JPS6123990B2 - - Google Patents
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- JPS6123990B2 JPS6123990B2 JP56125890A JP12589081A JPS6123990B2 JP S6123990 B2 JPS6123990 B2 JP S6123990B2 JP 56125890 A JP56125890 A JP 56125890A JP 12589081 A JP12589081 A JP 12589081A JP S6123990 B2 JPS6123990 B2 JP S6123990B2
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- Japan
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- substance
- acid
- hyphae
- culture
- strain
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- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
Description
本発明は新規抗生物質生産菌に関する。
本発明者らは土壌微生物より各種菌株を分離
し、それらが生産する抗生物質を探索した結果、
兵庫県神戸市の土壌から分離されたKC−6606株
が、グラム陽性菌、グラム陰性菌ならびに抗酸菌
に対して抗菌力を示す新規抗生物質を生産するこ
とを見い出し、さらにその培養液より該物質を単
離することに成功した。 この抗生物質はその物理的、化学的及び生物学
的性状が、既知物質のそれと異なることから新規
物質であることが認められ、KA−6606物質と命
名された。 KA−6606物質は末端にグリシル基を有し、分
子式C17H35O5N5で示されるアミノ配糖体(KA−
6606物質)及び分子式C15H32O4N4で示される
脱グリシル体(KA−6606物質)よりなる混合
物として生産される。 本発明の抗生物質生産菌、KC−6606株(微工
研菌寄第3912号)は、兵庫県神戸市で採取された
土壌を常法により滅菌食塩水に懸濁させ、アルギ
ニンを添加したスターチ・カゼイン寒天培地(PH
7.0)に混和し、37℃で7日間培養したのち、生
じた集落を採取し、次いで常法により純化して得
ることができる。このものは下記の菌学的性質を
有する。特に記載のない限り、各種培地上の性質
は27℃で14日間培養し、常法に従い観察したもの
である。また、色の表示はカラー・ハーモニイ・
マニユアルの分類に従つた。 形態学的性質 本菌株は殿粉無機塩培地上で、基中菌糸なら
びに気菌糸を形成する。基中菌糸(直径0.5〜
0.7μ)は長く分枝し、複雑にからみあつて胞
子柄(長さ2.5μ)の末端に通常1個、ごくま
れに2〜3個の基中胞子(直径0.8〜1.2μ)を
着生する。気菌糸(直径0.6〜0.9μ)は短く、
胞子は20個以上の連鎖として観察される。胞子
鎖は屈曲し、かぎ状ないしらせん状を呈する。
胞子は卵形から長円形(0.5〜0.6μ×0.7〜0.9
μ)で胞子表面は毛様構造をもつさやに覆われ
ている。 各種培地上の性状 1 しよ糖・硝酸塩寒天培地 生育:良好 気菌糸:良好、粉状、シエル・ピンク(5ba) 基中菌糸:バター状、ライト・タン〜ローズ・
ベージユ(3gc〜4gc) 可溶性色素:黄褐色がかつた淡桃色 2 グリセリン・硝酸塩寒天培地 生育:中程度〜良好 気菌糸:良好、粉状、ホワイト(a) 基中菌糸:バター状、ライト・アイボリー
(2ca) 可溶性色素:淡黄色 3 グルコース・アスパラギン寒天培地(斜面) 生育:中程度 気菌糸:なし 基中菌糸:バター状〜ゼラチン状、バフ2fb) 可溶性色素:わずかに淡黄色 4 グリセリン・アスパラギン寒天培地(ISPNo.
5) 生育:中程度 気菌糸:貧弱、粉状、ホワイト(a) 基中菌糸:ゼラチン状、ライト・アイボリー
(2ca) 可溶性色素:わずかに淡黄色 5 殿粉・無機塩寒天培地(ISPNo.4) 生育:良好 気菌糸:貧弱で粉状、ホワイト(a) 基中菌糸:皮革状、ライト・アイボリー〜バフ
(2ca〜2fb) 可溶性色素:なし 6 チロシン寒天培地(斜面、ISPNo.7) 生育:中程度 気菌糸:良好、粉状、ホワイト(a) 基中菌糸:バター状〜ゼラチン状、ライト・ア
イボリー〜バフ(2ca〜2fb) 可溶性色素:わずかに淡黄色 7 栄養寒天培地 生育:中程度 気菌糸:なし 基中菌糸:ゼラチン状、バフ(2fb) 可溶性色素:なし 8 イースト・麦芽寒天培地(ISPNo.2) 生育:良好 気菌糸:極めて貧弱、粉状、ホワイト(a) 基中菌糸:ゼラチン状、バンブー(2gc) 可溶性色素:淡黄色 9 オートミール寒天培地(ISPNo.3) 生育:貧弱 気菌糸:なし 基中菌糸:無色 可溶性色素:なし 10 ペプトン・イースト・鉄寒天培地(斜面、
ISPNo.6) 生育:中程度 気菌糸:貧弱、粉状、ホワイト(a) 基中菌糸:バター状〜ゼラチン状、ライト・メ
ロン・イエロー(2ea) 可溶性色素:わずかに淡黄色 11 ベンネツト寒天培地 生育:良好 気菌糸:なし 基中菌糸:ゼラチン状、ライト・アイボリー
(2ca) 可溶性色素:わずかに淡黄色 生理的性質 1 生育温度範囲:18〜45℃ 2 ゼラチンの液化作用:あり 3 殿粉の加水分解作用:あり 4 ミルクに対する作用 凝固作用:なし ペプトン化:する 5 メラニン様色素の生成 チロシン寒天培地上:生成しない ペプトン・イースト・鉄寒天培地上:生成しな
い 6 硝酸塩より亜硝酸の生成と蓄積:あり 炭素源の資化性(プリドハム・ゴドリーブ寒
天培地上) 利用するもの:D−グルコース、D−フラクト
ース、ラフイノース、しよ糖、
D−マンニトール、ガラクトー
ス、イヌリン、サリシン。 利用しないもの:L−アラビノーズ、D−キシ
ロース、イノシトール、L−ラ
ムノース、ソルビトール、乳
糖、ダルシトール。 以上のようにKC−6606株は寒天培地上に基中
菌糸ならびに気菌糸を形成し、基中菌糸に基中胞
子を着生し、気菌糸に胞子鎖を着生し、胞子の表
面は毛様構造をもつさやで覆われている。 細胞壁の分析により、メソ−ジアミノピメリン
酸を有し、糖としてアラビノーズ及びガラクトー
スを含有することから、本菌株の細胞壁は型に
属することが認められる。 一方、細胞壁中の脂肪酸組成を分析すると、
LCN−A(リピド・キヤラクテリステイツク・
オブ・ノカルデイア)を含まないことが認められ
る。 このような特性を有する既知菌種をバージー
ズ・マニユアル・オブ・デイターミネイテイブ・
バクテリオロジー、第8版(1975年)の中から検
索すると、類似属としてミクロポリスボラ属があ
り、さらにレイシイ及びグツドフエロウが報告し
たサツカロポリスポラ属(ジヤーナル・オブ・ゼ
ネラル・ミクロバイオロジイ、88巻75頁1975年)
があげられる。前者とは胞子の毛様構造と胞子鎖
が20個以上観察される点で異なるが、後者とは形
態的に極めて類似していることから、KC−6606
株はサツカロポリスポラ属に属する菌株と考えら
れる。なお、サツカロポリスポラ属の菌種の体系
的分類についてはいまだに確立した方法がなく、
一属一種の報告があるのみである。 KC−6606株と前記文献記載のサツカロポリス
ポラ・ヒルスタとの相異点を第1表に記す。
し、それらが生産する抗生物質を探索した結果、
兵庫県神戸市の土壌から分離されたKC−6606株
が、グラム陽性菌、グラム陰性菌ならびに抗酸菌
に対して抗菌力を示す新規抗生物質を生産するこ
とを見い出し、さらにその培養液より該物質を単
離することに成功した。 この抗生物質はその物理的、化学的及び生物学
的性状が、既知物質のそれと異なることから新規
物質であることが認められ、KA−6606物質と命
名された。 KA−6606物質は末端にグリシル基を有し、分
子式C17H35O5N5で示されるアミノ配糖体(KA−
6606物質)及び分子式C15H32O4N4で示される
脱グリシル体(KA−6606物質)よりなる混合
物として生産される。 本発明の抗生物質生産菌、KC−6606株(微工
研菌寄第3912号)は、兵庫県神戸市で採取された
土壌を常法により滅菌食塩水に懸濁させ、アルギ
ニンを添加したスターチ・カゼイン寒天培地(PH
7.0)に混和し、37℃で7日間培養したのち、生
じた集落を採取し、次いで常法により純化して得
ることができる。このものは下記の菌学的性質を
有する。特に記載のない限り、各種培地上の性質
は27℃で14日間培養し、常法に従い観察したもの
である。また、色の表示はカラー・ハーモニイ・
マニユアルの分類に従つた。 形態学的性質 本菌株は殿粉無機塩培地上で、基中菌糸なら
びに気菌糸を形成する。基中菌糸(直径0.5〜
0.7μ)は長く分枝し、複雑にからみあつて胞
子柄(長さ2.5μ)の末端に通常1個、ごくま
れに2〜3個の基中胞子(直径0.8〜1.2μ)を
着生する。気菌糸(直径0.6〜0.9μ)は短く、
胞子は20個以上の連鎖として観察される。胞子
鎖は屈曲し、かぎ状ないしらせん状を呈する。
胞子は卵形から長円形(0.5〜0.6μ×0.7〜0.9
μ)で胞子表面は毛様構造をもつさやに覆われ
ている。 各種培地上の性状 1 しよ糖・硝酸塩寒天培地 生育:良好 気菌糸:良好、粉状、シエル・ピンク(5ba) 基中菌糸:バター状、ライト・タン〜ローズ・
ベージユ(3gc〜4gc) 可溶性色素:黄褐色がかつた淡桃色 2 グリセリン・硝酸塩寒天培地 生育:中程度〜良好 気菌糸:良好、粉状、ホワイト(a) 基中菌糸:バター状、ライト・アイボリー
(2ca) 可溶性色素:淡黄色 3 グルコース・アスパラギン寒天培地(斜面) 生育:中程度 気菌糸:なし 基中菌糸:バター状〜ゼラチン状、バフ2fb) 可溶性色素:わずかに淡黄色 4 グリセリン・アスパラギン寒天培地(ISPNo.
5) 生育:中程度 気菌糸:貧弱、粉状、ホワイト(a) 基中菌糸:ゼラチン状、ライト・アイボリー
(2ca) 可溶性色素:わずかに淡黄色 5 殿粉・無機塩寒天培地(ISPNo.4) 生育:良好 気菌糸:貧弱で粉状、ホワイト(a) 基中菌糸:皮革状、ライト・アイボリー〜バフ
(2ca〜2fb) 可溶性色素:なし 6 チロシン寒天培地(斜面、ISPNo.7) 生育:中程度 気菌糸:良好、粉状、ホワイト(a) 基中菌糸:バター状〜ゼラチン状、ライト・ア
イボリー〜バフ(2ca〜2fb) 可溶性色素:わずかに淡黄色 7 栄養寒天培地 生育:中程度 気菌糸:なし 基中菌糸:ゼラチン状、バフ(2fb) 可溶性色素:なし 8 イースト・麦芽寒天培地(ISPNo.2) 生育:良好 気菌糸:極めて貧弱、粉状、ホワイト(a) 基中菌糸:ゼラチン状、バンブー(2gc) 可溶性色素:淡黄色 9 オートミール寒天培地(ISPNo.3) 生育:貧弱 気菌糸:なし 基中菌糸:無色 可溶性色素:なし 10 ペプトン・イースト・鉄寒天培地(斜面、
ISPNo.6) 生育:中程度 気菌糸:貧弱、粉状、ホワイト(a) 基中菌糸:バター状〜ゼラチン状、ライト・メ
ロン・イエロー(2ea) 可溶性色素:わずかに淡黄色 11 ベンネツト寒天培地 生育:良好 気菌糸:なし 基中菌糸:ゼラチン状、ライト・アイボリー
(2ca) 可溶性色素:わずかに淡黄色 生理的性質 1 生育温度範囲:18〜45℃ 2 ゼラチンの液化作用:あり 3 殿粉の加水分解作用:あり 4 ミルクに対する作用 凝固作用:なし ペプトン化:する 5 メラニン様色素の生成 チロシン寒天培地上:生成しない ペプトン・イースト・鉄寒天培地上:生成しな
い 6 硝酸塩より亜硝酸の生成と蓄積:あり 炭素源の資化性(プリドハム・ゴドリーブ寒
天培地上) 利用するもの:D−グルコース、D−フラクト
ース、ラフイノース、しよ糖、
D−マンニトール、ガラクトー
ス、イヌリン、サリシン。 利用しないもの:L−アラビノーズ、D−キシ
ロース、イノシトール、L−ラ
ムノース、ソルビトール、乳
糖、ダルシトール。 以上のようにKC−6606株は寒天培地上に基中
菌糸ならびに気菌糸を形成し、基中菌糸に基中胞
子を着生し、気菌糸に胞子鎖を着生し、胞子の表
面は毛様構造をもつさやで覆われている。 細胞壁の分析により、メソ−ジアミノピメリン
酸を有し、糖としてアラビノーズ及びガラクトー
スを含有することから、本菌株の細胞壁は型に
属することが認められる。 一方、細胞壁中の脂肪酸組成を分析すると、
LCN−A(リピド・キヤラクテリステイツク・
オブ・ノカルデイア)を含まないことが認められ
る。 このような特性を有する既知菌種をバージー
ズ・マニユアル・オブ・デイターミネイテイブ・
バクテリオロジー、第8版(1975年)の中から検
索すると、類似属としてミクロポリスボラ属があ
り、さらにレイシイ及びグツドフエロウが報告し
たサツカロポリスポラ属(ジヤーナル・オブ・ゼ
ネラル・ミクロバイオロジイ、88巻75頁1975年)
があげられる。前者とは胞子の毛様構造と胞子鎖
が20個以上観察される点で異なるが、後者とは形
態的に極めて類似していることから、KC−6606
株はサツカロポリスポラ属に属する菌株と考えら
れる。なお、サツカロポリスポラ属の菌種の体系
的分類についてはいまだに確立した方法がなく、
一属一種の報告があるのみである。 KC−6606株と前記文献記載のサツカロポリス
ポラ・ヒルスタとの相異点を第1表に記す。
【表】
このようにKC−6606株はサツカロポリスポ
ラ・ヒルスタとは炭素源の資化性において相違す
るが、形態学的性質、各種培地上の性質、生理的
性質等の基本性状はよく一致するので同一種とみ
るのが妥当である。 以上の知見に基づき本発明者らは、本菌株はサ
ツカロポリスポラ・ヒルスタの自然変異株と考
え、これをサツカロポリスポラ・ヒルスタ・KC
−6606株と命名した。 本発明のサツカロポリスポラ・ヒルスタに属す
る菌株はその性状が変化しやすく、たとえば紫外
線、エツクス線、薬品などを用いる人工変異手段
で容易に変異し得る。なおサツカロポリスポラ・
ヒルスタに属する菌が抗生物質を生産することは
文献に報告されていない。 本菌株の培養には通常の放射菌の培養方法が用
いられる。培養基の炭素源としては種々のものが
用いられるが、殿粉、ブドウ糖、グリセリン、マ
ルトース、デキストリン、蔗糖、果糖、糖蜜など
を単独で又は組み合わせて用いることが好まし
い。さらに菌の資化性によつては炭化水素、有機
酸、植物油なども用いられる。窒素源としては大
豆粉、酵母エキス、乾燥酵母、ペプトン、肉エキ
ス、コーンステイープリカー、カザミノ酸、デイ
ステイラーズソリユブル、塩化アンモニウム、硫
酸アンモニウム、尿素、硝酸ナトリウムなどが単
独で又は組み合わせて用いられる。 その他必要に応じ、食塩、燐酸カリウム、硫酸
マグネシウム、塩化カルシウム、炭酸カルシウ
ム、水酸化カルシウム、塩化コバルト、硫酸亜
鉛、塩化鉄、硫酸鉄などの無機塩、ならびに微量
の金属を添加することができる。さらに菌の発育
を助け、KA−6606物質の生産を促進する有機及
び無機物質を適宜に添加することができる。通気
培養法を用いる場合には、さらに脂肪油、シリコ
ーン油、パラフインなどの消泡剤が用いられる。 培養方法としては、固体培地上での培養も可能
であるが、一般抗生物質生産の方法と同様に液体
培養法、特に深部培養法を用いることが好まし
い。培養は好気的条件下で行なわれ、培養温度は
20〜35℃で、27℃付近が好ましい。 KA−6606物質の生産は、振盪培養又はタンク
培養のいずれの場合も2〜6日間培養を行なう
と、活性物質が培養液中に生産蓄積される。培養
液中の生産量が最大に達した時点で培養を停止
し、培養液中より目的の抗生物質を単離精製す
る。 培養液から本物質を単離精製するには、KA
−6606物質が水に可溶で一般の有機溶媒に難溶の
水溶性塩基性物質であるため、通常の水溶性塩基
性抗生物質の単離、精製法を利用することができ
る。イオン交換樹脂、活性炭、セルロース、シリ
カゲル、アルミナ等による吸脱着法、補助剤とし
て高級脂肪酸を加えブタノール、アミルアルコー
ル等で抽出する方法などを適当に組み合わせて用
いることができる。 培養液を弱酸性陽イオン交換樹脂の層に通す
と、KA−6606物質が吸着される。これを0.1〜
3.0規定のアルカリ又は酸で溶出し、活性成分を
凍結乾燥すると、KA−6606物質の粗粉末が得ら
れる。このとき用いられる弱酸性陽イオン交換樹
脂としては、アンバーライトIRC−50、IRC−84
又はCG−50(ローム・アンド・ハース社製)、ダ
イヤイオンWK−10又はWK−20(三菱化成社
製)などがあげられる。またアルカリとしてはア
ンモニア水、水酸化ナトリウム水溶液などが、酸
としては蟻酸、塩酸、硫酸などがあげられる。 培養液をPH7〜9に調整し、目的物質を活性
炭に吸着させ、酸性の水又は塩酸メタノールで溶
出させる方法も利用できる。 こうして得られる粗粉末は、弱酸性陽イオン交
換樹脂、CM−セフアデツクス、CM−セルロー
スなどに吸着させ、アンモニア水、蟻酸アンモニ
ウム水溶液などを用い、濃度勾配法又は濃度段階
法で溶出することにより、遊離塩基としてKA−
6606物質と同物質を分離することができる。 こうして得られる遊離塩基(及び)は、更
に強塩基性陰イオン交換樹脂、例えばダウエツク
ス1×2(ダウ・ケミカル社製)のカラムに通
し、次いで例えば水で溶出し、活性区分を集め凍
結乾燥することにより、それぞれ純品の遊離塩基
(及び)を得ることができる。 この遊離塩基はそれぞれ無機酸例えば塩酸、硫
酸、臭化水素酸又は有機酸例えば酢酸、しゆう酸
などを加え、常法により対応する酸付加塩に導く
ことができる。 KA−6606物質は、KA−6606物質より末
端のグリシル基を除去した構造を有するので、
KA−6606物質をアルカリ又は酸で分解するこ
とによつても製造することができる。すなわち、
KA−6606物質にアルカリ試薬例えば水酸化ナ
トリウム又は水酸化バリウムの0.1〜4.0規定水溶
液あるいは酸性試薬例えば塩化水素又は硫酸の
0.1〜1.0規定水溶液を作用させることによりKA
−6606物質に変換することができる。この際ア
ルカリ試薬には強塩基性陰イオン交換樹脂例えば
アンバーライトIRA400(OH-型)又はダウエツ
クス1×2(OH-型)を、酸性試薬には強酸性
陽イオン交換樹脂例えば、アンバーライトIR120
(H+型)又はダウエツクス50×8(H+型)を加
えて、懸濁状態で反応させても目的物質が得られ
る。反応は通常30〜100℃で0.5〜3時間で終了す
る。 KA−6606物質及びはいずれも塩基性水溶
性の白色物質で、主としてグラム陽性菌、陰性菌
及び抗酸菌に対して抗菌性を示す有用な新抗生物
質である。本物質の理化学的及び生物学的性状は
下記のとおりである。 KA−6606物質の遊離塩基: (1) 外観 白色粉末 (2) 分子式 C17H35O5N5 (3) 元素分析値 C H N 実験値(%) 52.10 8.84 17.83 計算値(%) 52.42 9.06 17.99 (4) 分子量389(マススペクトル) (5) 融点 125〜135℃ (6) 比旋光度 〔α〕27 D+104゜(c=1、H2O) (7) 紫外線吸収スペクトル 220〜360nmで特異的な吸収を示さず、末
端吸収のみを示す。 (8) 赤外線吸収スペクトル 臭化カリウム中にペレツトした赤外線吸収
スペクトルは第1図に示すとおりである。 (9) 溶剤に対する溶解性 水に極めて溶けやすい。メタノールに易
溶、エタノール、アセトンにやや溶けにく
い。クロロホルム、酢酸エチル、エーテ
ル、ヘキサン、石油エーテルに不溶。 (10) 呈色反応 ニンヒドリン反応及びライドン・スミス反
応:陽性.坂口反応、マルトール反応、塩
化第二鉄反応及びフエーリング反応:陰
性。 (11) 安定性 PH3〜8で安定で、塩基性及び強酸性で
徐々に分解失活する。 (12) 核磁気共鳴スペクトル δD2O(ppm): 1.25(3H、d)C−CH3 、 3.05(3H、s)N−CH3 、 3.07(2H、s)COCH2 N、 3.40(3H、s)OCH3 、 5.00(1H、d)アノメリツクH (13) マススペクトル(m/e): 389(M+)、276、258、248、230、180、
143 (14) ペーパークロマトグラフイー Rf値:0.53 紙;ワツトマンNo.1 溶媒;クロロホルム・メタノール・17%
アンモニア水(2:1:1)の下
層 (15) 薄層クロマトグラフイー
ラ・ヒルスタとは炭素源の資化性において相違す
るが、形態学的性質、各種培地上の性質、生理的
性質等の基本性状はよく一致するので同一種とみ
るのが妥当である。 以上の知見に基づき本発明者らは、本菌株はサ
ツカロポリスポラ・ヒルスタの自然変異株と考
え、これをサツカロポリスポラ・ヒルスタ・KC
−6606株と命名した。 本発明のサツカロポリスポラ・ヒルスタに属す
る菌株はその性状が変化しやすく、たとえば紫外
線、エツクス線、薬品などを用いる人工変異手段
で容易に変異し得る。なおサツカロポリスポラ・
ヒルスタに属する菌が抗生物質を生産することは
文献に報告されていない。 本菌株の培養には通常の放射菌の培養方法が用
いられる。培養基の炭素源としては種々のものが
用いられるが、殿粉、ブドウ糖、グリセリン、マ
ルトース、デキストリン、蔗糖、果糖、糖蜜など
を単独で又は組み合わせて用いることが好まし
い。さらに菌の資化性によつては炭化水素、有機
酸、植物油なども用いられる。窒素源としては大
豆粉、酵母エキス、乾燥酵母、ペプトン、肉エキ
ス、コーンステイープリカー、カザミノ酸、デイ
ステイラーズソリユブル、塩化アンモニウム、硫
酸アンモニウム、尿素、硝酸ナトリウムなどが単
独で又は組み合わせて用いられる。 その他必要に応じ、食塩、燐酸カリウム、硫酸
マグネシウム、塩化カルシウム、炭酸カルシウ
ム、水酸化カルシウム、塩化コバルト、硫酸亜
鉛、塩化鉄、硫酸鉄などの無機塩、ならびに微量
の金属を添加することができる。さらに菌の発育
を助け、KA−6606物質の生産を促進する有機及
び無機物質を適宜に添加することができる。通気
培養法を用いる場合には、さらに脂肪油、シリコ
ーン油、パラフインなどの消泡剤が用いられる。 培養方法としては、固体培地上での培養も可能
であるが、一般抗生物質生産の方法と同様に液体
培養法、特に深部培養法を用いることが好まし
い。培養は好気的条件下で行なわれ、培養温度は
20〜35℃で、27℃付近が好ましい。 KA−6606物質の生産は、振盪培養又はタンク
培養のいずれの場合も2〜6日間培養を行なう
と、活性物質が培養液中に生産蓄積される。培養
液中の生産量が最大に達した時点で培養を停止
し、培養液中より目的の抗生物質を単離精製す
る。 培養液から本物質を単離精製するには、KA
−6606物質が水に可溶で一般の有機溶媒に難溶の
水溶性塩基性物質であるため、通常の水溶性塩基
性抗生物質の単離、精製法を利用することができ
る。イオン交換樹脂、活性炭、セルロース、シリ
カゲル、アルミナ等による吸脱着法、補助剤とし
て高級脂肪酸を加えブタノール、アミルアルコー
ル等で抽出する方法などを適当に組み合わせて用
いることができる。 培養液を弱酸性陽イオン交換樹脂の層に通す
と、KA−6606物質が吸着される。これを0.1〜
3.0規定のアルカリ又は酸で溶出し、活性成分を
凍結乾燥すると、KA−6606物質の粗粉末が得ら
れる。このとき用いられる弱酸性陽イオン交換樹
脂としては、アンバーライトIRC−50、IRC−84
又はCG−50(ローム・アンド・ハース社製)、ダ
イヤイオンWK−10又はWK−20(三菱化成社
製)などがあげられる。またアルカリとしてはア
ンモニア水、水酸化ナトリウム水溶液などが、酸
としては蟻酸、塩酸、硫酸などがあげられる。 培養液をPH7〜9に調整し、目的物質を活性
炭に吸着させ、酸性の水又は塩酸メタノールで溶
出させる方法も利用できる。 こうして得られる粗粉末は、弱酸性陽イオン交
換樹脂、CM−セフアデツクス、CM−セルロー
スなどに吸着させ、アンモニア水、蟻酸アンモニ
ウム水溶液などを用い、濃度勾配法又は濃度段階
法で溶出することにより、遊離塩基としてKA−
6606物質と同物質を分離することができる。 こうして得られる遊離塩基(及び)は、更
に強塩基性陰イオン交換樹脂、例えばダウエツク
ス1×2(ダウ・ケミカル社製)のカラムに通
し、次いで例えば水で溶出し、活性区分を集め凍
結乾燥することにより、それぞれ純品の遊離塩基
(及び)を得ることができる。 この遊離塩基はそれぞれ無機酸例えば塩酸、硫
酸、臭化水素酸又は有機酸例えば酢酸、しゆう酸
などを加え、常法により対応する酸付加塩に導く
ことができる。 KA−6606物質は、KA−6606物質より末
端のグリシル基を除去した構造を有するので、
KA−6606物質をアルカリ又は酸で分解するこ
とによつても製造することができる。すなわち、
KA−6606物質にアルカリ試薬例えば水酸化ナ
トリウム又は水酸化バリウムの0.1〜4.0規定水溶
液あるいは酸性試薬例えば塩化水素又は硫酸の
0.1〜1.0規定水溶液を作用させることによりKA
−6606物質に変換することができる。この際ア
ルカリ試薬には強塩基性陰イオン交換樹脂例えば
アンバーライトIRA400(OH-型)又はダウエツ
クス1×2(OH-型)を、酸性試薬には強酸性
陽イオン交換樹脂例えば、アンバーライトIR120
(H+型)又はダウエツクス50×8(H+型)を加
えて、懸濁状態で反応させても目的物質が得られ
る。反応は通常30〜100℃で0.5〜3時間で終了す
る。 KA−6606物質及びはいずれも塩基性水溶
性の白色物質で、主としてグラム陽性菌、陰性菌
及び抗酸菌に対して抗菌性を示す有用な新抗生物
質である。本物質の理化学的及び生物学的性状は
下記のとおりである。 KA−6606物質の遊離塩基: (1) 外観 白色粉末 (2) 分子式 C17H35O5N5 (3) 元素分析値 C H N 実験値(%) 52.10 8.84 17.83 計算値(%) 52.42 9.06 17.99 (4) 分子量389(マススペクトル) (5) 融点 125〜135℃ (6) 比旋光度 〔α〕27 D+104゜(c=1、H2O) (7) 紫外線吸収スペクトル 220〜360nmで特異的な吸収を示さず、末
端吸収のみを示す。 (8) 赤外線吸収スペクトル 臭化カリウム中にペレツトした赤外線吸収
スペクトルは第1図に示すとおりである。 (9) 溶剤に対する溶解性 水に極めて溶けやすい。メタノールに易
溶、エタノール、アセトンにやや溶けにく
い。クロロホルム、酢酸エチル、エーテ
ル、ヘキサン、石油エーテルに不溶。 (10) 呈色反応 ニンヒドリン反応及びライドン・スミス反
応:陽性.坂口反応、マルトール反応、塩
化第二鉄反応及びフエーリング反応:陰
性。 (11) 安定性 PH3〜8で安定で、塩基性及び強酸性で
徐々に分解失活する。 (12) 核磁気共鳴スペクトル δD2O(ppm): 1.25(3H、d)C−CH3 、 3.05(3H、s)N−CH3 、 3.07(2H、s)COCH2 N、 3.40(3H、s)OCH3 、 5.00(1H、d)アノメリツクH (13) マススペクトル(m/e): 389(M+)、276、258、248、230、180、
143 (14) ペーパークロマトグラフイー Rf値:0.53 紙;ワツトマンNo.1 溶媒;クロロホルム・メタノール・17%
アンモニア水(2:1:1)の下
層 (15) 薄層クロマトグラフイー
【表】
なおプレートはTLCアルミニウムシートシリ
カゲル60F2540.2mm(メルク社製)を用いた。KA
−6606物質のテトラ−N−アセチル体: (1) 外観 結晶性白色粉末 (2) 分子式 C25H43O9N5 (3) 元素分析値 C H N 実験値(%) 53,51 7.58 12.44 計算値(%) 53.85 7.77 12.56 (4) 分子量 557(マススペクトル) (5) 融点 160〜166℃ (6) 比旋光度 〔α〕25 D+112゜ (c=1、
H2O) (7) 核磁気共鳴スペクトル δD2O(ppm): 1.10(3H、d)C−CH3 、 1.95、2.00、2.05、2.07(3H、s)COC
H3 、 3.09(3H、s)N−CH3 、 3.42(3H、s)O−CH3 、 4.11(2H、s)COCH2 N−、 4.95(1H、d)アノメリツクH (8) マススペクトル(m/e): 557(M+)、342、314、296、227 KA−6606物質の遊離塩基: (1) 外観 白色粉末 (2) 分子式 C15H32O4N4 (3) 元素分析値 C H N 実験値(%) 53.97 9.51 16.55 計算値(%) 54.19 9.70 16.85 (4) 分子量 332(マススペクトル) (5) 融点88〜93℃ (6) 比旋光度 〔α〕27 D+139.5゜(c=1、
H2O) (7) 紫外線吸収スペクトル 220〜360nmで特異的な吸収を示さず、末
端吸収のみを示す。 (8) 赤外線吸収スペクトル 臭化カリウム中にペレツトした赤外線スペ
クトルは第2図に示すとおりである。 (9) 溶剤に対する溶解性 水に極めて溶けやすい。メタノールに易
溶、エタノール、アセトンにやや溶けにく
い。クロロホルム、酢酸エチル、エーテ
ル、ヘキサン、石油エーテルに不溶。 (10) 呈色反応 ニンヒドリン反応及びライドン・スミス反
応:陽性.坂口反応、マルトール反応、塩
化第二鉄反応及びフエーリング反応:陰
性。 (11) 安定性 PH2以上で安定で、強酸性で徐々に分解す
る。 (12) 核磁気共鳴スペクトル δD2O(ppm): 1.25(3H、d)C−CH3 、 2.70(3H、s)N−CH3 、 3.45(3H、s)O−CH3 、 4.95(1H、d)アノメリツクH (13) マススペクトル(m/e): 332(M+)、283、219、119、143 (14) ペーパークロマトグラフイー Rf値:0.86 紙;ワツトマンNo.1 溶媒;クロロホルム・メタノール・17%
アンモニア水(2:1:1)の下
層 (15) 薄層クロマトグラフイー
カゲル60F2540.2mm(メルク社製)を用いた。KA
−6606物質のテトラ−N−アセチル体: (1) 外観 結晶性白色粉末 (2) 分子式 C25H43O9N5 (3) 元素分析値 C H N 実験値(%) 53,51 7.58 12.44 計算値(%) 53.85 7.77 12.56 (4) 分子量 557(マススペクトル) (5) 融点 160〜166℃ (6) 比旋光度 〔α〕25 D+112゜ (c=1、
H2O) (7) 核磁気共鳴スペクトル δD2O(ppm): 1.10(3H、d)C−CH3 、 1.95、2.00、2.05、2.07(3H、s)COC
H3 、 3.09(3H、s)N−CH3 、 3.42(3H、s)O−CH3 、 4.11(2H、s)COCH2 N−、 4.95(1H、d)アノメリツクH (8) マススペクトル(m/e): 557(M+)、342、314、296、227 KA−6606物質の遊離塩基: (1) 外観 白色粉末 (2) 分子式 C15H32O4N4 (3) 元素分析値 C H N 実験値(%) 53.97 9.51 16.55 計算値(%) 54.19 9.70 16.85 (4) 分子量 332(マススペクトル) (5) 融点88〜93℃ (6) 比旋光度 〔α〕27 D+139.5゜(c=1、
H2O) (7) 紫外線吸収スペクトル 220〜360nmで特異的な吸収を示さず、末
端吸収のみを示す。 (8) 赤外線吸収スペクトル 臭化カリウム中にペレツトした赤外線スペ
クトルは第2図に示すとおりである。 (9) 溶剤に対する溶解性 水に極めて溶けやすい。メタノールに易
溶、エタノール、アセトンにやや溶けにく
い。クロロホルム、酢酸エチル、エーテ
ル、ヘキサン、石油エーテルに不溶。 (10) 呈色反応 ニンヒドリン反応及びライドン・スミス反
応:陽性.坂口反応、マルトール反応、塩
化第二鉄反応及びフエーリング反応:陰
性。 (11) 安定性 PH2以上で安定で、強酸性で徐々に分解す
る。 (12) 核磁気共鳴スペクトル δD2O(ppm): 1.25(3H、d)C−CH3 、 2.70(3H、s)N−CH3 、 3.45(3H、s)O−CH3 、 4.95(1H、d)アノメリツクH (13) マススペクトル(m/e): 332(M+)、283、219、119、143 (14) ペーパークロマトグラフイー Rf値:0.86 紙;ワツトマンNo.1 溶媒;クロロホルム・メタノール・17%
アンモニア水(2:1:1)の下
層 (15) 薄層クロマトグラフイー
【表】
なおプレートはTLCアルミニウムシートシリ
カゲル60F2540.2mm(メルク社製)を用いた。KA
−6606物質のペンタ−N−アセチル体: (1) 外観 白色針状結晶 (2) 分子式 C23H40O3N4・H2O (3) 元素分析値 C H N 実験値(%) 52.99 7.65 10.52 計算値(%) 53.27 8.16 10.80 (4) 分子量 500(マススペクトル) (5) 融点 139〜141℃ (6) 比旋光度 〔α〕22 D+52゜(c=1、H2O) (7) 核磁気共鳴スペクトル δD2O(ppm): 1.09(3H、d)C−CH3 、 1.98、1.99、2.01、2.13(3H、s)CO−
CH3 、 3.10(3H、s)N−CH3 、 3.40(3H、s)O−CH3 、 4.96(1H、d)アノメリツクH (8) マススペクトル(m/e): 500(M+)、303、271、257、227 以上の物理化学的諸性質を参照して、KA−
6606及び物質は遊離塩基の形で下記の構造式
で表わされる。 抗菌作用: KA−6606及び物質の各種微生物に対する
抗菌スペクトラムは第2表に示すとおりである。
カゲル60F2540.2mm(メルク社製)を用いた。KA
−6606物質のペンタ−N−アセチル体: (1) 外観 白色針状結晶 (2) 分子式 C23H40O3N4・H2O (3) 元素分析値 C H N 実験値(%) 52.99 7.65 10.52 計算値(%) 53.27 8.16 10.80 (4) 分子量 500(マススペクトル) (5) 融点 139〜141℃ (6) 比旋光度 〔α〕22 D+52゜(c=1、H2O) (7) 核磁気共鳴スペクトル δD2O(ppm): 1.09(3H、d)C−CH3 、 1.98、1.99、2.01、2.13(3H、s)CO−
CH3 、 3.10(3H、s)N−CH3 、 3.40(3H、s)O−CH3 、 4.96(1H、d)アノメリツクH (8) マススペクトル(m/e): 500(M+)、303、271、257、227 以上の物理化学的諸性質を参照して、KA−
6606及び物質は遊離塩基の形で下記の構造式
で表わされる。 抗菌作用: KA−6606及び物質の各種微生物に対する
抗菌スペクトラムは第2表に示すとおりである。
【表】
【表】
このように抗生物質KA−6606は広範囲のグラ
ム陽性菌、グラム陰性菌ならびに抗酸菌に対して
優れた抗菌力を有し、また種々の既知抗生物質に
耐性な菌株に対しても抗菌力を有している。特に
カナマイシン、ゲンタマイシン、トブラマイシ
ン、アミカシンなどに耐性を示す大腸菌や緑膿菌
に有効であるという特性を有している。 スタフイロコツカス・アウレウス・スミス株を
マウス復腔内に接種し、KA−6606物質を皮下
注射したときに得られる本物質の感染治療効果
ED50は0.7mg/Kgである。またLD50はマウスで静
注50mg/Kg以上である。 そのほか第3表及び第4表に示すように、ペー
パークロマトグラフイー及び薄層クロマトグラフ
イーの結果により、KA−6606物質は既知の抗生
物質と相違することが認められる。
ム陽性菌、グラム陰性菌ならびに抗酸菌に対して
優れた抗菌力を有し、また種々の既知抗生物質に
耐性な菌株に対しても抗菌力を有している。特に
カナマイシン、ゲンタマイシン、トブラマイシ
ン、アミカシンなどに耐性を示す大腸菌や緑膿菌
に有効であるという特性を有している。 スタフイロコツカス・アウレウス・スミス株を
マウス復腔内に接種し、KA−6606物質を皮下
注射したときに得られる本物質の感染治療効果
ED50は0.7mg/Kgである。またLD50はマウスで静
注50mg/Kg以上である。 そのほか第3表及び第4表に示すように、ペー
パークロマトグラフイー及び薄層クロマトグラフ
イーの結果により、KA−6606物質は既知の抗生
物質と相違することが認められる。
【表】
【表】
本物質は前述のように広範囲の優れた抗菌スペ
クトラムを有することから、抗菌性物質として医
薬、動物薬などに有用である。また本物質は種々
の誘導体を合成するための出発物質としても有用
である。 本菌の培養及び生成したKA−6606物質の採取
に関する実験例を下記に示す。 例 1 殿粉3%、大豆粉15%、コーンステイプリカー
0.5%、酵母エキス0.2%、硫酸マグネシウム0.05
%、食塩0.3%、炭酸カルシウム0.3%及び塩化コ
バルト六水塩0.001%の組成を有し、PH7.0に調整
し滅菌した培地にKC−6606株を接種し、27℃に
て約50時間前培養したものを第一種菌とする。
200容のタンクに種菌培地と同じ培地に綿実油
1%を添加した培地100を仕込み、第一種菌200
mlを接種し、27℃で通気撹拌方式(225rpm通気
量50/min)により4日間培養する。 培養終了後、培養液に硫酸を添加してPH2.0に
調整したのち、過助剤としてダイカライト(ダ
イカライト・オリエント社製)を加えて菌体を
別する。液に希水酸化ナトリウム水溶液を加え
てPHを8.0に調整し、陽イオン交換樹脂アンバー
ライトIRC−50(NH+ 4型)のカラムに通し(流出
液は捨てる)、水洗後、1規定アンモニア水で吸
着された活性物質を溶出する。バチルス・ズブチ
リスの寒天平板を用いてペーパーデイスク法によ
り溶出液の活性を測定し、活性のある区分を合わ
せ、減圧下で約50mlまで濃縮する。この濃縮液を
凍結乾燥すると、KA−6606物質の粗粉末8.8gが
得られる。 この粗粉末8gを蒸留水50mlに溶解し、PHを
7.0に調整し、陽イオン交換樹脂アンバーライト
CG−50型(NH+ 4型)のカラム(3×150cm)に
通し、水洗後、0.01規定のアンモニア水5と1
規定のアンモニア水5の間で濃度勾配法を用い
て150ml/時の流速で溶出し、25mlごとに分画す
る。各画分をペーパーデイスク法により活性を検
定し、KA−6606に該当する成分の含まれる画
分及びKA−6606に該当する成分の含まれる画
分をそれぞれ集め、凍結乾燥すると、KA−6606
の遊離塩基80mg及びKA−6606の遊離塩基16
mgが得られる。 この凍結乾燥品をそれぞれ水に溶解し、PHを
7.0に調整したのち、陰イオン交換樹脂ダウエツ
クス1×2(OH-型)のカラム(1×150cm)に
通し、水で溶出する。活性区分を集めて凍結乾燥
すると、KA−6606の遊離塩基の精製標品50mg
及びKA−6606の遊離塩基の精製標品10mgが得
られる。 例 2 殿粉2%、大豆粉1%、コーンステイープリカ
ー0.5%、硫酸マグネシウム0.05%、食塩0.3%及
び炭酸カルシウム0.3%の組成を有し、PH7.0に調
整滅菌した培地にKC−6606株を接種し、27℃で
約50時間、前培養したものを第一種菌とする。20
容のシヤーフアメンターに前記培地10を仕込
み、第一種菌100mlを接種して27℃で4日間通気
撹拌方式(250rpm通気量10)により培養す
る。 以下、例1と同様に処理し、単離精製を行う
と、KA−6606の遊離塩基20mg及びKA−6606
の遊離塩基4mgが精製標品として得られる。 例 3 前記により得られたKA−6606物質40mgを4
規定水酸化ナトリウム水溶液1mlに溶解し、1時
間加熱する。反応混合物を水100mlに溶解し、中
和したのち陽イオン交換樹脂アンバーライトCG
−50(NH+ 4型)のカラム(1×10cm)に通し、カ
ラムを水100mlで洗浄後、1規定アンモニア水で
溶出する。ニンヒドリン反応陽性で抗菌活性を有
する画分を集め、凍結乾燥すると、白色粉末とし
てKA−6606物質の遊離塩基23mgが得られる。
クトラムを有することから、抗菌性物質として医
薬、動物薬などに有用である。また本物質は種々
の誘導体を合成するための出発物質としても有用
である。 本菌の培養及び生成したKA−6606物質の採取
に関する実験例を下記に示す。 例 1 殿粉3%、大豆粉15%、コーンステイプリカー
0.5%、酵母エキス0.2%、硫酸マグネシウム0.05
%、食塩0.3%、炭酸カルシウム0.3%及び塩化コ
バルト六水塩0.001%の組成を有し、PH7.0に調整
し滅菌した培地にKC−6606株を接種し、27℃に
て約50時間前培養したものを第一種菌とする。
200容のタンクに種菌培地と同じ培地に綿実油
1%を添加した培地100を仕込み、第一種菌200
mlを接種し、27℃で通気撹拌方式(225rpm通気
量50/min)により4日間培養する。 培養終了後、培養液に硫酸を添加してPH2.0に
調整したのち、過助剤としてダイカライト(ダ
イカライト・オリエント社製)を加えて菌体を
別する。液に希水酸化ナトリウム水溶液を加え
てPHを8.0に調整し、陽イオン交換樹脂アンバー
ライトIRC−50(NH+ 4型)のカラムに通し(流出
液は捨てる)、水洗後、1規定アンモニア水で吸
着された活性物質を溶出する。バチルス・ズブチ
リスの寒天平板を用いてペーパーデイスク法によ
り溶出液の活性を測定し、活性のある区分を合わ
せ、減圧下で約50mlまで濃縮する。この濃縮液を
凍結乾燥すると、KA−6606物質の粗粉末8.8gが
得られる。 この粗粉末8gを蒸留水50mlに溶解し、PHを
7.0に調整し、陽イオン交換樹脂アンバーライト
CG−50型(NH+ 4型)のカラム(3×150cm)に
通し、水洗後、0.01規定のアンモニア水5と1
規定のアンモニア水5の間で濃度勾配法を用い
て150ml/時の流速で溶出し、25mlごとに分画す
る。各画分をペーパーデイスク法により活性を検
定し、KA−6606に該当する成分の含まれる画
分及びKA−6606に該当する成分の含まれる画
分をそれぞれ集め、凍結乾燥すると、KA−6606
の遊離塩基80mg及びKA−6606の遊離塩基16
mgが得られる。 この凍結乾燥品をそれぞれ水に溶解し、PHを
7.0に調整したのち、陰イオン交換樹脂ダウエツ
クス1×2(OH-型)のカラム(1×150cm)に
通し、水で溶出する。活性区分を集めて凍結乾燥
すると、KA−6606の遊離塩基の精製標品50mg
及びKA−6606の遊離塩基の精製標品10mgが得
られる。 例 2 殿粉2%、大豆粉1%、コーンステイープリカ
ー0.5%、硫酸マグネシウム0.05%、食塩0.3%及
び炭酸カルシウム0.3%の組成を有し、PH7.0に調
整滅菌した培地にKC−6606株を接種し、27℃で
約50時間、前培養したものを第一種菌とする。20
容のシヤーフアメンターに前記培地10を仕込
み、第一種菌100mlを接種して27℃で4日間通気
撹拌方式(250rpm通気量10)により培養す
る。 以下、例1と同様に処理し、単離精製を行う
と、KA−6606の遊離塩基20mg及びKA−6606
の遊離塩基4mgが精製標品として得られる。 例 3 前記により得られたKA−6606物質40mgを4
規定水酸化ナトリウム水溶液1mlに溶解し、1時
間加熱する。反応混合物を水100mlに溶解し、中
和したのち陽イオン交換樹脂アンバーライトCG
−50(NH+ 4型)のカラム(1×10cm)に通し、カ
ラムを水100mlで洗浄後、1規定アンモニア水で
溶出する。ニンヒドリン反応陽性で抗菌活性を有
する画分を集め、凍結乾燥すると、白色粉末とし
てKA−6606物質の遊離塩基23mgが得られる。
第1図は抗生物質KA−6606の赤外線吸収ス
ペクトル、第2図は抗生物質KA−6606の赤外
線吸収スペクトルである。
ペクトル、第2図は抗生物質KA−6606の赤外
線吸収スペクトルである。
Claims (1)
- 1 プリドハム・ゴドリーブ寒天培地上でD−キ
シロース、L−ラムノース、ソルビトール及びイ
ノシトールのいずれをも炭素源として利用せず、
硝酸塩より亜硝酸を生成してこれを蓄積する性質
を有し、かつ抗生物質KA−6606の生産能を有す
るサツカロポリスポラ・ヒルスタ・KC−6606。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP56125890A JPS5783280A (en) | 1981-08-13 | 1981-08-13 | Bacteria producing novel antibiotic substance |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP56125890A JPS5783280A (en) | 1981-08-13 | 1981-08-13 | Bacteria producing novel antibiotic substance |
Related Parent Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP3158077A Division JPS53127401A (en) | 1977-03-24 | 1977-03-24 | Novel antibiotics and process for preparing same |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS5783280A JPS5783280A (en) | 1982-05-25 |
| JPS6123990B2 true JPS6123990B2 (ja) | 1986-06-09 |
Family
ID=14921445
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP56125890A Granted JPS5783280A (en) | 1981-08-13 | 1981-08-13 | Bacteria producing novel antibiotic substance |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS5783280A (ja) |
-
1981
- 1981-08-13 JP JP56125890A patent/JPS5783280A/ja active Granted
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS5783280A (en) | 1982-05-25 |
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