JPS6111591B2 - - Google Patents
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- JPS6111591B2 JPS6111591B2 JP58168537A JP16853783A JPS6111591B2 JP S6111591 B2 JPS6111591 B2 JP S6111591B2 JP 58168537 A JP58168537 A JP 58168537A JP 16853783 A JP16853783 A JP 16853783A JP S6111591 B2 JPS6111591 B2 JP S6111591B2
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
- C12N9/0006—Oxidoreductases (1.) acting on CH-OH groups as donors (1.1)
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P11/00—Preparation of sulfur-containing organic compounds
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
- C12P7/40—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carboxyl group including Peroxycarboxylic acids
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
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- C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
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- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Description
本発明の目的は、次の特性：
(a) Ｌ−２−ヒドロキシ−４−メチルペンタン酸
に対する特異活性、 (b) ニコチンアミド−アデニン．ジヌクレオチド
（NAD）依存性、 (c) 作用至適温度40〜60℃、 (d) 安定性至適温度40℃、 (e) 脱水素反応に関する至適PH値8.0〜8.5、 (f) 還元反応に関する至適PH値7.0付近、 (g) PH−安定範囲6.5〜8.5、 (h) Ｌ−２−ヒドロキシ−４−メチルペンタン酸
に対するミハエリスー定数（ＫM−値）0.62×
10-3M 及び (i) Ｌ−２−ヒドロキシペンタン酸、Ｌ−２−ヒ
ドロキシヘキサン酸及びＬ−２−ヒドロキシ−
４−（メチルメルカプト）−酪酸に対する付加的
安定性 を有するＬ−２−ヒドロキシ−４−メチルペンタ
ン酸−デヒドロゲナーゼである。 本発明のもう１つの目的は、新規Ｌ−２−ヒド
ロキシ−４−メチルペンタン酸デヒドロゲナーゼ
の取得法にも関し、これは、ラクトバシルス・コ
ンフエスス（Lactobacillus confusus；
DSM20196）を炭素源及び窒素源並びに無酸塩、
生長物質及びビタミンを含有し、培養の開始時に
6.5のPH値を有する水性栄養培地中で培養し、培
養終了後に、遠心分離により細胞を取得し、これ
をPH７に緩衝した懸濁液中で崩壊させ、抽出物か
ら酵素を取得することよりなる。 最後に、本発明の目的は、Ｌ−２−ヒドロキシ
−４−メチルペンタン酸、Ｌ−２−ヒドロキシペ
ンタン酸、Ｌ−２−ヒドロキシヘキサン酸又はＬ
−２−ヒドロキシ−４−（メチルメルカプト）−酪
酸を酵素的に変換して相応する２−ケトカルボン
酸に変じるかもしくは２−ケト−４−メチルペン
タン酸、２−ケトペンタン酸、２−ケトヘキサン
酸又は２−ケト−４−（メトルメルカプト）−酪酸
を相応するＬ−２−ヒドロキシカルボン酸に変じ
るために、この新規酵素を使用することにもあ
る。 この新規酵素の特性は次のとおりである： (1) 作用 Ｌ−２−ヒドロキシ−４−メチルペンタン酸
−デヒドロゲナーゼ（Ｌ−Hic DH）は、補酵
素ニコチンアミド−アデニン−ジヌクレオチド
（NADH）と一緒になつて、２−ケト酸を還元
してＬ−２−ヒドロキシカルボン酸にすること
及び相応する逆反応に対して触媒作用をする： (2) 基質特異性 これは、Ｌ−２−ヒドロキシ−４−メチルペ
ンタン酸に対する特異活性及びＬ−２−ヒドロ
キシペンタン酸、Ｌ−２−ヒドロキシヘキサン
酸及びＬ−２−ヒドロキシ−４−（メチルメル
カプト）−酪酸に対して付加的活性を有する。 (3) 至適PH及び安定PH範囲 脱水素反応に関する至適PH；8.0〜8.5 還元反応に関する至適PH；7.0 安定PH範囲；6.5〜8.5 (4) 力価の測定 この均一蛋白質（ゲル−電気泳動で均一）
は、479単位／蛋白質mgの活性を有する。即
ち、蛋白質１mgは、１分間にケトカルボン酸
479μモル（２−ケト−４−メチルペンタン酸
として計算して）の還元に触媒作用をする。 (5) 作用適温の範囲 作用至適温度 40〜60℃ (6) 失活条件 この酵素は、４℃、6.5〜8.5のPH値で最低24
時間安定である。この酵素は、PH7.0で１時間
インキユーベートの際に40℃まで安定である。 (7) 阻害、活性化及び安定化 この酵素は補酵素としてのニコチンアミド−
アデニン−ジヌクレオチド（NADHもしくは
NAD+）の存在を必要とする。 (8) 精製法 粗製抽出物を液−液分配を３回行ない、最後
に得られる下相を引続き透析濾過する。引続
き、この透析濾過は、酵素溶液をDEAE−セル
ロース及び次いで5′AMP−セフアロース4Bの
クロマトグラフイにかける。合計して2800倍の
精製が得られる。こうして精製した酵素は、
479単位／蛋白質mgの活性を有する。 (9) 分子量 分子量は125000±15000ダルトンである。 (10) 結晶構造及び（11）元素分析 この酵素はラクトバシルス・コンフユスス中
に極めて低い濃度で存在するだけである。従つ
て、現在までのところでは晶出させることがで
きなかつた。結晶性物質として存在しないの
で、元素分析も行なうことができなかつた。 この新規酵素は約6.5〜8.5の間のPH範囲で最も
安定である。基質Ｌ−２−ヒドロキシ−４−メチ
ル−ペンタン酸に関するミハエリス定数（ＫM−
値）は0.62×10-3Mである。 この新規酵素は、ドイツチエン・ザンムルグ・
フオン・ミクロオルガニスメン（Deutschen
Sammlung von Mikroorganismen in
Go¨ttingen）から入手しうる微生物即ちラクトバ
シルス・コンフユスス（Lactobacillus
confusus；DSMカタログ番号20196）から得るこ
とができる。この微生物の培養は、ドイツチエ
ン・ザンムルング・フオン・ミクロオルガニスメ
ンのカタログに記載の又は後に記載の栄養培地中
で行なうのが有利である。次に、ラクトバシル
ス・コンフユスス（DSM20196）からのこの新規
酵素の取得法を記載する： １ 微生物の培養 この培養のために、ラクトバシルス・コンフ
ユスス（DSM20196）を次の培地中で培養す
る： グルコース 20 ｇ 酵素エキス 10 ｇ 肉エキス 0.5 ｇ 酢酸ナトリウム ５ ｇ K2HPO4 ２ ｇ MgSO4 0.2 ｇ MnSO4 0.05ｇ 脱イオン水 全量１ この溶液のPH値を6.5に調節し、次いで、121
℃（２バール）で15分間滅菌する。 培養のために、試験管中の培地５mlに、穿刺
寒天−管からのラクトバシルス・コンフユスス
白金耳一杯を接種し、30℃で16〜20時間培養す
る。次いで、生長した培養物４mlを、培地200
ml（500ml−エーレンマイヤーフラスコ中）に
対する接種培養物として使用する。 20〜24時間の後に、この200mlを10−醗酵
装置に対する予備培養物として使用し、次い
で、200に、かつ引続き、5000に接種する
ことができる。 生長の過程で低下するPH値は、醗酵装置中へ
の連続的アンモニア導入により5.0に保持す
る。対数的生長相の終り頃に、培養物を冷却
し、遠心により細胞を収得する。このビオマス
は−20℃で大きな活性損失なしに数週間〜数ケ
月貯蔵することができる。 ２ 酵素の取得及び精製 (a) 粗製抽出物 ラクトバシルス・コンフユスス−細胞（湿
つたビオマス）24Kgを、２−メルカプトエタ
ノール0.1(V/V)%を含有する100ｍモル燐酸
塩緩衝液（PH7.0）中に懸濁させる。60の
最終量は約40％の細胞懸濁液に相当する。細
胞を連続的に作動する工業用−ガラスパール
−ボールミル（NETZSCH LME20）中で崩
壊させる。内容量22.7の水平に配置された
粉砕容器に0.55〜0.85mmガラスパールを充填
すると、19.3（85％）の振動容量が生じ
る。この崩壊は、1200UMPの撹拌回転数及
び100/hの貫流速度で実施する。粉砕容器
の冷却外套を、この経過の間に、生成物の加
温を充分にさけるために、−10℃のエチレン
グリコール溶液で冷却する。２回貫流の後
に、約90％の分解率が達成される。懸濁液の
PHは、ホモゲナイジングの間に6.3まで低下
する。 (b) 液−液−分配 第１の分配工程を用いて、細胞断片をこの
精製抽出物から分離する。このために、ポリ
エチレングリコール1500 18(w/w)%、燐酸
塩緩衝液（PH7.0）７(w/w)%及び粗製抽出
物60を120Kg−系中に含有する水性２相系
を製造する。良好な分配を達成するために、
この２相系を２時間撹拌し、引続き、盤形分
離装置（α−LavalのGyrotester Ｂ型）を用
いて分離する。相の分離の間の貫流速度は60
/hであり、13.5mmの調整ネジ４個を用い
る。上相（86）は、実際にＬ−２−ヒドロ
キシ−４−メチルペンタン酸−デヒドロゲナ
ーゼの全活性（収率98.4％）を有する。下相
は、細胞断片を含有し、これを捨てる。 先の工程の酵素含有上相に最終量172に
対して計算してポリエチレングリコール
10000 ２(w/v)%、PH6.0の燐酸塩緩衝液10
(w/v)%及び塩化ナトリウム0.2Mを加え、２
時間撹拌する。生じるポリエチレングリコー
ル／塩−系をガラス容器中で沈殿させると、
その分離は約１時間後に完全である。この分
配工程では、非常に多量の蛋白質が特に過剰
に存在するＤ−ラクテート−デヒドロゲナー
ゼの大部分が下相に抽出されるが、Ｌ−２−
ヒドロキシ−４−メチルペンタン酸−デヒド
ロゲナーゼ（71）は、充分に上相に残る。
相の分離は下相の流出により行なう。 先の工程の上相に、PH6.0の燐酸塩緩衝液
10(w/v)%及び塩化ナトリウム0.2Mを添加
し、次いで、142まで充填する。２時間の
撹拌時間の後に、沈殿槽中で相を分離させ
る。Ｌ−２−ヒドロキシ−４−メチルペンタ
ン酸−デヒドロゲナーゼ−活性が下相（82
）中に存在する。 (c) 透析濾過 下相をロミコン・中空繊維パトローネ
（Romicon Hohlfaserpatrone；HF30−20−
GM−80型）中で濃縮し、PH6.5の燐酸塩緩衝
液の添加により、最終濃度200ｍＭになるま
で透析濾過する。引接き、アミコン−中空繊
維パトローネ（Amicon−
Hohlfaserpatrone；HI930）を用いて、この
酵素溶液を500mlまで濃縮する。 (d) DEAE−セルロース−クロマトグラフイ この濃縮され透析濾過された酵素を、５×
40cmカラム（Whatman−Cellulose DE52が
充填されている）にポンプ装入する。この
DEAE−セルロースを、PH6.5の燐酸塩緩衝
液200ｍＭ及び２−メルカプトエタノール0.1
(w/v)%を含有する緩衝液に対して平衡化す
る。このカラムを差当り開始緩衝液2.5で
洗浄し、この酵素を引続き、開始緩衝液中の
０〜1M塩化ナトリウムの直線勾配液（２×
２）で溶離させる。Ｌ−２−ヒドロキシ−
４−メチルペンタン酸−デヒドロゲナーゼを
0.3M塩化ナトリウムで溶離させ、Ｄ−ラク
テート−デヒドロゲナーゼの残分を完全に分
離させる。活性フラクシヨンを限外濾過によ
り濃縮し、４℃で保持する。この精製工程を
第１表にまとめる。
に対する特異活性、 (b) ニコチンアミド−アデニン．ジヌクレオチド
（NAD）依存性、 (c) 作用至適温度40〜60℃、 (d) 安定性至適温度40℃、 (e) 脱水素反応に関する至適PH値8.0〜8.5、 (f) 還元反応に関する至適PH値7.0付近、 (g) PH−安定範囲6.5〜8.5、 (h) Ｌ−２−ヒドロキシ−４−メチルペンタン酸
に対するミハエリスー定数（ＫM−値）0.62×
10-3M 及び (i) Ｌ−２−ヒドロキシペンタン酸、Ｌ−２−ヒ
ドロキシヘキサン酸及びＬ−２−ヒドロキシ−
４−（メチルメルカプト）−酪酸に対する付加的
安定性 を有するＬ−２−ヒドロキシ−４−メチルペンタ
ン酸−デヒドロゲナーゼである。 本発明のもう１つの目的は、新規Ｌ−２−ヒド
ロキシ−４−メチルペンタン酸デヒドロゲナーゼ
の取得法にも関し、これは、ラクトバシルス・コ
ンフエスス（Lactobacillus confusus；
DSM20196）を炭素源及び窒素源並びに無酸塩、
生長物質及びビタミンを含有し、培養の開始時に
6.5のPH値を有する水性栄養培地中で培養し、培
養終了後に、遠心分離により細胞を取得し、これ
をPH７に緩衝した懸濁液中で崩壊させ、抽出物か
ら酵素を取得することよりなる。 最後に、本発明の目的は、Ｌ−２−ヒドロキシ
−４−メチルペンタン酸、Ｌ−２−ヒドロキシペ
ンタン酸、Ｌ−２−ヒドロキシヘキサン酸又はＬ
−２−ヒドロキシ−４−（メチルメルカプト）−酪
酸を酵素的に変換して相応する２−ケトカルボン
酸に変じるかもしくは２−ケト−４−メチルペン
タン酸、２−ケトペンタン酸、２−ケトヘキサン
酸又は２−ケト−４−（メトルメルカプト）−酪酸
を相応するＬ−２−ヒドロキシカルボン酸に変じ
るために、この新規酵素を使用することにもあ
る。 この新規酵素の特性は次のとおりである： (1) 作用 Ｌ−２−ヒドロキシ−４−メチルペンタン酸
−デヒドロゲナーゼ（Ｌ−Hic DH）は、補酵
素ニコチンアミド−アデニン−ジヌクレオチド
（NADH）と一緒になつて、２−ケト酸を還元
してＬ−２−ヒドロキシカルボン酸にすること
及び相応する逆反応に対して触媒作用をする： (2) 基質特異性 これは、Ｌ−２−ヒドロキシ−４−メチルペ
ンタン酸に対する特異活性及びＬ−２−ヒドロ
キシペンタン酸、Ｌ−２−ヒドロキシヘキサン
酸及びＬ−２−ヒドロキシ−４−（メチルメル
カプト）−酪酸に対して付加的活性を有する。 (3) 至適PH及び安定PH範囲 脱水素反応に関する至適PH；8.0〜8.5 還元反応に関する至適PH；7.0 安定PH範囲；6.5〜8.5 (4) 力価の測定 この均一蛋白質（ゲル−電気泳動で均一）
は、479単位／蛋白質mgの活性を有する。即
ち、蛋白質１mgは、１分間にケトカルボン酸
479μモル（２−ケト−４−メチルペンタン酸
として計算して）の還元に触媒作用をする。 (5) 作用適温の範囲 作用至適温度 40〜60℃ (6) 失活条件 この酵素は、４℃、6.5〜8.5のPH値で最低24
時間安定である。この酵素は、PH7.0で１時間
インキユーベートの際に40℃まで安定である。 (7) 阻害、活性化及び安定化 この酵素は補酵素としてのニコチンアミド−
アデニン−ジヌクレオチド（NADHもしくは
NAD+）の存在を必要とする。 (8) 精製法 粗製抽出物を液−液分配を３回行ない、最後
に得られる下相を引続き透析濾過する。引続
き、この透析濾過は、酵素溶液をDEAE−セル
ロース及び次いで5′AMP−セフアロース4Bの
クロマトグラフイにかける。合計して2800倍の
精製が得られる。こうして精製した酵素は、
479単位／蛋白質mgの活性を有する。 (9) 分子量 分子量は125000±15000ダルトンである。 (10) 結晶構造及び（11）元素分析 この酵素はラクトバシルス・コンフユスス中
に極めて低い濃度で存在するだけである。従つ
て、現在までのところでは晶出させることがで
きなかつた。結晶性物質として存在しないの
で、元素分析も行なうことができなかつた。 この新規酵素は約6.5〜8.5の間のPH範囲で最も
安定である。基質Ｌ−２−ヒドロキシ−４−メチ
ル−ペンタン酸に関するミハエリス定数（ＫM−
値）は0.62×10-3Mである。 この新規酵素は、ドイツチエン・ザンムルグ・
フオン・ミクロオルガニスメン（Deutschen
Sammlung von Mikroorganismen in
Go¨ttingen）から入手しうる微生物即ちラクトバ
シルス・コンフユスス（Lactobacillus
confusus；DSMカタログ番号20196）から得るこ
とができる。この微生物の培養は、ドイツチエ
ン・ザンムルング・フオン・ミクロオルガニスメ
ンのカタログに記載の又は後に記載の栄養培地中
で行なうのが有利である。次に、ラクトバシル
ス・コンフユスス（DSM20196）からのこの新規
酵素の取得法を記載する： １ 微生物の培養 この培養のために、ラクトバシルス・コンフ
ユスス（DSM20196）を次の培地中で培養す
る： グルコース 20 ｇ 酵素エキス 10 ｇ 肉エキス 0.5 ｇ 酢酸ナトリウム ５ ｇ K2HPO4 ２ ｇ MgSO4 0.2 ｇ MnSO4 0.05ｇ 脱イオン水 全量１ この溶液のPH値を6.5に調節し、次いで、121
℃（２バール）で15分間滅菌する。 培養のために、試験管中の培地５mlに、穿刺
寒天−管からのラクトバシルス・コンフユスス
白金耳一杯を接種し、30℃で16〜20時間培養す
る。次いで、生長した培養物４mlを、培地200
ml（500ml−エーレンマイヤーフラスコ中）に
対する接種培養物として使用する。 20〜24時間の後に、この200mlを10−醗酵
装置に対する予備培養物として使用し、次い
で、200に、かつ引続き、5000に接種する
ことができる。 生長の過程で低下するPH値は、醗酵装置中へ
の連続的アンモニア導入により5.0に保持す
る。対数的生長相の終り頃に、培養物を冷却
し、遠心により細胞を収得する。このビオマス
は−20℃で大きな活性損失なしに数週間〜数ケ
月貯蔵することができる。 ２ 酵素の取得及び精製 (a) 粗製抽出物 ラクトバシルス・コンフユスス−細胞（湿
つたビオマス）24Kgを、２−メルカプトエタ
ノール0.1(V/V)%を含有する100ｍモル燐酸
塩緩衝液（PH7.0）中に懸濁させる。60の
最終量は約40％の細胞懸濁液に相当する。細
胞を連続的に作動する工業用−ガラスパール
−ボールミル（NETZSCH LME20）中で崩
壊させる。内容量22.7の水平に配置された
粉砕容器に0.55〜0.85mmガラスパールを充填
すると、19.3（85％）の振動容量が生じ
る。この崩壊は、1200UMPの撹拌回転数及
び100/hの貫流速度で実施する。粉砕容器
の冷却外套を、この経過の間に、生成物の加
温を充分にさけるために、−10℃のエチレン
グリコール溶液で冷却する。２回貫流の後
に、約90％の分解率が達成される。懸濁液の
PHは、ホモゲナイジングの間に6.3まで低下
する。 (b) 液−液−分配 第１の分配工程を用いて、細胞断片をこの
精製抽出物から分離する。このために、ポリ
エチレングリコール1500 18(w/w)%、燐酸
塩緩衝液（PH7.0）７(w/w)%及び粗製抽出
物60を120Kg−系中に含有する水性２相系
を製造する。良好な分配を達成するために、
この２相系を２時間撹拌し、引続き、盤形分
離装置（α−LavalのGyrotester Ｂ型）を用
いて分離する。相の分離の間の貫流速度は60
/hであり、13.5mmの調整ネジ４個を用い
る。上相（86）は、実際にＬ−２−ヒドロ
キシ−４−メチルペンタン酸−デヒドロゲナ
ーゼの全活性（収率98.4％）を有する。下相
は、細胞断片を含有し、これを捨てる。 先の工程の酵素含有上相に最終量172に
対して計算してポリエチレングリコール
10000 ２(w/v)%、PH6.0の燐酸塩緩衝液10
(w/v)%及び塩化ナトリウム0.2Mを加え、２
時間撹拌する。生じるポリエチレングリコー
ル／塩−系をガラス容器中で沈殿させると、
その分離は約１時間後に完全である。この分
配工程では、非常に多量の蛋白質が特に過剰
に存在するＤ−ラクテート−デヒドロゲナー
ゼの大部分が下相に抽出されるが、Ｌ−２−
ヒドロキシ−４−メチルペンタン酸−デヒド
ロゲナーゼ（71）は、充分に上相に残る。
相の分離は下相の流出により行なう。 先の工程の上相に、PH6.0の燐酸塩緩衝液
10(w/v)%及び塩化ナトリウム0.2Mを添加
し、次いで、142まで充填する。２時間の
撹拌時間の後に、沈殿槽中で相を分離させ
る。Ｌ−２−ヒドロキシ−４−メチルペンタ
ン酸−デヒドロゲナーゼ−活性が下相（82
）中に存在する。 (c) 透析濾過 下相をロミコン・中空繊維パトローネ
（Romicon Hohlfaserpatrone；HF30−20−
GM−80型）中で濃縮し、PH6.5の燐酸塩緩衝
液の添加により、最終濃度200ｍＭになるま
で透析濾過する。引接き、アミコン−中空繊
維パトローネ（Amicon−
Hohlfaserpatrone；HI930）を用いて、この
酵素溶液を500mlまで濃縮する。 (d) DEAE−セルロース−クロマトグラフイ この濃縮され透析濾過された酵素を、５×
40cmカラム（Whatman−Cellulose DE52が
充填されている）にポンプ装入する。この
DEAE−セルロースを、PH6.5の燐酸塩緩衝
液200ｍＭ及び２−メルカプトエタノール0.1
(w/v)%を含有する緩衝液に対して平衡化す
る。このカラムを差当り開始緩衝液2.5で
洗浄し、この酵素を引続き、開始緩衝液中の
０〜1M塩化ナトリウムの直線勾配液（２×
２）で溶離させる。Ｌ−２−ヒドロキシ−
４−メチルペンタン酸−デヒドロゲナーゼを
0.3M塩化ナトリウムで溶離させ、Ｄ−ラク
テート−デヒドロゲナーゼの残分を完全に分
離させる。活性フラクシヨンを限外濾過によ
り濃縮し、４℃で保持する。この精製工程を
第１表にまとめる。
【表】
Ｌ−２−ヒドロキシ−４−メチルペンタン酸−
デヒドロゲナーゼの分子量をセフアクリルS300
スーパーフアイン（Sephacryl S300superfine）
を用いるゲル濾過により約125000±15000ダルト
ンまで測定した。この酵素の特異活性はゲル濾過
により100U・mg-1を越える値まで改良された。 次の例１で、濃縮されたＬ−２−ヒドロキシ−
４−メチルペンタン酸−デヒドロゲナーゼ−調製
物の種々の２−ヒドロキシカルボン酸を相応する
２−ケトカルボン酸に変じることに関する活性を
試験する。それぞれ最大当初反応速度Ｖnax及び
ＫM−値を測定する。 例 １ Ｌ−２−ヒドロキシ−４−メチルペンタン酸の
脱水素に関する反応速度を次の試験バツチで試験
した：PH8.0の燐酸塩緩衝液0.099M、NAD+0.3ｍ
Ｍ及び制限量の酵素。Ｌ−２−ヒドロキシ−４−
メチルペンタン酸の濃度を0.2〜10ｍＭの範囲で
変えた。生じるNADHによる吸光度の増加を
340nｍで測定した。試験をＬ−２−ヒドロキシ
−４−メチルペンタン酸なしに進行する際に得ら
れる空値を引いた。酵素活性を国際単位Ｕ（単
位）で示し、ここで1UはNADH1μモル／min及
びmlの生成を意味する。相応する方法で、他の２
−ヒドロキシカルボン酸に対する酵素活性を測定
した。試験時における相応する２−ヒドロキシカ
ルボン酸の濃度は、0.2〜最大100ｍＭの間で変動
した。基質濃度の増加により、最大当初反応速度
Ｖnaxを測定した。ミハエリス−定数（ＫM−値）
は、反応速度Ｖが最大当初反応速度の半分になる
際の基質濃度（モル／）に相当する。この反応
速度論的定数Ｖnax及びＫMをミハエリスーメンテ
ン−式の非線形回帰により測定し、第２表にまと
める。 最大当初反応速度Ｖnax（μモル×min-1×mg-1
の次元を有する）は、基質飽和（一般に10×Ｋ
M、さもなければ特に規定される）時に測定した
量活性（U/ml）を使用酵素溶液の蛋白質含分
（mg/ml）で割ることにより得られる。
デヒドロゲナーゼの分子量をセフアクリルS300
スーパーフアイン（Sephacryl S300superfine）
を用いるゲル濾過により約125000±15000ダルト
ンまで測定した。この酵素の特異活性はゲル濾過
により100U・mg-1を越える値まで改良された。 次の例１で、濃縮されたＬ−２−ヒドロキシ−
４−メチルペンタン酸−デヒドロゲナーゼ−調製
物の種々の２−ヒドロキシカルボン酸を相応する
２−ケトカルボン酸に変じることに関する活性を
試験する。それぞれ最大当初反応速度Ｖnax及び
ＫM−値を測定する。 例 １ Ｌ−２−ヒドロキシ−４−メチルペンタン酸の
脱水素に関する反応速度を次の試験バツチで試験
した：PH8.0の燐酸塩緩衝液0.099M、NAD+0.3ｍ
Ｍ及び制限量の酵素。Ｌ−２−ヒドロキシ−４−
メチルペンタン酸の濃度を0.2〜10ｍＭの範囲で
変えた。生じるNADHによる吸光度の増加を
340nｍで測定した。試験をＬ−２−ヒドロキシ
−４−メチルペンタン酸なしに進行する際に得ら
れる空値を引いた。酵素活性を国際単位Ｕ（単
位）で示し、ここで1UはNADH1μモル／min及
びmlの生成を意味する。相応する方法で、他の２
−ヒドロキシカルボン酸に対する酵素活性を測定
した。試験時における相応する２−ヒドロキシカ
ルボン酸の濃度は、0.2〜最大100ｍＭの間で変動
した。基質濃度の増加により、最大当初反応速度
Ｖnaxを測定した。ミハエリス−定数（ＫM−値）
は、反応速度Ｖが最大当初反応速度の半分になる
際の基質濃度（モル／）に相当する。この反応
速度論的定数Ｖnax及びＫMをミハエリスーメンテ
ン−式の非線形回帰により測定し、第２表にまと
める。 最大当初反応速度Ｖnax（μモル×min-1×mg-1
の次元を有する）は、基質飽和（一般に10×Ｋ
M、さもなければ特に規定される）時に測定した
量活性（U/ml）を使用酵素溶液の蛋白質含分
（mg/ml）で割ることにより得られる。
【表】
＊ エナンチオマー混合物において、計算
は全濃度を基準とした。
この表は、一連の２−ヒドロキシカルボン酸が
酸化されて２−ケトカルボン酸になることを示し
ている。純粋のＬ−エナンチオマー及びＤ・Ｌ−
混合物に関して認められた定数を比較する際に、
Ｄ−成分は、測定した定数の範囲で、反応速度論
的定数に対して何の影響をも有しないことがわか
る。これに反して基質濃度100ｍＭにおいては、
既に、明白な基質過剰−阻害が顕著である（第３
表）。 第３表に記載の相対的活性（U/ml）は、基質
最終濃度１ｍＭ、10ｍＭ及び100ｍＭで測定し
た。すべての場合に、同じ酵素溶液を使用した。
は全濃度を基準とした。
この表は、一連の２−ヒドロキシカルボン酸が
酸化されて２−ケトカルボン酸になることを示し
ている。純粋のＬ−エナンチオマー及びＤ・Ｌ−
混合物に関して認められた定数を比較する際に、
Ｄ−成分は、測定した定数の範囲で、反応速度論
的定数に対して何の影響をも有しないことがわか
る。これに反して基質濃度100ｍＭにおいては、
既に、明白な基質過剰−阻害が顕著である（第３
表）。 第３表に記載の相対的活性（U/ml）は、基質
最終濃度１ｍＭ、10ｍＭ及び100ｍＭで測定し
た。すべての場合に、同じ酵素溶液を使用した。
【表】
反応速度のNAD+−濃度による依存性をPH8.0
の燐酸塩緩衝液0.1M、Ｌ−２−ヒドロキシ−４
−メチルペンタン酸6.3ｍＭ及び制限量の酵素を
含有する試験バツチで測定した。NAD+−濃度は
0.05〜70ｍＭの間で変動した。 NAD+に関するＫM−値は、ミハエリス−メン
テン式の非線形回線により測定し、3.3×104Mで
あつた。 次の例２で、種々の２−ケトカルボン酸を相応
する２−ヒドロキシカルボン酸に変えるための濃
縮されたＬ−２−ヒドロキシ−４−メチルペンタ
ン酸−デヒドロゲナーゼ調製品の活性を試験し
た。それぞれ、最大当初反応速度Ｖnax及びＫM−
値を測定した。 例 ２ ２−ケト−４−メチルペンタン酸をＬ−２−ヒ
ドロキシ−４−メチルペンタン酸に変える反応に
関する反応速度を次の試験バツチで測定する：PH
7.0の燐酸塩緩衝液NADH0.235ｍＭ及び制限量の
酵素。２−ケト−４−メチル−ペンタン酸の濃度
を0.01〜10ｍＭの範囲で変じた。反応を光学試験
により追跡し、この試験で、340nｍにおける
NADHの吸光度の減少を測定する。この試験を２
−ケト−４−メチルペンタン酸なしに実行する際
に得られる空値を引いた。この酵素活性を国際単
位（Ｕ）で示し、ここで1UはNADH1μM/min及
びmlの消費を意味する。相応する方法で、他の２
−ケトカルボン酸に対する酵素活性を測定した。
ケト酸−濃度もそれぞれ0.01〜最大10ｍＭの間で
変えた。ミハエリス−定数（ＫM−値）は、反応
速度Ｖが最大当初反応速度の半分に達する基質濃
度（モル／）に相当する。反応速度論的定数Ｖ
nax及びＫMをミハエリス−メンテン式の非線形回
帰により測定し、次の第４表にまとめる。
の燐酸塩緩衝液0.1M、Ｌ−２−ヒドロキシ−４
−メチルペンタン酸6.3ｍＭ及び制限量の酵素を
含有する試験バツチで測定した。NAD+−濃度は
0.05〜70ｍＭの間で変動した。 NAD+に関するＫM−値は、ミハエリス−メン
テン式の非線形回線により測定し、3.3×104Mで
あつた。 次の例２で、種々の２−ケトカルボン酸を相応
する２−ヒドロキシカルボン酸に変えるための濃
縮されたＬ−２−ヒドロキシ−４−メチルペンタ
ン酸−デヒドロゲナーゼ調製品の活性を試験し
た。それぞれ、最大当初反応速度Ｖnax及びＫM−
値を測定した。 例 ２ ２−ケト−４−メチルペンタン酸をＬ−２−ヒ
ドロキシ−４−メチルペンタン酸に変える反応に
関する反応速度を次の試験バツチで測定する：PH
7.0の燐酸塩緩衝液NADH0.235ｍＭ及び制限量の
酵素。２−ケト−４−メチル−ペンタン酸の濃度
を0.01〜10ｍＭの範囲で変じた。反応を光学試験
により追跡し、この試験で、340nｍにおける
NADHの吸光度の減少を測定する。この試験を２
−ケト−４−メチルペンタン酸なしに実行する際
に得られる空値を引いた。この酵素活性を国際単
位（Ｕ）で示し、ここで1UはNADH1μM/min及
びmlの消費を意味する。相応する方法で、他の２
−ケトカルボン酸に対する酵素活性を測定した。
ケト酸−濃度もそれぞれ0.01〜最大10ｍＭの間で
変えた。ミハエリス−定数（ＫM−値）は、反応
速度Ｖが最大当初反応速度の半分に達する基質濃
度（モル／）に相当する。反応速度論的定数Ｖ
nax及びＫMをミハエリス−メンテン式の非線形回
帰により測定し、次の第４表にまとめる。
【表】
この表は、一連の２−ケトカルボン酸をＬ−２
−ヒドロキシ−４−メチルペンタン酸を本発明に
よりＬ−２−ヒドロキシ−４−メチルペンタン酸
−デヒドロゲナーゼで還元して相応するＬ−２−
ヒドロキシ−カルボン酸にすることができること
を示している。 第５表に記載の相対的活性（U/ml）の基質最
終濃度0.1ｍＭ、１ｍＭ及び10ｍＭで測定した。
すべての場合に、同じ酵素溶液を用いた。10ｍＭ
ですべての基質において、すでに、基質過剰−阻
害が認められた。 反応速度とNADH濃度と関係を、PH7.0の燐酸
塩緩衝液0.1M、２−ケト−４−メチルペンタン
酸0.79ｍＭ及び制限量の酵素を含有する試験バツ
チ中で測定した。NADH濃度を0.01〜0.33ｍＭの
範囲で変えた。NADHに関するＫM−値をミハエ
リスーメンテン式の非線形回帰により測定すると
3.3×10-5Mである。
−ヒドロキシ−４−メチルペンタン酸を本発明に
よりＬ−２−ヒドロキシ−４−メチルペンタン酸
−デヒドロゲナーゼで還元して相応するＬ−２−
ヒドロキシ−カルボン酸にすることができること
を示している。 第５表に記載の相対的活性（U/ml）の基質最
終濃度0.1ｍＭ、１ｍＭ及び10ｍＭで測定した。
すべての場合に、同じ酵素溶液を用いた。10ｍＭ
ですべての基質において、すでに、基質過剰−阻
害が認められた。 反応速度とNADH濃度と関係を、PH7.0の燐酸
塩緩衝液0.1M、２−ケト−４−メチルペンタン
酸0.79ｍＭ及び制限量の酵素を含有する試験バツ
チ中で測定した。NADH濃度を0.01〜0.33ｍＭの
範囲で変えた。NADHに関するＫM−値をミハエ
リスーメンテン式の非線形回帰により測定すると
3.3×10-5Mである。
【表】
引続き、次の例３に、米国特許第4326031号明
細書に記載の方法のよる２−ケト−３−メチルペ
ンタン酸を連続的な酵素的変換によりＬ−２−ヒ
ドロキシ−４−メチルペンタン酸に変じる実験を
記載する。 例 ３ 25℃の温度に保持した容量11.3mlの平膜反応器
〔Flachmembranreaktor：磁気撹拌機及び名目上
の排除限界5000を有する直径62mmの限外濾過膜；
（Amicon.Witten社製YM5）を備えた〕を、滅菌
のために11.3ml/hの搬送速度に調節された配量ポ
ンプを用いて、ホルムアルデヒド水溶液で約５時
間洗浄した。引続き、更に約10時間の間に蒸溜水
によりホルムアルデヒドを押し出した。その際、
同様に、11.3ml/hの搬送速度で、約10時間滅菌フ
イルター（0.2μ）を通して濾過した基質溶液
（これは、２−ケト−４−メチルペンタン酸のナ
トリウム塩100ｍモル／及びギ酸ナトリウム400
ｍモル／並びに緩衝剤としての燐酸カリウム50
ｍモル／を含有し、苛性ソーダでPH７に調節し
た）を導入した。更に、滅菌フイルターの前で、
スプレーを用いる連続的基質配量により、水溶液
の形のギ酸塩−デヒドロゲナーゼの溶液（基質と
してのギ酸塩、25℃及びPH８における活性26.3μ
モル／ml×min、をスプレー導入した。その後、
相応して水溶液の形のＬ−２−ヒドロキシ−４−
メチルペンタン酸−デヒドロゲナーゼ（基質とし
ての２−ケト−４−メチルペンタノエート、25℃
及びPH７における活性241.7μモル／ml×min）
0.5mlをスプレー導入する。この反応の開始のた
めに、更に、平均分子量20000を有するポリエチ
リングリコールに結合しているNADH5.73ｍモ
ル／を含有する補酵素溶液２mlをスプレー導入
した。すべての触媒を導入した後、基質流を17
ml/hに高めると、40分の平均帯留時間が得られ
た。変換率を濾液流中に設置されたポーラリメー
タ流液キユベツトを用いて連続的に追跡した。膜
の上の圧力差は、当初に0.2バールであり、８作
業日の経過の間に1.3バールに上昇した。191時間
（約８日）の作業時間内に、Ｌ−２−ヒドロキシ
−４−メチルペンタン酸276ｍモル（37ｇに相
当）が得られた。変換率は93.9％から76.3％まで
低下した（平均変換率85.1％）。この補酵素に関
して、１日当りの失活率は9.29％、ギ酸塩−デヒ
ドロゲナーゼに関しては１日当り4.54％、Ｌ−２
−ヒドロキシ−４−メチルペンタン酸−デヒドロ
ゲナーゼに関しては１日当り4.68％の失活率が得
られた。全作業時間にわたる空時収率は、平均し
て3.07モル／×dayもしくは411ｇ/×dayで
あつた。補酵素（消費された）１モル当り、生成
物71800モルが生じた。これは、NAD+（生得）
68.9mg／生成物Kgの要求量に相当する。この酵素
要求量は、ギ酸塩−デヒドロゲナーゼ409U／生
成物KgもしくはＬ−２−ヒドロキシ−４−メチル
ペンタン酸−デヒドロゲナーゼ617U／生成物Kg
であつた。全作業時間の間に測定した平均ギ酸塩
−デヒドロゲナーゼ−活性は、3.74U/mlであ
り、２−ヒドロキシ−４−メチルペンタン酸−デ
ヒドロゲナーゼに関しては5.48U/mlであつた。
平均補酵素濃度は0.48ｍモル／であつた。全作
業時間にわたる平均反応速度は2.13μモル／ml×
minであつた。
細書に記載の方法のよる２−ケト−３−メチルペ
ンタン酸を連続的な酵素的変換によりＬ−２−ヒ
ドロキシ−４−メチルペンタン酸に変じる実験を
記載する。 例 ３ 25℃の温度に保持した容量11.3mlの平膜反応器
〔Flachmembranreaktor：磁気撹拌機及び名目上
の排除限界5000を有する直径62mmの限外濾過膜；
（Amicon.Witten社製YM5）を備えた〕を、滅菌
のために11.3ml/hの搬送速度に調節された配量ポ
ンプを用いて、ホルムアルデヒド水溶液で約５時
間洗浄した。引続き、更に約10時間の間に蒸溜水
によりホルムアルデヒドを押し出した。その際、
同様に、11.3ml/hの搬送速度で、約10時間滅菌フ
イルター（0.2μ）を通して濾過した基質溶液
（これは、２−ケト−４−メチルペンタン酸のナ
トリウム塩100ｍモル／及びギ酸ナトリウム400
ｍモル／並びに緩衝剤としての燐酸カリウム50
ｍモル／を含有し、苛性ソーダでPH７に調節し
た）を導入した。更に、滅菌フイルターの前で、
スプレーを用いる連続的基質配量により、水溶液
の形のギ酸塩−デヒドロゲナーゼの溶液（基質と
してのギ酸塩、25℃及びPH８における活性26.3μ
モル／ml×min、をスプレー導入した。その後、
相応して水溶液の形のＬ−２−ヒドロキシ−４−
メチルペンタン酸−デヒドロゲナーゼ（基質とし
ての２−ケト−４−メチルペンタノエート、25℃
及びPH７における活性241.7μモル／ml×min）
0.5mlをスプレー導入する。この反応の開始のた
めに、更に、平均分子量20000を有するポリエチ
リングリコールに結合しているNADH5.73ｍモ
ル／を含有する補酵素溶液２mlをスプレー導入
した。すべての触媒を導入した後、基質流を17
ml/hに高めると、40分の平均帯留時間が得られ
た。変換率を濾液流中に設置されたポーラリメー
タ流液キユベツトを用いて連続的に追跡した。膜
の上の圧力差は、当初に0.2バールであり、８作
業日の経過の間に1.3バールに上昇した。191時間
（約８日）の作業時間内に、Ｌ−２−ヒドロキシ
−４−メチルペンタン酸276ｍモル（37ｇに相
当）が得られた。変換率は93.9％から76.3％まで
低下した（平均変換率85.1％）。この補酵素に関
して、１日当りの失活率は9.29％、ギ酸塩−デヒ
ドロゲナーゼに関しては１日当り4.54％、Ｌ−２
−ヒドロキシ−４−メチルペンタン酸−デヒドロ
ゲナーゼに関しては１日当り4.68％の失活率が得
られた。全作業時間にわたる空時収率は、平均し
て3.07モル／×dayもしくは411ｇ/×dayで
あつた。補酵素（消費された）１モル当り、生成
物71800モルが生じた。これは、NAD+（生得）
68.9mg／生成物Kgの要求量に相当する。この酵素
要求量は、ギ酸塩−デヒドロゲナーゼ409U／生
成物KgもしくはＬ−２−ヒドロキシ−４−メチル
ペンタン酸−デヒドロゲナーゼ617U／生成物Kg
であつた。全作業時間の間に測定した平均ギ酸塩
−デヒドロゲナーゼ−活性は、3.74U/mlであ
り、２−ヒドロキシ−４−メチルペンタン酸−デ
ヒドロゲナーゼに関しては5.48U/mlであつた。
平均補酵素濃度は0.48ｍモル／であつた。全作
業時間にわたる平均反応速度は2.13μモル／ml×
minであつた。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ 次の特性 (a) Ｌ−２−ヒドロキシ−４−メチルペンタン酸
に対する特異活性及びＬ−２−ヒドロキシペン
タン酸、Ｌ−２−ヒドロキシヘキサン酸及びＬ
−２−ヒドロキシ−４−（メチルメルカプト）−
酪酸に対する付加的活性、 (b) 補酵素としてのニコチンアミド−アデニン−
ジヌクレオチド（NAD）依存性、 (c) 作用適温範囲40〜60℃、 (d) 安定性至適温度40℃、 (e) 脱水素反応に関する至適PH値8.0〜8.5、 (f) 還元反応に関する至適PH値7.0、 (g) 安定PH値6.5〜8.5、 (h) Ｌ−２−ヒドロキシ−４−メチルペンタン酸
に対するミハエリス−定数（ＫM−値）0.62×
10-3M (i) 力価479単位／蛋白質mg 及び (j) 分子量：125000±15000ダルトンを有するこ
とを特徴とする、Ｌ−２−ヒドロキシ−４−メ
チルペンタン酸−デヒドロゲナーゼ。 ２ 次の特性： (a) Ｌ−２−ヒドロキシ−４−メチルペンタン酸
に対する特異活性及びＬ−２−ヒドロキシペン
タン酸、Ｌ−２−ヒドロキシヘキサン酸及びＬ
−２−ヒドロキシ−４−（メチルメルカプト）−
酪酸に対する付加的活性、 (b) 補酵素としてのニコチンアミド−アデニン−
ジヌクレオチド（NAD）依存性、 (c) 作用適温範囲40〜60℃、 (d) 安定性至適温度40℃、 (e) 脱水素反応に関する至適PH値8.0〜8.5、 (f) 還元反応に関する至適PH値7.0、 (g) 安定PH範囲6.5〜8.5、 (h) Ｌ−２−ヒドロキシ−４−メチルペンタン酸
に対するミハエリス−定数（ＫM−値）0.62×
10-3M (i) 力価479単位／蛋白質mg 及び (j) 分子量125000±15000ダルトンを有するＬ−
２−ヒドロキシ−４−メチルペンタン酸−デヒ
ドロゲナーゼを取得するために、ラクトバシル
ス・コンフユスス（DSM20196）を、炭素源及
び窒素源、並びに無機塩、生長物質及びビタミ
ンを含有し、培養開始時に6.5のPH値を有する
水性栄養培地中で培養し、培養終了後に、細胞
を遠心分離により取得し、これをPH７の緩衝懸
液中で崩壊させ、抽出物から酵素を得ることを
特徴とする、Ｌ−２−ヒドロキシ−４−メチル
ペンタン酸−デヒドロゲナーゼの取得法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE3234022 | 1982-09-14 | ||
| DE3234022.2 | 1982-09-14 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS5974983A JPS5974983A (ja) | 1984-04-27 |
| JPS6111591B2 true JPS6111591B2 (ja) | 1986-04-03 |
Family
ID=6173169
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP58168537A Granted JPS5974983A (ja) | 1982-09-14 | 1983-09-14 | Ｌ−ヒドロキシ−４−メチルペンタン酸−デヒドロゲナ−ゼ及びその取得法 |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4530903A (ja) |
| EP (1) | EP0103210B1 (ja) |
| JP (1) | JPS5974983A (ja) |
| CA (1) | CA1194436A (ja) |
| DE (1) | DE3374695D1 (ja) |
Families Citing this family (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE3320495A1 (de) * | 1983-06-07 | 1984-12-13 | Degussa Ag, 6000 Frankfurt | Mikrobiologisch hergestellte d-2-hydroxy-4-methylpentansaeure-dehydrogenase, verfahren zu ihrer gewinnung und ihre verwendung |
| DE3332562A1 (de) * | 1983-09-09 | 1985-03-28 | Basf Ag, 6700 Ludwigshafen | 2-oxocarbonsaeurereduktase, ihre herstellung und verwendung |
| US5256552A (en) * | 1988-02-08 | 1993-10-26 | Daicel Chemical Industries, Ltd. | Process for the production of optically active 2-hydroxy-4-phenylbutyric acid |
| US5151358A (en) * | 1989-06-13 | 1992-09-29 | Genencor International, Inc. | Processes for the recovery of naturally produced chymosin |
| US5139943A (en) * | 1989-06-13 | 1992-08-18 | Genencor International, Inc. | Processes for the recovery of microbially produced chymosin |
| WO1991003560A1 (de) * | 1989-09-11 | 1991-03-21 | GESELLSCHAFT FüR BIOTECHNOLOGISCHE FORSCHUNG MBH (GBF) | L-HicDH-GEN, DNA-TEILSEQUENZEN DES GENS, EXPRESSIONSVEKTOREN MIT DEM GEN ODER DEN TEILSEQUENZEN, E.-COLI-STÄMME FÜR DIE HERSTELLUNG VON L-HicDH, L-HicDH SOWIE VERFAHREN UNTER DESSEN VERWENDUNG |
| US5385827A (en) * | 1989-09-20 | 1995-01-31 | Clark; John R. | Method of geochemical prospecting |
| JPH0436187A (ja) * | 1990-05-31 | 1992-02-06 | Sapporo Breweries Ltd | 抗腫瘍性デキストランの製造法 |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CH628009A5 (de) * | 1977-07-26 | 1982-02-15 | Hoffmann La Roche | Verfahren zur herstellung von optisch aktiven alpha-hydroxycarbonsaeuren. |
| DE2841414C2 (de) * | 1978-09-22 | 1980-04-03 | Gesellschaft Fuer Biotechnologische Forschung Mbh (Gbf), 3300 Braunschweig | Verfahren zur Herstellung von an Makromoleküle gebundenen, ein Adeninringsystem enthaltenden Koenzymen |
| DE2930087A1 (de) * | 1979-07-25 | 1981-02-26 | Biotechnolog Forschung Gmbh | Verfahren zur kontinuierlichen enzymatischen umwandlung von wasserloeslichen alpha -ketocarbonsaeuren in die entsprechenden alpha -hydroxycarbonsaeuren |
-
1983
- 1983-08-19 EP EP83108199A patent/EP0103210B1/de not_active Expired
- 1983-08-19 DE DE8383108199T patent/DE3374695D1/de not_active Expired
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