JPS6113185B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 生体で溶血が起ると血漿中に遊離したヘモグロ
ビンは、ハプトグロビンと結合して肝臓へ運ば
れ、そこにおいて代謝されて鉄は再利用される。

しかし、高度の溶血を伴うような疾患や外傷の
際には血漿ハプトグロビンは消費し尽され過剰の
遊離ヘモグロビンは遊離のまま体内を循環し１部
は尿中に排出される。従つて臨床において血中や
尿中の遊離ヘモグロビンを測定することは重要な
意義を有する。

一方、高度の溶血を伴い血色素尿症や乏尿を呈
する患者にハプトグロビン製剤を注射してこれを
治療あるいは予防しようとするとき血漿中の遊離
ヘモグロビンやヘモグロビン−ハプトグロビン複
合体の量、あるいは尿中ヘモグロビン量を測定す
ることは大切である。

ヘモグロビンの測定は、これまでシアンメトヘ
モグロビン法、ベンジジン法およびハイドロサル
フアイト法等の吸光度法で行なわれているが、遊
離ヘモグロビンとヘモグロビン−ハプトグロビン
複合体のヘモグロビンとを分別して定量すること
はできず、その上側結果を得るまでに時間を要し
た。

本発明の目的は簡単な手段により迅速かつ精確
に遊離のヘモグロビンのみならずハプトグロビン
との複合体の形のヘモグロビンをも定量測定する
方法ならびに定量測定キツトを提供するにある。

本発明により、 (1) ヘモグロビン含有検体を、まず固定化ハプト
グロビンと接触させて検体中の遊離のヘモグロ
ビンをハプトグロビンとの複合体として補集
し、次いで固定化抗ヘモグロビン抗体と接触さ
せて検体中のハプトグロビン−ヘモグロビン複
合体を抗ヘモグロビン抗体との複合体として補
集することを特徴とするヘモグロビン含有検体
中のヘモグロビン定量方法、及び (2) 上層の固定化ハプトグロビン層および下層の
固定化抗ヘモグロビン抗体層よりなることを特
徴とする遊離ヘモグロビンおよびハプトグロビ
ンとの複合体の形で存在するヘモグロビンを含
む検体中のヘモグロビン定量測定キツドが提供
される。

本発明で使用するハプトグロビン（以下Hpと
いうこともある。）は、その由来を特に限定され
るものではなく哺乳動物等のHpのように多量に
回収できるものであればよい。

抗ヘモグロビン抗体（以下抗Hbという）は哺
乳動物等にヒトヘモグロビンを投与・免疫して得
られる抗ヒトヘモグロビン血清より抗体の精製法
として公知の塩析法、エタノール分画法、クロマ
トグラフイー法などの方法によつて提供される。

Hp及び抗Hbを担体上に固定化して不溶性とす
る方法は一般に酵素など活性タンパク質の不溶化
法として知られ特開昭51−105186号に詳記され
る。

即ち、従来実施又は提案されている酵素の不溶
化方法としては、高分子多糖体を臭化シアンで活
性化させたものに酵素を結合させるとか、ケイ素
材料に酵素を共有結合させるなど不溶性担体に化
学的に結合させる方法（特開昭46−1838号）、活
性炭吸着などの物理的（米国特許第2717852号）
若しくは塩基性陰イオン交換体に吸着させるなど
の静電的（特公昭45−6870号）な方法、適当なマ
トリツクス、例えばフイブリン重合体中に酵素を
埋没させる方法（特開昭49−41584号）などが挙
げられ、本発明に用いられる固定化Hp及び固定
化抗Hbの製造、酵素の代りに、Hpおよび抗Hb
をそれぞれ用いること以外は同じ方法によつて達
せられる。

Hpまたは抗Hbを化学的に結合させて不溶化す
るために用いられる担体は、これらの蛋白質と結
合可能な基、例えばカルボキシル基又はアミノ基
などを有する水不溶性有機又は無機高分子材料で
ある。例えばポリアクリルアミドゲル〔バイオー
ゲル（Bio−gel）Ｐ−300など：米国、バイオゲ
ル社発売〕、アガロース〔セフアロース
（Sepharose）4Bなど：スウエーデン国、フアル
マシア社発売〕、デキストラン〔セフアデツクス
（Sephadex）G200、DEAE−セフアデツクス
（DEAE−Sephadex）、QAE−セフアデツクス
（QAE−Sephadex）など：スウエーデン国、フ
アルマシア社発売〕、更にはセルロース（DEAE
−セルロース、CM−セルロース、AE−セルロ
ースなど）のようなHpおよび抗Hb（以下Hpな
どという）と直接結合しない多糖体で、これらを
臭化シアンで処理することにより結合能を与えた
材料が有利に用いられる。多糖類を臭化シアンで
処理する方法は、p.クアトレカサス及びC.B.アン
フインセン（Cuatrecasas、P.and Anfinsen、C.
B.）〔メソーズ イン エン ザイモロジイ
XII、ジヤコビ編（Methods in Enzymology.
XII．ed.by Jakoby、W.B.）pp345、（1971）〕に
よつて提案されているアフイニテイ−クロマトグ
ラフイーの手法でタンパクを不溶化する方法とし
て既に確立されている。

同様にして結合基を有しないポリアミド、例え
ばナイロン、ポリアセタール、ポリスチレンなど
の高分子重合体も適当な処理剤、例えば臭化シア
ンで処理することによつて、Hpなどとの結合能
の基を与えることができる。更に又ガラスのよう
な無機材料も、これをアミノアルキルシランと処
理することによつて、Hpなどと結合するアミノ
基を与えることができ、Hpなどの不溶化に用い
ることが可能である。

Hpなどを物理的又は静電的に吸着させて不溶
化させる担体としては、ケイソウ土、活性炭など
の外、DEAE−セフアデツクス、DEAE−セルロ
ースなどのイオン交換体などが挙げられる。又
Hpなどを不溶化する架橋剤としては、例えばグ
ルタールアルデヒドのような二官能性化合物を用
いることができる。

酵素を閉じ込めて不溶化させるのに用いられる
マトリツクスは、高分子量の有機重合体のゲル又
は繊維が用いられるが、Hpなどについても適当
な手段を選ぶことによつて、これらが用いられ得
る。例えば単量体の重合の際に、Hpなどが重合
系に存在すれば、それは生成重合体ゲル中に閉じ
込められる。

担体にタンパク結合可能基を与える処理剤で処
理する条件は次のとおりである。

多糖類担体の場合、通常臭化シアンを用い、
PH10〜12、で冷却しながら行う。

高分子重合体である巨大網状構造を有するメ
タアクリレート重合体も又同様にして、PH10〜
12で臭化シアンで活性化するとよい結果が得ら
れる。

無機質担体であるガラスの活性化は、オルガ
ノシランによつて行われる。その条件として
は、不活性溶媒にオルガノシランを溶かし、室
温で十分な時間反応させることによつて得られ
る。

重合体−トラツプ法としては、Hpなどを吸
着する担体はすべて可能であるが、より簡便な
担体が好ましい。例えばDEAE−セルロース
は、蒸留水で十分に洗浄し、温度を室温に保つ
てかきまぜることによつてHpなどと結合さ
せ、このHpなどとの結合担体は、次いで２次
的担体でもつて重合化させ得る。

以上のようにして得られた結合能を有する担体
とHpなどとの反応は、中性付近（PH６〜８）で
約３〜25℃で行うことができる。

このようにして得た固定化Hpおよび固定化抗
Hbは、ヘモグロビン測定用キツトとして使用す
るために適当な装置にセツトする。装置は、筒状
であり、適当な材質の筒内に一定量の固定化Hp
を上層部に、固定化抗Hbを下層部にセツトし形
成する。

セツトされる固定化Hp及び固定化抗Hbの粒子
径は40〜200μで均一化したものが使用される。

固定化Hpおよび固定化抗Hbの装置への各々の
セツト量は、体積量として0.5〜70cm³、筒の長さ
２〜20cm好ましくは、４〜10cmが一般的に良好な
キツトを提供する。

例えば内径1.5cm長さ10cmの筒状装置に固定化
Hp又は固定化抗Hbを充填した場合、各々約５〜
100mgのヘモグロビン又はヘモグロビン−ハプト
グロビン複合体を結合する。

このようにセツトされた固定化Hpおよび固定
化抗Hbからなるキツトは、あらかじめその固定
化Hpのセツト量と遊離ヘモグロビン量及び固定
化抗Hbのセツト量とヘモグロビン−ハプトグロ
ビン複合体量との検量線を求め相応する量目を例
えば濃度として装置に付置せしめる。

キツトによるヘモグロビン量の測定は、固定化
Hp及び固定化抗Hbに吸着し、赤色に着色した部
分の長さ又は体積を測定することにより、試料中
の遊離ヘモグロビン量及びヘモグロビン−ハプト
グロビン複合体量を検量線から求める。キツトに
注加された検体はまず上層の固定化Hpと遊離ヘ
モグロビンとの結合をなし、ヘモグロビン−ハプ
トグロビン複合体は下層の固定化抗Hbと結合を
なす。

試料とキツトとの反応条件は特に限定されるも
のではないが、PH５〜８の低塩濃度（0.05〜
0.3M）の水溶液で湿潤させた後、試料を注加
し、展開によつて結合させる。要する時間は、約
５分間〜20分で十分である。十分の浸透後キツト
容量の２倍以上の水溶液で洗浄する。洗浄液は、
PH５〜８の低塩濃度の水溶液であれば特に限定さ
れない。

キツトの再生方法は、測定完了後のキツトを１
〜5Mグアニジン・HCl（PH４〜６）、0.05〜0.5M
グリシン・HCl（PH２〜３）、0.05〜0.5M
Na₂HPO₄・NaOH（PH10〜11）、１〜5M NaBr、
又は１〜6M MgCl₂（PH３〜５）の水溶液と接触
させHpとヘモグロビンの結合及び抗Hbとヘモグ
ロビン−ハプトグロビン複合体との結合を解きヘ
モグロビン及びヘモグロビン−ハプトグロビン複
合体を遊離させる。その後低塩濃度のPH５〜８の
水溶液で洗浄後、再び使用に供せうる。

キツトの保存は、乾燥状態あるいは防腐剤（例
えば0.1％NaN₃）を含有したPH５〜８の低塩濃度
水溶液中に保持する。温度は低温好ましくは10℃
以下凍結しない条件である。水溶液中での保存
は、約２年間は活性の低下なく使用できる。

測定に際して、試料が血清、血漿、尿、髄液等
の場合は何等前処理をおこなうことなしにそのま
ま使用可能である。

かくして提供されたヘモグロビン測定キツト
は、遊離のヘモグロビン量およびヘモグロビン−
ハプトグロビン複合体量を簡単且つ迅速に分別定
量できる試薬である。

以下に実施例を示すが、本発明は何等これに限
定されない。

実施例 １ ヒトヘモグロビンを兎に免疫して得た抗ヒトヘ
モグロビン血清よりコーンのエタノール分画法
（J.Am.Chem.Soc.、72 465（1950）により精製
して得た抗Hbを臭化シアン法でSepharose4Bに
固定し、これを内径1.5cm長さ20cmの注射筒の下
層10cmに充填し、充填物の上面が乱れない様円形
に切つた紙を充填物の上面に載せついでプール
人血漿より精製（特開昭50−77516）して得たHp
を臭化シアン法でSepharose4Bに固定した固定化
Hpを上層10cmに充填し、充填物の上面が乱れな
い様円形に切つた紙を充填物の上面に載せ生理
的食塩液で湿潤させキツトを作成した。このキツ
トの遊離ヘモグロビン及びヘモグロビン−ハプト
グロビン複合体の検量線は図１の如く各々直線的
である。

実施例 ２ 内径1.5cm長さ10cmの透明なプラスチツクチユ
ーブの底面をグラスフイルター（600メツシユ）
で固定しこれに実施例１と同様にして作成した固
定化Hpおよび固定化抗Hbをそれぞれ高さ７cmに
充填したのち同種のグラスフイルターを内容物上
面に固定し、その上に少量の生理的食塩水を充填
してカラムの上下両端をゴムキヤツプで封じた装
置をそれぞれ100個ずつ計200個作成した。これら
のうち固定化Hpカラムを上層に、固定化抗Hbカ
ラムを下層にセツトした装置10個を選び、標準ヘ
モグロビン及び標準ヘモグロビン−ハプトグロビ
ン複合体をヘモグロビンを含まない血清に溶解し
た各々を１mg/ml含有する溶液を２ml通過させ
た。赤色に着色した部分の長さは上層部で最高
1.85cm、最低1.70cm、平均1.75cmであつた。下層
部で最高1.83、最低1.68cm、平均1.72cmであつ
た。

実施例 ３ 多孔性ガラス（孔直径約80μ、ガラス直径100
メツシユ）をガンマ−アミノプロピル−トリエト
キシシランで活性化させたのち、別にウマの血漿
を原料に精製して得たHp及びヒトのヘモグロビ
ンを馬に免疫して得た抗Hbをこの多孔性ガラス
に固定した。

これらを実施例２と同様にしてプラスチツクチ
ユーブに充填した装置を作成した。これらのうち
10個を選び、標準ヘモグロビン及び標準ヘモグロ
ビン・ハプトグロビン複合体をヘモグロビンを含
まない血清に溶解した各々を１mg/ml含有する溶
液を２ml通過させたところ、赤色に着色した部分
の長さは上層部で最高2.63cm、最低2.47cm、平均
2.56cm、下層部で最高2.58cm、最低2.45cm、平均
2.53cmであつた。

【図面の簡単な説明】

図１は実施例１において得られた本発明による
方法およびキツトの使用による遊離ヘモグロビン
及びヘモグロビン−ハプトグロビン複合体中のヘ
モグロビンの検量線である。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ ヘモグロビン含有検体を、まず固定化ハプト
   グロビンと接触させて検体中の遊離のヘモグロビ
   ンを固定化ハプトグロビンとの複合体として補集
   し、次いで固定化抗ヘモグロビン抗体と接触させ
   て検体中のハプトグロビン−ヘモグロビン複合体
   を抗ヘモグロビン抗体との複合体として補集した
   後、各々の吸着して赤色に着色した部分の長さ、
   あるいは体積を測定して遊離ヘモグロビンおよび
   ハプトグロビン−ヘモグロビン複合体を各々定量
   することを特徴とするヘモグロビン含有検体中の
   ヘモグロビン定量方法。 ２ 上層の固定化ハプトグロビン層および下層の
   固定化抗ヘモグロビン抗体層よりなることを特徴
   とする遊離ヘモグロビンおよびハプトグロビンと
   の複合体の形で存在するヘモグロビンを含む検体
   中のヘモグロビン定量測定試薬。