【発明の詳細な説明】[Detailed description of the invention]
本発明は新規なポリペプチド類，新規なポリペ
プチド類の製造方法，及びポリペプチド類の用途
に関する。
多くのポリペプチド類が動物の各種器官から単
離されていることはよく知られている。しかしな
がら、約10年前迄は、生れた時人間の体重の約
0.8％をしめる器官である胸腺については殆んど
知るところがなく、僅かに神経筋阻止物質が胸腺
に存在していること及び胸腺ホルモンが免疫系の
発現に影響を及ぼすという仮説が提出されていた
にすぎない。胸腺の機能に関する強い関心と初期
の推論及び実験にも拘らず、最近まで胸腺の機能
に関しては殆んど分らなかつた。しかしながら、
現在は胸腺は上皮（内分泌）及びリンパ（免疫学
的）成分を有する複器官であり従つて胸腺は身体
の免疫機能に関与していることが分つた。即ち、
胸腺は第３鰓弓（third branchial arch）に由来
する上皮ストロマ及び造血組織で発生する幹細胞
に由来するリンパ球からなる複器官であることは
公知である（Goldstein等の「The Human
Thymus」，Heinemann，London，1969年参
照）。リンパ球は胸腺内部で分化されてＴ細胞と
言われる成熟した胸腺由来細胞として胸腺から離
れ，血液，リンパ，脾臓リンパ節へと循環する。
胸腺内部での幹細胞分化の誘導は胸腺の上皮細胞
の分泌物を媒介として起るように思えるが、生物
試験に伴う種々の困難により存在すると考えられ
るホルモン類の完全な単離及び構造の特定ができ
なかつたというのがこれまでの実情であつた。
本発明のポリペプチド類の生化学的分化特性の
重要性を理解するには、広義に言えば免疫に関す
る胸腺の機能はＴ細胞と言われる胸腺に由来する
細胞、即ちリンパ球を生成することであるという
ことは銘記すべきことである。Ｔ細胞は再循環小
リンパ球液の貯槽の大部分を形成している。Ｔ細
胞は免疫学的特異性を有しかつ実行器細胞として
（同種移植反応等の）細胞介在による免疫応答に
直接関与している。しかしながら、Ｔ細胞は液体
抗体を分泌することはない。これらの抗体は胸腺
とは無関係に骨髄に直接由来する細胞により分泌
される。これらの骨髄に由来する細胞はＢ細胞と
言われる。しかしながら、多くの抗原とは対称的
に、Ｂ細胞が抗体を生成するには適当に反応性の
あるＴ細胞の存在が必須である。Ｔ細胞とＢ細胞
の協働によるこの生成過程の機構は未だ完全には
理解されていない。
上述のことから、作用効果という観点において
胸腺は細胞免疫の発現及び液性抗体反応に対して
必要なものでありかつ造血性幹細胞を分化してＴ
細胞を胸腺内で誘導することにより上記発現及び
反応系に胸腺は影響を与えているということがで
きる。この誘導的影響は胸腺の上皮細胞の分泌
物，即ち、胸腺ホルモン類を媒介として行われ
る。
更に、胸腺及びリンパ球細胞系の作用及び体内
でのリンパ球の循環を理解するには、幹細胞は骨
髄に生じて血液に運ばれて胸腺に達するというこ
とが肝要な点である。胸腺の内部に於いて、幹細
胞は免疫学的に応答性のあるＴ細胞に分化する。
このＴ細胞は血流に移行し、Ｂ細胞と共に種々の
組織，リンパ管系及び血流間を循環する。
抗体を分泌する身体の細胞も又造血幹細胞から
発生するものであるが身体細胞の分化は胸腺によ
り決るものでない。従つて、身体細胞は骨髄由来
細胞又はＢ細胞と名付けられている。鳥類に於い
ては身体細胞は胸腺に類似するフアブリキウス嚢
という器官で分化される。哺乳類では、フアブリ
キウス嚢に相当する器官は見出されておらずＢ細
胞は骨髄内で分化すると考えられている。この分
化を行わせる生理的物質は全く分つていない。
胸腺は身体の免疫特性に関連があることが分つ
てきたので胸腺から単離された物質に多大の関心
が向けられて来た。近年、牛の胸腺に存在する物
質に関する科学的研究に基づく比較的大部の論文
集が発表されている。現に本出願人等も上記分野
の研究に関して多数の論文を発表して来た。関連
する刊行物としては、例えば、「The Lancet」，
1968年７月20日号，p.119−122，「Triangle」，
Vol.11，No.１，p.7−14，「Annals of the New
York Academy of Sciences」Vol.183，p.230−
240，1971，「Clinical and Experimental
Immunology」，Vol.4，No.２，p.181−189，
1967，「Nature」，Vol.247，p.11−14，1974，
「Proceedings of the National Academy of
Sciences，USA，Vol.71，p.1474−1478，1974，
「Cell」，Vol.5，p.361−365及びp.367−370，
1975，及び「Lancet」Vol.2，p.256−259，1975
を挙げることができる。
Goldstein及びManganaroによる「Annals of
the New York Academy of Sciences」，
Vol.183，p.230−240，1971の論文には、動物の
筋無力症神経筋障害を引越す胸腺ポリペプチドの
存在が開示されている。この神経筋障害は人間の
病気である重症性筋無力症に似たものである。更
に上記論文には、牛の胸腺に含まれる別種のポリ
ペプチド類により引起こされる２つの効能がある
ことが見出されている。これらのポリペプチド類
の１つはチモトキシン（thymotoxin）と名付け
られているもので、これは筋炎を引起こすと思わ
れている。しかしながら、このポリペプチドは単
離されていないが、分子量約7000のポリペプチド
であると思われ、強い純陽電荷を有しかつPH8.0
でCM−セフアデツクス（CM−Sephadex）に保
持されることが示されている。
「Nature」，247，11，1975年１月４日号に、
チミン（Thymin）及びチミン（Thymin
）と同定された生成物が記載されている。これ
らの生成物は牛の胸腺から単離された新ポリペプ
チド類であり、各種治療分野に特定の用途を有す
るものであることが見出された。過去牛の胸腺か
ら単離された他の物質に対しても同様の名称が用
いられているので、これらのチミン及び物質
は現在チモポイエチン（Thymopoietin）及
びチモポイエチン（Thymopoietin）とそれ
ぞれ呼称されている。これらの物質及びその製法
は1975年８月22日付で米国に出願された米国特許
出願第606843号明細書に記載されている。
米国特許第4002602号明細書には、偏在性造免
疫性ポリペプチド類（Ubiquitous
Immunopoietic Polypeptides）として述べられ
ている長鎖ポリペプチド類が開示されている。こ
のポリペプチドは74−アミノ酸ポリペプチドであ
り、試験管中ナノグラム単位の濃度に於いて骨髄
又は脾臓に存在する先駆物質からＴ細胞及びＢ細
胞の免疫細胞の分化を誘導する能力を特徴とする
ものである。このように、上記ポリペプチドは胸
腺又は免疫欠陥又は欠失等を伴う治療分野に有効
である。
1977年１月11日付で発行された米国特許第
4002740号明細書には、合成トリデカペプチド組
成物が開示されている。これらのトリデカペプチ
ド組成物は補体受容体であるＢ−リンパ球に対し
てではなくＴ−リンパ球の分化を誘導することが
できる。この様に、このポリペプチドは上述米国
特許出願第606843号明細書に於いてチモポイエチ
ンとして単離され名付けられている長鎖ポリペプ
チドの特性の内多くのものをその特性として示し
ている。
本発明は一定の活性部構造単位を有する５個の
アミノ酸を含有する合成ポリペプチド（即ち５−
アミノ酸ポリペプチド）を提供するものであり、
このポリペプチドは上述刊行物及び1975年８月22
日付で出願された米国特許出願第606843号明細書
に於いて単離されかつチモポエチンと称された長
鎖ポリペプチド及び米国特許第4002740号明細書
に記載されているトリデカペプチドの多くの特性
を有することが分つた。
従つて、本発明の目的は生物学的に重要である
新規なポリペプチド類を提供することである。
本発明の他の目的はナノグラム単位の濃度で骨
髄細胞を分化してＴ細胞に誘導し胸腺由来のリン
パ球を生じさせる能力を有し、従つて人間及び動
物の免疫系に非常に有効である新規なポリペプチ
ド類を提供することである。
本発明の更に他の目的は生化学的作用に使用す
る組成物及び方法と同時に新規な中間生成物と、
新規なポリペプチド類を合成する方法とを提供す
ることである。
以下に本発明を更に詳しく説明する。
前記目的及び利点を満足させるために、本発明
は活性部位として下記構造単位を有する新規なポ
リペプチド類を提供するものである。
−ARG−LYS−ASP−VAL−TYR−
更に本発明のポリペプチド類の製造過程で形成
される新規なペプチド−樹脂中間体類も又提供さ
れ、これらの中間体は下記式の構造単位を有する
ものである。
この場合、樹脂及び他の保護基を含まないペプ
チド中間体も本発明の範囲に入るものである。上
記式に於いてR1，R2，R3，R4及びR5は、必要に
より、それぞれ示されている各アミノ酸に結合し
ている保護基であり、樹脂は反応支持体として作
用する固形高分子物質である。本発明は更に固相
ペプチド合成法による本発明のポリペプチド類の
製造方法，前記ポリペプチド類を含む治療用組成
物，及び人間及び動物にポリペプチド類を投与し
て生化学作用を人間及び動物に及ぼす方法をも提
供することである。
上述の如く、本発明は種々の分野に治療効果を
有する新規なポリペプチド類，ポリペプチド類の
製造過程で生じる種々の中間体，治療用組成物，
前記ポリペプチド類を利用する用途、及びポリペ
プチド類の製造方法に関するものである。
本発明の主たる実施態様によれば、活性部位と
して下記アミノ酸構造単位を有するポリペプチド
類が提供されている。
ARG−LYS−ASP−VAL−TYR
更に別の実施態様では、活性部位として上記ア
ミノ酸構造を含むペンタペプチド類であつて下記
一般式で表わすことができるものが提供されてい
る。
Ｒ−NH−ARG−LYS−ASP−VAL−TYR−
COR′
上式に於いて、Ｒ及びR′はそれぞれペンタペ
プチドに結合している置換体であり、これらの置
換体はアミノ酸の基本形活性構造体の生化学的活
性に実質上影響を与えないものである。言い換え
れば、これらの２つの末端アミノ酸にペンタペプ
チド分子の生化学的活性に実質的な影響を及ぼさ
ない官能基又は誘導体（即ち、Ｒ及びR′）を結
合させる時本発明の範囲を逸脱することなくこの
ペンタペプチド鎖の末端アミノ酸を改質すること
ができることを式は意味している。従つて、末
端アミノ酸基及びカルボン酸基は或る種のポリペ
プチド類に於ける場合と同様生化学的活性を与え
るために必須のものではないということである。
それ故、末端アミノ酸基が未置換のペンタペプチ
ド類及び本発明に言う生化学的活性に実質的に影
響を及ぼさない１種又はそれ以上の官能基により
末端基が置換されているペンタペプチド類の両者
を本発明の範囲に含むものである。
これらの官能基の置換としては遊離アミノ基の
アシル化及び遊離カルボン酸基のアミド化のよう
な通常の置換、及び他のアミノ酸類とポリペプチ
ド類との置換を含むものである。これらの観点か
ら見ると、本発明のペンタペプチド類は特異なも
のであると思われる。何故なら、これらのペンタ
ペプチド類は前記ペプチド構造単位をその一部と
する長鎖天然ペプチド類と同じ生化学活性を示す
からである。ペプチド分子の生化学的活性は分子
の立体化学的特徴、即ち分子の特異な折りたたみ
構造に起因していると思われる。なお、ポリペプ
チドの結合は剛直ではなく柔軟でありかつシート
状、らせん状等の形状をしている。。その結果、
分子全体としては柔軟となり一定の状態で折り重
なる。本発明者はペンタペプチドは長鎖の天然ポ
リペプチドと同様に折り重なり従つて同じ生化学
的特性を示すことを見出した。この様な訳で、実
質上生化学的活性に影響を与えない置換基である
が又はペンタペプチド分子の天然重畳構造を阻害
しない置換基であればペンタペプチドは種々の官
能基で置換することができる。
ペンタペプチド分子の生化学的活性及び天然重
畳構造の保持力は次の事実から明らかである。即
ち、本発明のペンタペプチド構造体はGoldstein
による米国特許出願第606843号明細書及び
「Nature」247，11，1975に記載されているチモ
ポイエチンなる名称の天然の49−アミノ酸と同一
の生化学特性を示している。更に、本発明ペンタ
ペプチド構造体は、「Cell」，Vol.5，367−370，
1975年８月号及び米国特許第4002740号明細書に
開示されている合成トリデカペプチドと同じ生化
学特性を有するものである。これらの長鎖ポリペ
プチドの両者に於いて、本発明のペンタペプチド
はその分子内に上記文献に記載されている他のア
ミノ酸類と結合している形ではあるが固定でき
る。しかしながら、本発明のペンタペプチドとチ
モポイエチン及びトリデカペプチドとの生化学活
性は同一でありかつ他のアミノ酸類及び末端アミ
ノ酸が置換されたペプチド鎖は基本形ペンタペプ
チド構造体の生化学特性に影響を及ぼさない故に
本発明のペンタペプチドは活性部位であるという
ことを上記刊行物は直接立証しているのである。
このことから、式のＲ及びR′としては基本
形活性構造体の生化学的活性に実質的に影響を与
えないかぎりいかなる置換体でも使用できること
が理解されるであろう。
Ｒ及びR′は例えば下記置換基のいずれでもよ
い。
Ｒ R′
水素 OH
C1−C7アルキル NH2
C5−C12アリール NHR7
C6−C20アルカリール Ｎ（R7）2
C6−C20アルアルキル OR7
C1−C7アルカノイル
C2−C7アルケニル
C2−C7アルキニル
ここで、R7はC1−C7のアルキル，C2−C7のア
ルケニル，C2−C7のアルキニル，C6−C20のアル
カリール又はC6−C20のアルアルキル基である。
Ｒ及びR′は又中性アミノ酸基又は炭素原子数
１−20のポリペプチド鎖の残基であつてもよい。
これらを下記に示す。
The present invention relates to novel polypeptides, novel methods for producing polypeptides, and uses of polypeptides. It is well known that many polypeptides have been isolated from various organs of animals. However, until about 10 years ago, the weight of humans at birth was approximately
Little is known about the thymus gland, an organ that accounts for 0.8% of the population, and the hypothesis has been that a small amount of neuromuscular inhibitory substances exist in the thymus gland and that thymus hormones influence the expression of the immune system. It's nothing more than that. Despite intense interest and early speculation and experimentation regarding the function of the thymus, until recently little was known about the function of the thymus. however,
It is now known that the thymus is a complex organ with epithelial (endocrine) and lymphatic (immunological) components, and that the thymus is therefore involved in the body's immune function. That is,
It is known that the thymus is a complex organ consisting of an epithelial stroma originating from the third branchial arch and lymphocytes derived from stem cells generated in hematopoietic tissue (Goldstein et al., "The Human
Thymus, Heinemann, London, 1969). Lymphocytes are differentiated within the thymus, leave the thymus as mature thymus-derived cells called T cells, and circulate to the blood, lymph, and splenic lymph nodes.
The induction of stem cell differentiation within the thymus seems to occur through the secretions of thymic epithelial cells, but due to various difficulties associated with biological testing, it has not been possible to completely isolate and identify the structures of the hormones that are thought to exist. The reality up until now was that this was not possible. To understand the importance of the biochemical differentiation characteristics of the polypeptides of the present invention, broadly speaking, the function of the thymus gland related to immunity is to produce cells derived from the thymus gland called T cells, that is, lymphocytes. It is important to note that there is. T cells form the majority of the recirculating small lymphocyte fluid reservoir. T cells have immunological specificity and are directly involved in cell-mediated immune responses (such as allograft reactions) as executive cells. However, T cells do not secrete liquid antibodies. These antibodies are secreted by cells derived directly from the bone marrow, independent of the thymus. These bone marrow-derived cells are called B cells. However, in contrast to many antigens, the presence of suitably reactive T cells is essential for B cells to produce antibodies. The mechanism of this generation process through cooperation between T cells and B cells is still not completely understood. From the above-mentioned point of view, the thymus gland is necessary for the expression of cellular immunity and humoral antibody responses, and it is necessary for the differentiation of hematopoietic stem cells to produce T.
It can be said that the thymus influences the above expression and reaction system by inducing cells within the thymus. This inductive effect is mediated by secretions of the epithelial cells of the thymus, ie, thymic hormones. Furthermore, in order to understand the functioning of the thymus and lymphocyte cell lineages and the circulation of lymphocytes within the body, it is essential that stem cells originate in the bone marrow and are carried in the blood to reach the thymus. Inside the thymus, stem cells differentiate into immunologically responsive T cells.
These T cells migrate into the bloodstream and circulate with B cells among various tissues, the lymphatic system, and the bloodstream. The body's cells that secrete antibodies also originate from hematopoietic stem cells, but the differentiation of somatic cells is not determined by the thymus. Therefore, the somatic cells are named bone marrow-derived cells or B cells. In birds, somatic cells are differentiated in an organ called the bursa of Fabricius, which is similar to the thymus gland. In mammals, no organ corresponding to the bursa of Fabricius has been found, and B cells are thought to differentiate within the bone marrow. The physiological substances that cause this differentiation are completely unknown. Much interest has been focused on materials isolated from the thymus gland, as the thymus gland has been implicated in the immune properties of the body. In recent years, a relatively large collection of papers based on scientific research on substances present in the cow thymus has been published. In fact, the present applicant and others have published numerous papers regarding research in the above field. Related publications include "The Lancet",
July 20, 1968 issue, p.119-122, “Triangle”,
Vol.11, No.1, p.7-14, “Annals of the New
“York Academy of Sciences” Vol.183, p.230−
240, 1971, “Clinical and Experimental
Immunology”, Vol.4, No.2, p.181-189,
1967, “Nature”, Vol. 247, p. 11-14, 1974,
``Proceedings of the National Academy of
Sciences, USA, Vol.71, p.1474-1478, 1974,
"Cell", Vol.5, p.361-365 and p.367-370,
1975, and "Lancet" Vol.2, p.256-259, 1975
can be mentioned. “Annals of
the New York Academy of Sciences”
Vol. 183, p. 230-240, 1971, discloses the existence of thymic polypeptides that induce myasthenic neuromuscular disorders in animals. This neuromuscular disorder is similar to the human disease myasthenia gravis. Furthermore, the above article found that there are two effects caused by different types of polypeptides contained in the bovine thymus. One of these polypeptides, named thymotoxin, is thought to cause myositis. However, although this polypeptide has not been isolated, it appears to be a polypeptide with a molecular weight of approximately 7000, a strong net positive charge, and a pH of 8.0.
has been shown to be retained in CM-Sephadex. In "Nature", 247, 11, January 4, 1975 issue,
Thymin and Thymin
) is described. These products are new polypeptides isolated from bovine thymus and have been found to have specific applications in various therapeutic areas. These thymines and substances are now referred to as Thymopoietin and Thymopoietin, respectively, as similar names have been used in the past for other substances isolated from bovine thymus. These materials and their preparation are described in US Patent Application No. 606,843, filed August 22, 1975. US Pat. No. 4,002,602 describes ubiquitous immunogenic polypeptides (Ubiquitous
Long chain polypeptides, referred to as immunopoietic polypeptides, are disclosed. This polypeptide is a 74-amino acid polypeptide characterized by its ability to induce T-cell and B-cell immune cell differentiation from precursors present in bone marrow or spleen at nanogram concentrations in vitro. It is. Thus, the polypeptides are useful in therapeutic areas involving thymic or immune defects or deletions, and the like. U.S. Patent No. 1, issued January 11, 1977.
No. 4002740 discloses synthetic tridecapeptide compositions. These tridecapeptide compositions can induce differentiation of T-lymphocytes, but not B-lymphocytes, which are complement receptors. As such, this polypeptide exhibits many of the properties of the long chain polypeptide isolated and designated as thymopoietin in the aforementioned US patent application Ser. No. 606,843. The present invention provides synthetic polypeptides containing five amino acids (i.e., 5-
amino acid polypeptide).
This polypeptide was published in the above-mentioned publication and on August 22, 1975.
Many of the properties of the long chain polypeptide isolated and designated thymopoietin in U.S. Patent Application No. 606,843 filed on D.A. and the tridecapeptide described in U.S. Pat. No. 4,002,740 It turns out that it has. It is therefore an object of the present invention to provide novel polypeptides of biological importance. Another object of the present invention is that it has the ability to differentiate bone marrow cells into T cells and give rise to thymus-derived lymphocytes at nanogram concentrations, and is therefore highly effective for human and animal immune systems. An object of the present invention is to provide novel polypeptides. Yet another object of the invention is to provide compositions and methods for use in biochemical operations as well as novel intermediate products;
An object of the present invention is to provide a method for synthesizing novel polypeptides. The present invention will be explained in more detail below. In order to satisfy the above objects and advantages, the present invention provides novel polypeptides having the following structural unit as an active site. -ARG-LYS-ASP-VAL-TYR- Further provided are novel peptide-resin intermediates formed in the process of producing the polypeptides of the invention, these intermediates having structural units of the following formula: -ARG-LYS-ASP-VAL-TYR- It is something. In this case, peptide intermediates that do not contain resins and other protecting groups are also within the scope of the invention. In the above formula, R 1 , R 2 , R 3 , R 4 and R 5 are protecting groups bonded to each of the indicated amino acids, if necessary, and the resin is a solid that acts as a reaction support. It is a polymeric substance. The present invention further provides a method for producing the polypeptides of the present invention by solid-phase peptide synthesis, therapeutic compositions containing the polypeptides, and administration of the polypeptides to humans and animals to induce biochemical effects on humans and animals. It is also an object of the present invention to provide a method for As mentioned above, the present invention relates to novel polypeptides having therapeutic effects in various fields, various intermediates generated in the process of producing polypeptides, therapeutic compositions,
The present invention relates to uses of the polypeptides and methods for producing the polypeptides. According to a main embodiment of the present invention, polypeptides having the following amino acid structural unit as an active site are provided. ARG-LYS-ASP-VAL-TYR In yet another embodiment, pentapeptides containing the above amino acid structure as the active site and can be represented by the general formula below are provided. R-NH-ARG-LYS-ASP-VAL-TYR-
COR' In the above formula, R and R' are each a substituent bonded to the pentapeptide, and these substituents do not substantially affect the biochemical activity of the basic active structure of the amino acid. It is. In other words, it is beyond the scope of the invention when attaching to these two terminal amino acids functional groups or derivatives (i.e., R and R') that do not substantially affect the biochemical activity of the pentapeptide molecule. The formula means that the terminal amino acid of this pentapeptide chain can be modified without any modification. Therefore, terminal amino acid and carboxylic acid groups are not essential to confer biochemical activity, as is the case with certain polypeptides.
Therefore, pentapeptides in which the terminal amino acid group is unsubstituted and pentapeptides in which the terminal group is substituted with one or more functional groups that do not substantially affect the biochemical activity referred to in the present invention. Both are included within the scope of the present invention. Substitutions of these functional groups include conventional substitutions such as acylation of free amino groups and amidation of free carboxylic acid groups, and substitution of other amino acids with polypeptides. From these points of view, the pentapeptides of the present invention appear to be unique. This is because these pentapeptides exhibit the same biochemical activity as long-chain natural peptides of which the peptide structural unit is a part. The biochemical activity of peptide molecules is believed to be due to the stereochemical features of the molecule, ie, the unique folding structure of the molecule. Note that the bonds of polypeptides are not rigid but flexible and have a sheet-like, helical, etc. shape. . the result,
The molecule as a whole becomes flexible and folds in a certain way. The inventors have found that pentapeptides fold similarly to long chain natural polypeptides and therefore exhibit the same biochemical properties. For this reason, pentapeptides can be substituted with a variety of functional groups as long as the substituents do not substantially affect the biochemical activity or interfere with the natural folded structure of the pentapeptide molecule. can. The biochemical activity and retention of the natural folded structure of the pentapeptide molecule are evident from the following facts. That is, the pentapeptide structure of the present invention
It exhibits the same biochemical properties as the naturally occurring 49-amino acid named thymopoietin, which is described in US patent application Ser. Furthermore, the pentapeptide structure of the present invention is described in "Cell", Vol. 5, 367-370,
It has the same biochemical properties as the synthetic tridecapeptide disclosed in August 1975 and US Pat. No. 4,002,740. In both of these long-chain polypeptides, the pentapeptide of the present invention can be immobilized within the molecule, albeit in the form of bonds with other amino acids described in the above-mentioned literature. However, the biochemical activities of the pentapeptide of the present invention and thymopoietin and tridecapeptide are the same, and the peptide chain in which other amino acids and terminal amino acids are substituted does not affect the biochemical properties of the basic pentapeptide structure. Therefore, the above publication directly proves that the pentapeptide of the present invention is an active site. From this, it will be understood that any substitution can be used for R and R' in the formula as long as it does not substantially affect the biochemical activity of the basic active structure. R and R' may be, for example, any of the following substituents. R R'Hydrogen OH C 1 -C 7 alkyl NH 2 C 5 -C 12 aryl NHR 7 C 6 -C 20 alkaryl N(R 7 ) 2 C 6 -C 20 aralkyl OR 7 C 1 -C 7 alkanoyl C 2 - C7 alkenyl C2 - C7 alkynyl where R7 is C1 - C7 alkyl, C2 - C7 alkenyl, C2 - C7 alkynyl, C6 - C20 alkaryl, or It is a C6 - C20 aralkyl group. R and R' may also be neutral amino acid groups or residues of a polypeptide chain containing 1 to 20 carbon atoms.
These are shown below.
〔実施例 １〕[Example 1]
本発明のポリペプチドを合成するために、下記
物質を購入した。
α−AOC−Ng−Tos−Ｌ−アルギニン
α−BOC−２−クロル−ベンジルオキシカルボ
ニル−Ｌ−リシン
α−BOC−Ｏ−ベンジル−Ｌ−アスパラギン酸
α−BOC−Ｌ−バリン
α−BOC−２，６−ジクロルベンジル−Ｌ−チ
ロシン
上記薬剤に於いて、BOCはｔ−ブチルオキシ
カルボニル、，AOCはｔ−アミルオキシカルボニ
ル，Tosはトシルをそれぞれ表わす。アミノ酸の
遂次反応に際しての構造決定に用いた試薬，ジシ
クロヘキシルカーボジイミド，フルオレスアミ
ン，及び，樹脂は市販品を購入した。使用した樹
脂は粒径200−400メツシユのポリスチレンジビニ
ルベンゼン樹脂であり１％のジビニルベンゼンと
樹脂１ｇ当り0.75ミリモルのクロライドを含有し
ていた。
ポリペプチドを合成するに当り、２ミリモルの
α−BOC−Ｏ−２，６−ジクロルベンジル−Ｌ
−チロシンを１ミリモルのトリエチルアミンを含
む無水アルコール中80℃で24時間処理して２ミリ
モルのクロルメチル化樹脂にエステル化した。得
られた結合アミノ酸樹脂を過し、無水アルコー
ルで洗浄しかつ乾燥した。次いで、α−BOC又
はα−AOCアミノ酸類を同様にしてペプチド樹
脂の保護解除されたα−アミノ基に順次結合させ
当量のジシクロヘキシルカーボジイミドを用いて
本発明のペプチド−樹脂を生成させた。各結合反
応後に、少量の樹脂をフルオレスアミンで試験
し、もし陽性螢光である場合には、結合は不完全
であるとしてその時用いた同一の保護形アミノ酸
を用いて反応を繰返した。数回のカツプリング反
応の結果として、下記式で表わされるペンタペプ
チド−樹脂が得られた。
上式で、AOCはアミルオキシカルボニル，
Tosはトシル，Ｚはベンジルオキシカルボニル，
Bzlはベンジル，Bzl（Cl2）はＯ−２，６−ジクロ
ルベンジルをそれぞれ表わす。
このペプチド−樹脂結合体の分割と保護基の除
去をケルフ（Kelf）分割装置（Peninsula Lad.
Inc.製）で無水フツ化水素を用いて０℃で60分間
行つた、この場合スカベンジヤーとしてペプチド
−樹脂１ｇに対して1.2mlのアニソールを用い
た。
ペプチド混合物を凍結真空乾燥し、無水エーテ
ルで洗浄し、次いでペプチドを氷酢酸及び水で抽
出した。IN酢酸中Ｐ−６ビオーゲル（Bio−
Gel）上でペプチドをクロマトグラフ分析に付し
た。その結果、得られたペプチドは純度94％であ
り、下記構造を有することが分つた。
H2N−ARG−LYS−ASP−VAL−TYR−COOH
〔実施例 ２〕
実施例１のポリペプチドの活性及び特性を調べ
るために、健康な生後５〜６週間のnu／nuマウ
スの両性について試験を行つた。マウスは
BALB／Ｃ背地（Thy−1.2表面抗原を示す胸腺細
胞）で飼育されかつ通常の条件下に維持された。
抗血清に関しては、抗Thy−1.2血清をThy−１
同族マウスで作つた。
Thy−1+T細胞又はCR+B細胞の分化の試験管
中での誘導については、試験管中で前胸腺細胞
（prothymocyte）からの胸腺細胞の分化誘導をコ
ムロ及びボイス（Komuro ＆ Boyse）により
記載された方法（Lancet，１，740，1973）に準
じて行なつた。この方法はThy−1.2の獲得をＴ
細胞分化の目安として用いるものである。
一方、試験管中でのCR-B細胞先駆体からの
CR+B細胞への分化の誘導も胸腺細胞の場合と同
様の条件下で行つたが、この場合分析の規準とし
ては多少凝集する程度の量のうさぎの抗体及び非
分解性の補体で塗被された羊の赤血球を結合させ
るCR+B細胞の能力を用いた。牛の血清アルブミ
ンの不連続な傾斜上で分別された健康なnu／nu
マウスの脾臓細胞群を両先駆体（Thy−1-及び
CR-）源として用いた。これは前記細胞群は殆ん
ど又は全くThy−1+細胞を含まずしかもCR+細胞
の数は少しであるという理由による。
この結果、このポリペプチドは補体受容体
（CR+）であるＢリンパ球ではなくＴリンパ球の分
化を誘導するという点に於いてチモポイエチン
の選択性と同様の作用選択性を示した。このペン
タペプチドは1nｇ−10μｇ／mlの濃度範囲でThy
−1+T細胞の分化を誘導した。0.01nｇ−10μ
ｇ／mlの濃度範囲ではCR+B細胞の分化を誘導し
なかつた。
〔実施例 ３〕
神経筋伝達に関する実施例１のペプタイドの効
果を検討するため、通常の塩溶液中に10−100μ
ｇのペプチドを含ませてこれを腹膜内に注入し
た。24時間後，「Lancet」，Vol.12，p.256−259，
1975に記載されている方法により神経筋伝達を筋
電図を使つて調べた。ペプチドを注入されたマウ
スには神経筋障害がみられた。
〔実施例 ４〕
実施例１の方法で…H2N−ARG−LYS−ASP
−VAL−TYR−CONH2」を下記の如く訂正す
る。
「「Journ.Med.Chem.vol.16，No.５，p.545−８
（1973）」に記載されているJ.Rivierによる方法を
利用してベンズヒドリルアミン樹脂基板上で実施
例１のペンタペプチドを製造した。この製造にあ
たつて、ジシクロヘキシルカーボジイミドをカツ
プリング剤として使用し、カツプリング反応は
CH2C２中で行つた。得られたペプチドを弗化
水素を用いて基板から分離させてペプチドを遊離
させ、保護基を除去して下記誘導体を得る
H2N−ARG−LYS−ASP−VAL−TYR−CONH2
−−」
薄層クロマトグラフ法及び電気泳動法で同定し
て下記結果を得た。
薄層クロマトグラフイー
試料：30μｇ
シリカゲル（ブリンクマン ガラス板，５×20
cm，厚さ0.25mm）
Ｒ１：ｎ−ブタノール：ピリジン：酢酸
（HOAc）：水
30：15：３：12
Ｒ２：酢酸エチル（EtOAc）：ピリジン：酢
酸：水
５：５：１：３
Ｒ３：酢酸エチル：ｎ−ブタノール：酢酸：水
１：１：１：１
スプレー試薬：パウリ試薬，ニンヒドリン，坂口
試薬及びI2
In order to synthesize the polypeptide of the present invention, the following materials were purchased. α-AOC-Ng-Tos-L-arginine α-BOC-2-chloro-benzyloxycarbonyl-L-lysine α-BOC-O-benzyl-L-aspartic acid α-BOC-L-valine α-BOC-2 ,6-dichlorobenzyl-L-tyrosine In the above drug, BOC represents t-butyloxycarbonyl, ,AOC represents t-amyloxycarbonyl, and Tos represents tosyl. The reagents, dicyclohexyl carbodiimide, fluorescein amine, and resin used for structure determination during the sequential reaction of amino acids were purchased from commercial sources. The resin used was a polystyrene divinylbenzene resin having a particle size of 200-400 mesh and containing 1% divinylbenzene and 0.75 mmol chloride/g resin. In synthesizing the polypeptide, 2 mmol of α-BOC-O-2,6-dichlorobenzyl-L
-Tyrosine was esterified to 2 mmol of chloromethylated resin by treatment in absolute alcohol containing 1 mmol of triethylamine at 80 DEG C. for 24 hours. The resulting bound amino acid resin was filtered, washed with absolute alcohol and dried. α-BOC or α-AOC amino acids were then similarly sequentially coupled to the deprotected α-amino groups of the peptide resin using an equivalent amount of dicyclohexyl carbodiimide to form the peptide-resin of the invention. After each coupling reaction, a small amount of the resin was tested with fluorescein amine, and if positive fluorescence, the coupling was assumed incomplete and the reaction was repeated with the same protected amino acid used. As a result of several coupling reactions, a pentapeptide-resin represented by the following formula was obtained. In the above formula, AOC is amyloxycarbonyl,
Tos is tosyl, Z is benzyloxycarbonyl,
Bzl represents benzyl, and Bzl (Cl 2 ) represents O-2,6-dichlorobenzyl. The resolution of this peptide-resin conjugate and the removal of the protecting groups were carried out using a Kelf resolution device (Peninsula Lad).
Inc.) using anhydrous hydrogen fluoride at 0 DEG C. for 60 minutes, using 1.2 ml of anisole per gram of peptide-resin as the scavenger. The peptide mixture was lyophilized in vacuo, washed with anhydrous ether, and the peptides were extracted with glacial acetic acid and water. P-6 biogel in IN acetic acid (Bio-
Peptides were subjected to chromatographic analysis on Gel). As a result, it was found that the obtained peptide had a purity of 94% and had the following structure. H 2 N-ARG-LYS-ASP-VAL-TYR-COOH [Example 2] To investigate the activity and properties of the polypeptide of Example 1, healthy 5- to 6-week-old nu/nu mice of both sexes were tested. I conducted a test. The mouse is
They were raised on BALB/C backing (thymocytes displaying Thy-1.2 surface antigen) and maintained under normal conditions.
Regarding antiserum, anti-Thy-1.2 serum is
Made with homologous mice. For in vitro induction of Thy−1 + T cell or CR + B cell differentiation, induction of thymocyte differentiation from prothymocytes in vitro was described by Komuro & Boyse. It was carried out according to the method described (Lancet, 1, 740, 1973). This method allows the acquisition of Thy−1.2 to T
It is used as a guide for cell differentiation. On the other hand, CR from in vitro B cell precursors
Induction of differentiation into CR + B cells was performed under the same conditions as for thymocytes, but in this case the analytical criteria were to coat with rabbit antibodies and non-degradable complement in an amount that caused some agglutination. The ability of CR + B cells to bind coated sheep red blood cells was used. Healthy nu/nu fractionated on discontinuous gradients of bovine serum albumin
Mouse spleen cell populations were cultured with both precursors (Thy-1 - and
CR- ) was used as a source. This is because the cell population contains little or no Thy-1 + cells and only a small number of CR + cells. As a result, this polypeptide showed similar selectivity to thymopoietin in inducing the differentiation of T lymphocytes rather than B lymphocytes, which are complement receptors (CR + ). This pentapeptide is Thy
−1 + T cell differentiation was induced. 0.01ng−10μ
It did not induce differentiation of CR + B cells in the concentration range of g/ml. [Example 3] To investigate the effect of the peptide of Example 1 on neuromuscular transmission, 10-100μ
This was injected intraperitoneally. 24 hours later, "Lancet", Vol.12, p.256-259,
Neuromuscular transmission was investigated using electromyography using the method described in 1975. Mice injected with the peptide had neuromuscular damage. [Example 4] Using the method of Example 1...H 2 N-ARG-LYS-ASP
−VAL−TYR−CONH 2 ” is corrected as follows. "Journ.Med.Chem.vol.16, No.5, p.545-8
The pentapeptide of Example 1 was prepared on a benzhydrylamine resin substrate using the method by J. Rivier described in J. Rivier (1973). In this production, dicyclohexylcarbodiimide was used as a coupling agent, and the coupling reaction was
It was carried out in CH 2 C 2 . The resulting peptide is separated from the substrate using hydrogen fluoride to liberate the peptide, and the protecting group is removed to obtain the following derivative H 2 N−ARG−LYS−ASP−VAL−TYR−CONH 2
--'' Identification was achieved using thin layer chromatography and electrophoresis, and the following results were obtained. Thin layer chromatography Sample: 30 μg silica gel (Brinkmann glass plate, 5 x 20
cm, thickness 0.25 mm) R 1 : n-butanol: pyridine: acetic acid (HOAc): water 30:15:3:12 R 2 : ethyl acetate (EtOAc): pyridine: acetic acid: water 5:5:1:3 R3 : Ethyl acetate: n-butanol: acetic acid: water 1:1:1:1 Spray reagent: Pauli reagent, ninhydrin, Sakaguchi reagent and I2
〔実施例 ４〕[Example 4]
本実施例では、保護されたＬ−アルギニンの代
りに等量のＮ−メチル−Ｌ−アルギニンを用いた
以外実施例１の方法を用いて実施例１の基本形ペ
ンタペプチドのＮ−メチル−置換誘導体を合成し
た。下記式のペプチドが得られた。
CH3NH−ARG−LYS−ASP−VAL−TYR−
COOH
以上、本発明は前述の如く新規なポリペプチド
類を提供するものであり、
ARG−LYS−ASP−VAL−TYR
このポリペプチドは補体受容体（CR+）Ｂリン
パ球ではなくＴリンパ球の分化を誘導することが
できるので多くの治療分野に有効である。更に、
上記ペンタペプチドの誘導体，新規な中間体ポリ
ペプチド類，ペプチド類の製造方法，治療組成物
及び組成物の用途も本発明により提供されてい
る。本発明はいくつかの好ましい実施態様に関し
て記載したが、勿論本発明はこれらの態様にのみ
限定されるものではない。
In this example, the method of Example 1 was used to prepare an N-methyl-substituted derivative of the basic pentapeptide of Example 1, except that an equivalent amount of N-methyl-L-arginine was used in place of the protected L-arginine. was synthesized. A peptide of the following formula was obtained. CH 3 NH−ARG−LYS−ASP−VAL−TYR−
COOH As mentioned above, the present invention provides novel polypeptides, ARG-LYS-ASP-VAL-TYR This polypeptide is a complement receptor ( CR It is effective in many therapeutic fields because it can induce differentiation of cells. Furthermore,
Derivatives of the above pentapeptides, novel intermediate polypeptides, methods of making the peptides, therapeutic compositions and uses of the compositions are also provided by the invention. Although the invention has been described with respect to certain preferred embodiments, it is of course not limited to these embodiments.