに調製し
、この溶液５ｍｔを電気泳動した。即ち、長さ３３０１
幅８Ｃｒ！１１厚さ２０の電気泳動槽に支持体としてペ
ピコンＣ−８７を充填し、ＰＨ８．６、イオン強度０．
０５のバルビタール緩衝液を使用し、泳動槽の陰極側よ
り１０Ｃｒ！ｌの部位に設けた試料溝に前記溶液５ｍｔ
を注入し、８０ｎ１Ａの定電流で■時間泳動した。その
後、試料溝より陰極側へ３〜７ｃｍの距離にある支持体
を切離し、１００ｍ１のＰＨ７．５、０．０５モル燐酸
緩衝生理食塩水を加え攪拌後、３，０００ｒ′Ｐｍｌ紛
間遠心分離して上澄液を採取した。さらに、１００ｍ１
の同緩衝生理食塩水を加えて攪拌後、同条件で遠心分離
し、上澄液をガラスフィルターでｐ過した。沖液をプロ
テインバックで２．５ｍ１に濃縮した。この濃縮液２．
５ｍ１を、セフアデツクスＧ−２００を充填した直径２
．泗、長さ９泗（床容量４６０ｍ１）のカラムにより、
ＰＨ７．５、０．０５モル燐酸緩衝液中でゲルろ過を行
ない、溶出液を各試験管に分取した。溶出時、２８０ｍ
μの分光光度計で２つの吸収ピークがみられた。第１の
ピークは免疫グロブリンＭを含む１９Ｓ分画で、第２の
ピークは免疫グロブリンＧを含む？分画であつた。ＮＥ
Ａは第２のピークよりやや遅れて溶出される。即ち分子
量１２００００〜８００００に相当する分画にＮＥＡの
約９０％以上が存在した。この分画を採集し、プロテイ
ンバックで濃縮した後、４℃で保存した。得られたＮＥ
Ａ標品には、夾雑物質として、免疫グロブリンＧおよび
Ａがウクタロニー試験法および免疫電気泳動法で認めら
れた。なお、得られたＮＥＡの精製度は約５皓であつた
。実験例３ＮＥＡ抗体の製造実験例１で得た部分精製ＮＥＡを生理食塩水で蛋白量１
ｍ９／ｍｌになるように調整し、この溶液０．５ｍ１に
等量のフロイント完全アジバンドを混和乳化した液を体
重約２ｋ９の家兎の後肢、腹部の皮内、皮下および筋肉
内に分割注射した。

２週間後に前記と同様の操作で作製したＮＥＡ乳化液１
ｍ１を追加免疫し、さらにその２週間後に同ＮＥＡ乳．
化液１ｍ１を再度追加免疫した。

最後の免疫より１０日後に血液を採取し、血清を分離後
５６℃て３紛間嗜置して非動化し、その後、防腐の目的
で０．０５％濃度になるよう窒化ソーダを加えた。本抗
血清１ｍ１につき、３分の１客の正常人血清および初乳
精，製γ−グロブリン５７Ｆ！９を加えて３ＴＣ１時間
、ついで４℃４漏問卿置後、３紛間４℃３０００ｒｐｍ
で遠心分離し、上澄液を採集した。このような処理後の
抗血清のＮＥＡ抗体特異性は、原乳癌組織抽出液を抗原
としたウクロニー試験法および免疫電気泳動法で同定し
た結果、ＮＥＡ抗体以外の抗体は含まれていないことが
証明された。なの、初乳精製γ−グロブリンを抗血清の
中和に用いた理由は、抗原抽出組織が乳癌摘出組織のた
め、ＮＥＡ部分精製品中に免疫グロブリンＡの分泌型抗
原を含んでいる可能性があり、作製した抗血清中にこれ
に対する抗体が生じている可能性があるため、この抗体
を吸収除去する目的で、免疫グロブリンＡの分泌型抗原
を含む初乳より精製したγ−グロブリンを用いた。実験
例４ＮＥＡの単離精製ＮＥＡ特異抗体を用いて、アフイニテイークロノマトグ
ラフイー法によりＮＥＡを単離精製する。

実験例３で作製したＮＥＡ特異家兎抗血清５０ｍ１に等
量のＰＨ７．５、０．０５モル燐酸緩衝生理食塩水を加
えた溶液に、同量のＰＨ７．８の飽和硫酸アンモニウム
溶液を加えた。６紛後に５０００ｒｐｍで遠心分離し、
得られた沈澱物を前記燐酸緩衝生理食塩水に溶解し、原
抗血清と等量の溶解液となした。

ついでＰＨ７．８の飽和硫酸アンモニウム溶液を４分の
１容加えて６紛後に５０００ｒ′Ｐｍで遠心分離し、得
られた上澄液に、さらに４分の１容の同飽和硫酸アンモ
ニウム溶液を加えて３３％硫酸アンモニウム溶液となし
、６紛後に５０００ｒ″Ｐｍで遠心分離して沈澱物のγ
グロブリン分面を採集した。沈澱物をＰＨ＆０ｓ０．０
１モルの燐酸緩衝液約１５ｍ１に溶解した。この溶液１
５ｍｔを、セフアデツクスＧ−５０の直径２．６ＣｒＩ
Ｌ１長さ４０ＣＷＬのカラム、および前記の燐酸緩衝液
を用いたゲルｐ過法で分面し、最初に溶出される蛋白分
画を採集する事により、脱塩および緩衝化を行なつた。
さらにこの溶液をプロテインバッグを用いて蛋白濃度７
０ｍ９／ｍｌに濃縮調整した。ついで、活性化したＤＥ
ＡＥ−セルロースを、前記燐酸緩衝液を用いて直径２．
６Ｃ７！、長さ４０Ｃ７１のカラムに充填し、このカラ
ムに前記濃縮液を添加し、カラムベッドに吸収させた後
、前記の燐酸緩衝液をベッド上部に満し流し続けた。免
疫グロブリンＧの大部分はＤＥＡＥ−セルロースに吸着
しないが、他の蛋白はすべて吸着される。したがつて流
出液を分割採取して、２８０ｒ１ｍの吸収を測定し、蛋
白分画液を得た。このようにして免疫グロブリンＧを単
離採取した。さらに、この分画液の蛋白濃度をプロテイ
ンバッグを用いて１０ｍ９／ｍｌに濃縮調整した。つい
で、ブロムシアン活性化セフアローズａゲル５０ｍ１に
ゲル１ｍ１当り前記のＮＥＡ抗体活性をもつ免疫グロブ
リンＧ５ｍ９を加えて室温（２０〜２５℃）で６時間反
応させ免疫グロブリンを固着させた。その後、未反応の
免疫グロブリンを燐酸緩衝生理食塩水で十分洗滌した。
このセフアローズａゲルを直径２．６０１長さ２０礪の
カラムに前記燐酸緩衝生理食塩水を用いて充填し、これ
に実験例１で得た部分精製ＮＥＡ２Ｏｍ９（蛋白量）を
１０ｍｔの生理食塩水に溶解して添加し、セフアローズ
胆ゲル固着のＮＥＡ抗体と反応させ、ＮＥＡ抗原抗体複
合物をゲル中に作製した。前記燐酸緩衝生理食塩水で未
反応の蛋白質を洗滌した後、０．２モル炭酸ナトリウム
液（ＰＨｌｌ．５）をカラムに添加し、ＮＥＡを解離溶
出させた。採取したＮＥＡ液を０．０５燐酸緩衝生理食
塩水（ＰＨ７．５）に透析してから濃縮し、４℃に保存
した。得られたＮＥＡは、実験例３で作製した正常人血
清および初乳精製γ−グロブリンで中和する前の抗ＮＥ
Ａ血清を用いたウクタロニー法および免疫電気泳動法で
は単一沈降線を示し、さらに単離したＮＥＡの１０％Ｓ
ＤＳ（ソジユウムドデシルサルファイド）ポリアク
リルアマイドゲルディスク電気泳動法により単一のバ
ンドとして示された。この結果、得られたＮＥＡは高純
度の単離精製標品である。

実施例５ＮＥＡ特異抗体の精製実験例２で作製した部分精製ＮＥＡをＰＨ７．５、０．
０５モル燐酸緩衝生理食塩水に溶解し、蛋白量を１０ｍ
９／Ｍｔに調整した。

これをブロムシアン活性化セフアローズ小ゲルに２倍容
加え、４℃で２４時間反応させて部分精製ＮＥＡ中の蛋
白質をゲルに固着させた。ついで未反応の蛋白質を前記
燐酸緩衝生理食塩水て充分に洗滌除去した後、これを直
径１．５ｃｍ１長さ２０Ｃ７７！のカラムに充填した。
このカラムに、実験例で硫安塩析後イオン交換カラムク
ロマトグラフィーで精製した得たＮＥＡ抗体を含む精製
家兎免疫グロブリンＧ液（蛋白濃度１０ｍ９／ｍｌ）を
添加し、セルローズ？ゲル固着のＮＥＡと反応させ、Ｎ
ＥＡ抗原物質抗体複合物をゲルに作製した。ついで、前
記燐酸緩衝生理食塩水を用いて未反応の免疫グロブリン
Ｇ蛋白を十分に洗滌して除去した後、０．２モル炭酸ナ
トリウム液（ＰＨｌｌ．５）をカラムに添加してＮＥＡ
抗体を溶離溶出させた。採取したＮＥＡ抗体画分に対し
て５分の１容の１モルグリシン塩酸緩衝液（ＰＨ２．５
）を添加して中和した。次いでこれをセフアデツクスＧ
２５カラムクロマトグラフィーに加えて、０．０５モル
燐酸緩衝生理食塩水で溶出し、グリシンを除去した。得
られたＮＥＡ抗体は、抗家兎血清蛋白山羊血清を用いた
ウクタロニー法および免疫電気泳動法で単一沈降線を示
し、また抗家兎γ−グロブリン山羊血清とも単一沈降線
を示した。さらに、抗人血清蛋白抗血清および抗初乳蛋
白抗血清を用いたウクタロニー法および免疫電気泳動法
では、沈降線は出現しなかつた。これらの結果より、得
られたＮＥＡ抗体は、高純度のＮＥＡ抗体のみからなる
家兎免疫グロブリンＧである。このＮＥＡ抗体は、原抗
血清の約１０Ｃ＠（蛋白量比に対し）の高い抗体価を示
した。実施例１ＮＥＡ抗体感作羊赤血球アルバーザ液に保存してある羊血液を４℃で２０００ｒ
．ｐ．ｍ．１紛間遠沈して血漿を除去した後、生理食塩
水で５回洗滌した、２０００ｒ．ｐ．ｍ．で１紛間遠沈
した。

得られた羊赤血球に燐酸緩衝生理食塩水を加えて５％濃
度とし、この懸濁液に氷冷燐酸緩衝生理食塩水で希釈し
た２．５％グルタールアルデヒドを滴下ロードを用いて
１１熔量ゆつくり滴下した。室温で５時間攪拌した後、
生理食塩水で５回洗浄し、２０００ｒ′．Ｐ．ｍ．で５
分間遠沈し、チメロサールを含む氷冷燐酸緩衝生理食塩
水で５％グルタールアルデヒド処理羊赤血球を作成した
。ついで、これに０．００２５％のタンニン酸溶液を等
量加えて１紛間攪拌した後、遠沈した。上清を除去し、
生理食塩水て５回洗浄後、遠沈し、燐酸緩衝生理食塩水
を加えて、５％グルタールアルデヒド、タンニン酸処理
羊赤血球を得た。

これに、実験例５で得たＮＥＡ抗体（１０μｙ／ｍｌ）
を等量加えて室温て３紛間かんはんした後、門遠沈した
生理食塩水て２回洗浄し、燐酸緩衝生理食塩水で希釈し
て１０％グルタールアルデヒド、タンニン酸処理ＮＥＡ
抗体羊赤血球を得た。得られたＮＥＡ抗体惑作羊赤血球
を用いてのＲＰＨＡ法によるＮＥＡの検出感度は１５０
ｒ１ｙ／ｍｌでフあつた。したがつて被検血清の極く微
量のＮＥＡも検出する事ができる。実施例２ＮＥＡ感作羊赤血球実施例１で得られた５％グルタールアルデヒド、タンニ
ン酸処理羊赤血球に、実験例４で得られたＮＥＡ（１０
ｐｙ／ｍｌ）を等量加えて、室温で３紛間攪拌した。

ついで、２００〔．Ｐ．ｍ．で１紛間遠沈し、生理食塩
水で２回洗浄後、燐酸緩衝生理食塩水で希釈して、１０
％グルタールアルデヒド、タンニン酸処理ＮＥＡ感作羊
赤血球を得た。得られたＮＥＡ惑作羊赤血球を用いて、
ＰＨＡ−ＨＩ法によりＮＥＡを検出すると、検出感度は
２０００ｒ１ｙ／ｍｌであつた。

Claims

【特許請求の範囲】

１ＮＥＡまたはＮＥＡ抗体を微小粒子に結合させる事
を特徴とする新生物診断用試薬の製法。