JPS6137581B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、生物学的粒子が免疫学的または非免
疫学的な特異性をもつて相互作用を示すという現
象の利用による生物学的粒子の検出に関するもの
である。

蛋白質の免疫学的検出において使用すべき診断
装置の構造は、1973年７月30日に提出されたジア
エヴアー（Giaever）の米国特許出願第384113号
（特開昭50−76226）および米国特許第3926564号
明細書中に明記されている。いずれの構造におい
ても、外面は問題の蛋白質と特異的に反応する所
定の蛋白質層から成る。米国特許出願第384113号
の場合、所定の蛋白質層が付着する基体表面は金
属から成ることが好ましい。また、米国特許第
3926564号の場合、所定の蛋白質層が付着する基
体表面は主として金属酸化物から成り、しかもか
かる金属酸化物は微細な金属粒子を含有し得る。
上記の米国特許出願および米国特許は本発明の場
合と同じ受託者に委託されていて、いずれも引用
によつて本発明書の一部を成すものとする。

所定の蛋白質層は一分子層を成して基体表面に
吸着する。ある溶液中に問題の蛋白質が存在する
かどうかを試験する場合には、もし問題の蛋白質
が存在するならば特異的な反応が起るのに十分と
考えられる時間にわたつて蛋白質の一分子層を溶
液と接触させればよい。特異的な反応が起る場合
には、最初の蛋白質層と問題の蛋白質との複合の
結果として蛋白質の二分子層が生じる。

なお、問題の蛋白質以外の蛋白質は初期の蛋白
質層に付着しない。その後、一分子層と対比させ
ながら二分子層の存在を検出すればよい。

主に本発明の背景を成すものとして関連を有す
る文献を挙げれば、「溶液から吸着させた薄膜の
厚さの光学的測定」と題するアーヴイング・ラン
グミユア（Irving Langmuir）等の輪文〔ジヤー
ナル・オブ・ジ・アメリカン・ケミカル・ソサエ
テイ（Journal of the American Chemical
Society）、第59巻、1406頁、1937年７〜12月〕、
「液体−固体表面において行われる免疫反応」と
題するエー・ローテン（A.Rothen）等の論文
〔ヘルヴエテイカ・キミカ・アクタ（Helvetica
Chimica Acta）、第54巻、第４分冊第123号、
1208〜1217頁、1971年〕、「自記式楕円偏光計によ
る血液凝固の研究」と題するエル・ヴロマン（L.
Vroman）の著書〔米国標準局論文集256、1964
年〕「抗原および抗体分子の薄膜間の免疫反応」
と題するエー・ローテン（A.Rothen）の論文
〔ジヤーナル・オブ・バイオロジカル・ケミスト
リー（Journal of Biological Chemistry）、第168
頁、75〜97頁、1947年４〜５月〕、「液体−固体界
面における特異的な血漿蛋白質の迅速な交換を暗
示する自己式楕円偏光計による所見」と題するエ
ル・ヴロマン等の論文〔サーフイス・エイエンス
（Surface Science）、第16巻、438〜446頁、1969
年〕、「固体−液体界面において行われる免疫反応
および酵素反応」と題するアレクサンドル・ロー
テン（Alexandre Rothen）の論文〔フイジオロ
ジカル・ケミストリー・アンド・フイジツクス
（Physiological Chemistry and Physics、第５
巻、243〜258頁、1973年〕、「界面における人間の
血液蛋白質間の相互反応」と題するレオ・ヴロマ
ン（Leo Vroman）等の論文〔フエデレーシヨ
ン・プロシーデイングス（Federation
Proceedings）、第30巻、第５号、1971年９〜10
月〕、「抗原抗体反応−肉眼による観測」と題する
アイヴアー・ジアエヴアー（Ivar Giaever）の論
文〔ザ・ジヤーナル・オブ・イミユノロジー
（The Journal of Immunology）、第110巻、第４
号、1424〜1426頁、1973年５月〕、「血液凝固に対
する疎水性表面の効果」と題するエル・ヴロマン
〔トロンボーシス・エト・デイアテーシス・ヘモ
ラジカ（Thrombosis et Diathesis
Haemorrhagica）、第10巻、455〜493頁、1964
年〕および「平らな表面上の抗原−抗体複合体を
検出するための３つの簡単な方法」と題するエ
ー・エル・アダムズ（A.L.Adams）等の論文
〔ジヤーナル・オブ・イミユノロジカル・メソツ
ズ（Journal of Immunological Methods）、第３
巻、227〜232頁、1973年〕がある。

「生物学的粒子」という術語は、動物に注射し
た場合に抗体産生を引起すことができかつ（ある
いは）免疫学的または非免疫学的な特異性をもつ
て相互作用を示すという性質を有する小さな蛋白
質（たとえば血漿蛋白質、抗原、抗体、レクチン
など）および蛋白質性の物体（たとえばウイル
ス、細菌、細胞など）を包括するものとする。

さて、本発明に基づく診断装置は不透明な金属
表面（固体の金属材料または別種の基材上におけ
る不透明な金属被膜）から成つている。かかる金
属表面は薄くて透明な誘電体層で被覆され、しか
もその外部表面上には第２の透明な（好ましくは
小球状または小島状の）金属層が付着している。
使用者に供給される状態の診断装置では、通例、
第２の金属層の表面上に生物学的粒子の一分子層
が設置されている。その結果、選ばれた不透明の
金属表面が割合に光を反射しないものでありかつ
その上に透明な層を形成する誘導体の光反射能に
少なくとも近似的には合致している場合に得られ
る光の干渉を利用すれば、診断用途に際して装置
上に形成された多分子層と一分子層とを肉眼で判
別することができる。

保護を受けたいと望む本発明の主題は特許請求
の範囲として前記に示された通りである。以下の
説明は本発明の製造方法および使用方法を示すも
のであり、また本発明の一実施例を模型的に図示
する添付の図面もかかる説明の一部を成してい
る。

先ず図面を参照すれば、固体の金属板または別
種の基材上に設置された不透明な金属被膜から成
る基体１０の表面１１に透明な誘電体層１２が直
接に結合している。別種の基材上に設置された金
属被膜を使用する場合、基材はガラス、別種の金
属、プラスチツクなどであり得る。

透明な誘電体層１２の外面には第２の透明な金
属層が直接に付着している。好ましくは、かかる
第２の金属層は誘電体層１２に付着した小球１３
から成つている。顕微鏡的な尺度で見れば第２の
金属層が不連続層を成すという性質は図面に示さ
れている。なお用途によつては、かかる第２の金
属層が透明な連続被膜から成つていてもよい。次
に、第２の金属層の全部または一部の領域上に生
物学的粒子１４の一分子層が設置されている。

金属はその特徴として可視光をよく反射する
が、表面１１の金属は光を割合に反射しないもの
でなければならない。また、この金属は陽極処理
や酸化を容易に受け得るものであることが好まし
い。かかる金属の実例としては、チタン、ニオ
ブ、バナジウム、ビスマス、ジルコニウムおよび
タンタルが挙げられる。アルミニウムや銀のよう
な金属は光をよく反射し過ぎるため、不透明な金
属表面１１を与えるものとして使用することはで
きない。

誘電体層１２は不透明な金属表面の酸化物とし
て形成することが特に便利であるけれど、不透明
な金属表面に付着した全く別種の材料（たとえば
重合体や共重合体）で形成することも可能であ
る。光重合によつて各種の金属性および非金属性
基体上に重合体および共重合体被膜を設置する方
法はライト（Wright）の米国特許第3522076およ
び3635750号明細書中に記載されている。なお、
これらの両特許は引用によつて本明細書の一部を
成すものとする。

その他の材料を誘電体層１２として設置するこ
とも可能であつた、たとえばフツ化マグネシウム
を誘電体層１２として蒸着してもよい。

別種の基材上に設置された金属被膜たとえばポ
リスチレンのごときプラスチツク基材上に設置さ
れたチタン被膜を使用する場合、かかる金属被膜
は可視光に対して不透明となる程度に厚くなけれ
ばならないが、通例経験されるような温度変化に
際して基材への密着性が失われた危険性が生じる
ほどに厚くてもならない。かかる構造の場合にお
けるチタン被膜の適当な厚さは約2000オングスト
ローム（Å）であることが判明した。

第２の透明な金属層が小球状を成して誘電体層
１２上に付着しているような構造の場合、誘電体
層の厚さと金属小球の直径との間には一定の関係
がなければならない。すなわち、誘導体層１２の
厚さは約５〜約500Åの範囲内にあることを要す
る。それに対し、金属小球の直径は（誘電体層の
最小厚さに対応する）約5000Åから（誘電体層の
最大厚さに対応する）約200Åにまでわたるとい
う関係にある。不透明な金属表面としてチタン被
膜が使用される系では、誘電体層は酸化チタンか
ら成り、かつ第２の金属層は小球状または小島状
に沈着させたインジウムから成る。その場合、酸
化チタン層の厚さは約200Åでありかつインジウ
ム小球の平均直径は約1000Åであることが好まし
い。

不透明な金属表面は、特に別種の基材の表面上
に金属被膜が沈着しているような構造の場合、単
一の金属から成つていなくてもよい。

とりわけ、チタンとビスマスとを一緒に沈着さ
せると、単独のチタンよりも陽極処理が容易であ
るため特に有利であることが判明した。かかる構
造の実例を挙げれば、チタンおよびビスマスの同
時蒸着によつて混成金属被膜が顕微鏡用のスライ
ド上に設置された。設置後、被覆スライドが
0.05N水酸化ナトリウム溶液中において８ボルト
の電圧下で陽極処理された。こうして陽極処理さ
れた金属表面が直径500Å程度の極めて小さなイ
ンジウム粒子で被覆された。なお、金属被膜の設
置に先立つてスライドガラス基材を砂吹きによつ
て多少粗くすれば、優れた読取り特性が得られる
ことも判明した。

第２の金属層用として好適な金属は、下方の誘
電体層の表面を濡らさずかつその表面上において
大きな可動性を有するようなものである。このよ
うな材料特性は小球状の沈着を助けるわけであ
る。かかる沈着は金属の真空蒸着によつて達成さ
れるのが普通である。第２の金属層用として好適
な金属の実例としては、インジウム、金、銀、ス
ズおよび鉛が挙げられる。なお、本発明に関連し
て留意すべきことであるが、スズ（第２の金属層
およびビスマス（不透明な金属表面）は純枠な物
質として塩溶液に長時間暴露された場合には不安
定である。とは言え、かかる暴露を必要としない
ような本発明の診断装置の用途も数多く存在す
る。

本明細書中に記載されたような不透明な金属表
面、誘電体層および第２の金属層の組合せに可視
光が入射すれば、極めて鮮明な干渉色が生じる。
複雑な物理学が関係するため、この現象はまだ十
分には説明されていない。第１近似として述べれ
ば、誘電体層と第２の金属層との組合せは大きい
屈折率を持つた１つの誘電体層として作用するも
のと考えられる。かかる組合せの外面に蛋白質の
薄層が吸着すれば、それは干渉色を変えるから目
に見えることになる。第２の金属層は透明でなけ
ればならず、好ましくは入射光の約60〜約70％を
通過させる。第２の金属層が不連続層を成すこと
は好適な特徴の１つである。最良の結果を得るた
めには、金属小球からの反射が下方の金属表面か
らの反射と合致するようにすべきである。すなわ
ち、強い干渉色を得るためには、表面１１から反
射されるのと同量の光が小球から反射されるよう
にすべきである。

本発明に従つて製造された診断装置は、米国特
許第3904367号明細書中に記載された増幅技術に
基づいて使用された場合にとりわけ大きな価値を
有する。なお、この特許明細書中に記載された方
法すなわち免疫学的な薄膜検出の感度を増大させ
る方法は引用によつて本明細書の一部を成すもの
とする。

複数の特異的な免疫反応を相次いで行わせると
いう上記の増幅技術は、本発明の診断装置を用い
て実施した場合にとりわけ有効である。本明細書
中に記載のごとき構造に関しては、複数の抗原−
抗体薄膜を相次いで形成させた場合、最初に設置
された蛋白質の一分子層と多分子層との間のコン
トラストは少なくとも第４段階の反応を通じて増
大することになる。本発明の診断装置の増幅能力
は以下の実施例において示される。これらの２つ
の実施例の場合、（蛋白質の一分子層を設置する
前における）成層構造物は次のようなものであつ
た。すなわち、先ず顕微鏡用のスライドが約2000
Åのチタンで被覆された。かかる被膜が0.05N
NaOH中において８ボルトの電圧下で陽極処理さ
れ、次いで平均直径約400Åのインジウム粒子の
蒸着によつて被覆された。

実施例 １ 上記の成層構造物の表面領域の小部分にホフマ
ン−ラロツシユ・インコーポレーシヨン
（Hoffmann−LaRoche、Inc.）製のガン−胎児性
抗原（CEA）の一分子層を設置することによつ
て診断装置が完成された。洗浄により余分の
CEAを除去してから乾燥した後、CEAに対する
抗体を含有するヤギ血清にCEAの一分子層が暴
露され、そして16時間にわたり保温された。次
に、洗浄することなく、ヤギ抗体に対する抗体を
約20μｇ/mlの濃度で含有するウサギ血清にスラ
イドが暴露された。約15分の暴露時間後、洗浄す
ることなく、ウサギ抗体に対する抗体を200μｇ/
mlの濃度で含有するヤギ血清にスライドが約15分
にわたつて暴露された。その後、スライドの洗
浄、乾燥および検査が行われた。（CEAに対する
抗体を含有する）ヤギ血清に最初に暴露された
CEAの一分子層の領域上に形成された蛋白質の
多分子層の存在は、上記のヤギ血清が１：
30000000に希釈された場合でも、肉眼によつて明
確に判別できた。このことは0.1nｇ（ナノグラ
ム）／ml未満の濃度の抗体を検出し得る能力を表
わしている。

実施例 ２ 上記の成層構造物の表面領域の小部分にウシ血
清アルブミン（BSA）の一分子層が設置され、
洗浄され、そして乾燥された。次に、マイルズ・
ラボラトリー（Miles Laboratory）製のウサギ
抗BSA血清にBSAの一分子層が暴露され、それ
から約４時間にわたつて保温された。次に、こう
して暴露された領域を含むBSAの一分子層が検
出すべき抗体に対する抗体を約20μｇ/mlの濃度
で含有するヤギ血清に暴露された。15分後、ヤギ
抗体に対する抗体を200μｇ/mlの濃度で含有する
ウサギ血清にスライドが暴露された。約15分後、
スライドの洗浄、乾燥および検査が行われた。か
かる一連の暴露の結果、ウサギ血清に最初に暴露
されたBSAの一分子層の領域上には更に３つの
一分子層が形成されたことになる。かかる多分子
層の存在は、最初のウサギ血清が１：2000000に
希釈された場合でも、肉眼によつて容易に判別で
きた。この場合、最初のウサギ血清中おける抗体
濃度は１nｇ/mlに相当していた。

本発明において意図される最良の方式に従え
ば、プラスチツク基材（たとえばポリスチレン）
が使用され、そしてその上にチタンおよびビスマ
スの同時蒸着による厚さ約2000Åの不透明な金属
被膜が設置される。誘電体層はかかるチタン−ビ
スマス被膜の陽極処理によつて形成される。

次いで、インジウムが直径約500Åの小球とし
て蒸着される。その後、インジウム小径上に生物
学的粒子の一分子層を設置すればよい。

【図面の簡単な説明】

図面は本発明の一実施例を成す診断装置を構成
する基体の一部およびその表面上に設置された複
数の層の立断面図である。 図中、１０は基体、１１は金属表面、１２は誘
電体層、１３は第２の金属層を成す小球、そして
１４は一分子層を成す生物学的粒子を表わす。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 少なくとも１つの表面が不透明な金属表面で
   あるような基体部材および特定の生物学的粒子に
   対し免疫学的な特異性をもつた生物学的粒子の一
   分子層から成る、液体試料中の特定の生物学的粒
   子の有無を検出する装置において、前記金属表面
   上に薄くて透明な誘電体材料の第１の層を有しそ
   して、前記誘電体材料の層の外面上に第２の透明
   な金属層を有し、この第２の透明な金属層の少な
   くとも一部の領域上に前記一分子層を吸着させた
   ことを特徴とする装置。 ２ 前記基体部材が非金属性の基材上における金
   属被膜から成る、特許請求の範囲第１項記載の装
   置。 ３ 前記基材がプラスチツクまたはガラスであ
   る、特許請求の範囲第２項記載の装置。 ４ 前記不透明な金属表面用の金属がチタン、ニ
   オブ、バナジウム、ビスマス、ジルコニウム、タ
   ンタルまたはそれらの混合物である、特許請求の
   範囲第１〜３項のいずれか１項に記載の装置。 ５ 前記不透明な金属表面用の金属がチタンおよ
   びビスマスである、特許請求の範囲第４項記載の
   装置。 ６ 前記不透明な金属表面用の金属の光反射能が
   前記誘導体の光反射能にほぼ合致している、特許
   請求の範囲第１〜５項のいずれか１項に記載の装
   置。 ７ 前記誘電体が前記不透明な金属表面から誘導
   された金属酸化物またはその場で重合させた重合
   体である、特許請求の範囲第１〜６項のいずれか
   １項に記載の装置。 ８ 前記第２の金属層が小球状の不連続層である
   特許請求の範囲第１〜７項のいずれか１項に記載
   の装置。 ９ 前記第２の金属層がインジウムから成る、特
   許請求の範囲第８項記載の装置。 １０ 前記誘電体層の厚さが約200オングストロ
   ームであり、かつ前記第２の金属層の小球の直径
   が約1000オングストロームである、特許請求の範
   囲第８または９項記載の装置。 １１ 前記第２の金属層が入射光の約60〜約70％
   を透過する、特許請求の範囲第８〜１０項のいず
   れか１項に記載の装置。 １２ 前記第２の金属層が連続層である、特許請
   求の範囲第１〜７項のいずれか１項に記載の装
   置。