JPS6137915B2 - - Google Patents
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- JPS6137915B2 JPS6137915B2 JP52047409A JP4740977A JPS6137915B2 JP S6137915 B2 JPS6137915 B2 JP S6137915B2 JP 52047409 A JP52047409 A JP 52047409A JP 4740977 A JP4740977 A JP 4740977A JP S6137915 B2 JPS6137915 B2 JP S6137915B2
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- dna
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
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Description
【発明の詳細な説明】
本発明は新種のバクテリオフアージおよびその
作成法に関する。 遺伝子操作の分野は、一方ではプラスミド
（plasmid）、バクテリオフアージ
（bacteriophage）などのレプリコン（repliocn）
の遺伝学的、化学的性質の研究が急速に進展した
ことと、他方でDNA（デオキシリボ核酸）関係
の酵素、特にDNA上のヌクレオチド配列を認識
して特異的な切断を起こすエンドヌクレアーゼ
（制限酵素）とDNAリガーゼの研究の進歩がちよ
うどタイミングよく結びついた結果可能になつた
新領域である。 遺伝子操作の研究はこれまでの科学的方法をも
つてしまつては到達できなかつた新しく深い領域
に生物学を導くものと思われ、何よりも遺伝子系
が自然に起こる組み換え現象への依存から解放さ
れることであり、又この問題について“好ましい
形質”をもつ微生物を作り、発酵工業的経験など
を活用し、やがてより高等な系の遺伝子操作によ
つて人類社会に役だたせようとするものである。 従来、種々の遺伝子の組み替え方法が提案さ
れ、その例としては、たとえばλ（ラムダ）フア
ージDNAにシヨウジヨウバエのDNA断片を組み
換える方法は知られているが、組み換えられる場
所がフアージの溶原化に必要な遺伝情報を持つ部
分であるので、出来た混成DNAは宿主DNAに組
込ませることが出来ない。そのため、実際の使用
に際しては、たえず宿主細胞と該フアージを用意
しておかねばならないが、該フアージの保存等に
問題があり、またプラスミドに特定の酵素蛋白の
遺伝情報を組込んで宿主に感染させた場合には、
特定の酵素が常に生産される状態にあり、保存時
においても酵素を作り続けるように働くため、宿
主の代謝は著しく撹乱され、これを補償する二次
的な変異がいろいろと誘起される。たとえば、感
染したプラスミドに変異を生じてプラスミドのコ
ピー数を減じるように変わつたものや、酵素の機
能や合成能を低下させるような変異を獲得したも
のや、あるいは他の代謝系を変えてひずみを補正
するような変異体が出現し、実際にはこの二次的
に起こる変異に左右されることが多く、遺伝子の
組み替え操作はまだ充分でない。 そこで本発明者らは、上記諸欠点を解消するた
め、バクテリオフアージを用いて種々検討を行つ
た。 一般にフアージ粒子は蛋白質と核酸（DNAあ
るいはRNA）とから構成されており、核酸の囲
りを蛋白質（コート蛋白質と呼ばれている）が包
むような構造をとつている。核酸には、バクテリ
オフアージが宿主に感染し、その細胞内で増殖す
るのに必要な全ての遺伝情報が記憶されている。
例えばバクテリオフアージλ（ラムダ）の場合に
は、DNA鎖の一方の半分にはフアージDNAの自
己複製に必要とされる遺伝情報が記憶されてお
り、もう一方の半分にコート蛋白質の合成に関与
する遺伝情報が記憶されている（A.D.Hershey編
Cold Spring Harbor Lab.発行「The
Bacteriophage Lambda」45頁、1971年）。そこ
でもしフアージDNAのこのコート蛋白質の合成
に関与する遺伝情報の部分の代りに他の遺伝情
報、例えば有用酵素の合成に関する遺伝情報を有
するDNA部分をエンドヌクレアーゼとDNAリガ
ーゼを利用し入れ替えるならば、フアージ感染宿
主細胞内でコート蛋白質の代りに大量の有用酵素
を合成させることが可能と考えられる。 しかし、一般にフアージは自己複製に関与する
DNA部分にもエンドヌクレアーゼ感受性を有し
ているため、エンドヌクリアーゼによりその
DNA部分が開裂されて自己増殖が不可能にな
る。 そこで本発明者等は、自己複製に関与する
DNA部分に損傷を与えずしてその部分のエンド
ヌクレアーゼ感受性を消去し、そしてコート蛋白
質の合成（製造）に関与するDNA部分にのみ
「エンドヌクレアーゼ感受性」をもたせる方法を
鋭意研究した結果、エンドヌクレアーゼによる開
裂部位が全く存在しないフアージとそれと同種又
は類縁でしかも目的とするDNA部分又は類似の
部分に開裂部位をもつフアージとの雑種をつくる
ことにより、目的とするDNA領域にのみエンド
ヌクレアーゼ感受性を残し、遺伝子操作における
遺伝子のクローン化に際し、自己複製可能な混成
DNA分子の作成を効率よく、容易に可能ならし
めることの新知見を得、この知見に基いて本発明
を完成したのである。 すなわち、本発明はフアージDNAのコート蛋
白質製造の遺伝情報の部分のみをエンドヌクレア
ーゼ感受性としたテンペレートフアージであるバ
クテリオフアージであり、また本発明はλ（ラム
ダ）系フアージに属するバクテリオフアージをエ
ンドヌクレアーゼ抵抗性としたのち、コート蛋白
質製造の遺伝情報部分にエンドヌクレアーゼ感受
性を有するλ（ラムダ）系フアージと掛合わせて
フアージDNAのコート蛋白質製造の遺伝情報の
部分のみをエンドヌクレアーゼ感受性としたテン
ペレートフアージを得ることを特徴とする新種バ
クテリオフアージの作成法であり、その目的とす
るところはバクテリオフアージDNAのコート蛋
白質製造の遺伝情報の部分のみをエンドヌクレア
ーゼ感受性とし、その部分の遺伝情報を他の目的
とする遺伝情報に置き換え、自己複製可能な混成
DNA成分に作成することを可能ならしめる有用
な新種のバクテリオフアージを提供することにあ
る。 以下本発明について具体的に説明する。 一般にバクテリオフアージは多かれ少なかれ宿
主の機能に依存し増殖殖しているわけであるが、
宿主の染色体外に独立して増殖できるレプリコン
であり、自律的状態にあるが、本発明に使用され
るバクテリオフアージとしては宿主細胞に感染し
た場合、宿主細胞のDNAにフアージDNAが組込
まれる性質（溶原性）を有するテンペレートフア
ージ（Temperate phage）が用いられる。この
テンペレートフアージとしてはλ系
（lambdoid）が好ましく、λ系フアージとしては
λ（ラムダ）（IFO 20016）、434（IFO 20018）、
82（（IFO 20019）、φ80（IFO 20020）、φ170
（IFO 20021）などが挙げられ、また宿主DNAに
組込まれたこれらフアージDNA、たとえば大腸
菌（E.coli）W3110に溶原化されたφ80〔大腸菌
（E.coli）K12ストレイン（strain）W3110（φ
80）（ATCC 31277）〕、大腸菌（E.coli）W3350
に溶原化されたλcI857〔大腸菌（E.coli）K12ス
トレイン（strain）W3350（λcI 857）（ATCC
31278）〕なども用いられる。 次に本発明に用いられるエンドヌクレアーゼ抵
抗性のフアージの作成であるが、まずエンドヌク
レアーゼとしては、DNA鎖の特定の部位を認識
することができ、その認識部位のDNA二重らせ
んを千鳥足状の付着端（cohesive ends）を生じ
させるように切断を行なう特異性の極めて高いエ
ンドヌクレアーゼが好ましく、この酵素としては
制限酵素が好適であり、具体的にはEcoRI、Bam
Ｉ、HindIII等が挙げられる。なお制限酵素は生
化学工業又はベーリンガー・マンハイム・山乃内
より入手できる。 エンドヌクレアーゼ抵抗性のフアージ、たとえ
ば制限酵素に全く開裂されない変異株フアージ
は、たとえば次のようにして得ることができる。
λ系フアージを制限酵素をもつている宿主ともた
ない宿主に交互に培養すると、制限酵素の作用を
受けるフアージは死滅し、制限酵素の作用を受け
にくい変異株が次第に増加する。このような微生
物的濃縮法によりついには制限酵素の作用を全く
受けない（制限酵素によりDNA鎖が全く開裂さ
れない）DNAをもつフアージ（制限酵素抵抗性
フアージ）を得ることができる。 また制限酵素の切断部位を部分的に欠失させた
後、微生物的濃縮法を用いることにより、より早
く抵抗性フアージを得ることができる。例えば
DNA上の制限酵素の切断部位を部分的に消去す
る方法としてはフアージの切断部位を含むDNA
部分を欠失させた欠失変異株を分離することであ
る。即ちフアージの生存に不必要なDNA部分に
制限酵素の切断部位が存在する場合、そのDNA
部分が欠失した変異株を分離することにより、そ
のフアージの制限酵素に対する抵抗性を増加させ
ることが出来る。欠失変異株は、切断部位を含む
DNA部分が欠失しているため比重が軽く又熱安
定性がよいので、この性質を利用して通常のフア
ージ培養液から分離できる。たとえば培養液に
CsCl（塩化セシウム）を添加して遠心分離する
CsCl密度こう配遠心法又はフアージ培養液を60
℃位に加熱した生き残つたフアージを分離するこ
とにより欠失変異株を得ることができる。この変
異株を使用して制限酵素をもつている宿主ともた
ない宿主に交互に培養する微生物的濃縮法により
制限酵素の作用を全く受けないDNAをもつフア
ージをより早く得ることができる。 次にこのようにして得た制限酵素による開裂部
位の全く存在しないフアージDNAに、目的とす
る部位に制限酵素による開裂部位を入れるため
に、λ系フアージの内、コート蛋白質製造の遺伝
情報部分にエンドヌクレアーゼ感受性を有するフ
アージを用い掛合せを行なう。掛合せの方法とし
ては制限酵素抵抗性のフアージ液（109〜1010／
ml）と感受性のフアージ液（109／1010／ml）と
を混合し、両者に感受性のある大腸菌（108〜
109／ml）に２種のフアージを同時に又は相前後
して感染させる。あるいはK12株に含まれる大腸
菌に溶原化されたエンドヌクレアーゼ抵抗性又は
感受性のフアージを誘発した後に別のエンドヌク
レアーゼ感受性又は抵抗性のフアージを感染させ
ることによつても可能である。その後上記のよう
にフアージを感染させた大腸菌を培地（培地とし
ては大腸菌の生長可能な培地であれば特に制限さ
れない）、たとえばトリプトン培地に入れ、37℃
で１〜２時間振盪培養する。 なお感受性の大腸菌としては、一般的なK12株
に含まれる大腸菌ならばいずれでもよく、たとえ
ばW3110（ATCC 27325）、W3350（ATCC
27020）、1100（Max−Plank−Institut西独）等が
挙げられる。また大腸菌は培養液の状態で用いて
もよいが、培養液を遠心分離して培養液を除去し
た後、10ｍＭのMgCl2に懸濁し、37℃で１時間振
盪した後使用した方がフアージの吸着感染が良く
なる。 このようにしてフアージDNAのコート蛋白質
製造の遺伝情報の部分のみにエンドヌクレアーゼ
感受性を有するフアージを105／ml程度得ること
が出来る。 得られたフアージから目的とするフアージを分
離するには次の方法による。 たとえば、λ系フアージの内の任意のものをＡ
フアージおよびＢフアージとし、エンドヌクレア
ーゼ抵抗性のＡフアージとコート蛋白質製造の遺
伝情報部分にエンドヌクレアーゼ感受性を有する
Ｂフアージを掛合せ、フアージDNAのコート蛋
白質製造の遺伝情報部分が感受性Ｂのフアージの
部分であり、自己複製に関与する遺伝情報部分が
抵抗性Ａフアージの部分の新種フアージを得れ
ば、ＡレジスタントＢ免疫性の大腸菌において、
新種フアージのみが増殖することが出来、他のフ
アージは生育することが出来ず、この方法により
新種フアージを分離することが出来る。 このＡレジストＢ免疫性の大腸菌を得るには次
の方法による。 まずＡフアージ、好ましくは溶原化の起らない
条件でＡフアージを大腸菌に感染させる。たとえ
ば大腸菌１に対して溶原性を失つたＡフアージの
変異株100程度を混合し、生残つた大腸菌はＡフ
アージにレジスタントな大腸菌である。一般にテ
ンペレートフアージはある確率で大腸菌に溶原化
されるため、にごつたプラーク（溶菌斑）を作る
が、溶原性を失つた変異株は透明なプラークを作
るため、この透明なプラークからフアージを採取
すれば、溶原性を失つたフアージを得ることがで
き、該フアージを用いると、Ａフアージレジスタ
ントな大腸菌を得るための選別操作が簡単で好ま
しい。 即ちこの大腸菌は使用したＡフアージに抵抗性
を有し、Ａフアージを吸着しない性質を有するも
のである。吸着の特異性はフアージの尾部に存在
する蛋白質によつて支配されている。このフアー
ジの吸着に関する遺伝情報がコート蛋白質製造の
遺伝情報DNA部分に含まれているので、Ａフア
ージコート蛋白質製造の遺伝情報を有するフアー
ジはＡフアージにレジスタントな大腸菌には吸着
出来ず、大腸菌中には進入出来ない。宿主大腸菌
がフアージ抵抗性変異をもつているかは次の方法
で確認することが出来る。例えばλフアージにレ
ジスタントな大腸菌はマルトースを資化すること
ができないので、マルトースと指示薬（メチレン
ブルー及びエオシンイエロー）を含む培地に培養
した場合、菌体が赤く染色されないことで確認さ
れる。 次にＡレジスタント宿主に対してＢ免疫性を付
与する。即ち免疫性を支配している遺伝情報が自
己複製に関与するDNA部分に存在する、たとえ
ばＢフアージをＡレジスタント宿主細胞に感染さ
せ宿主DNAにＢフアージDNAが組込まれた宿主
細胞を作成する。この宿主細胞に組込まれたＢフ
アージDNAと同じ免疫性を有するフアージが宿
主細胞内に進入してもそのフアージは宿主細胞内
では増殖出来ない。ＢフアージDNAが宿主DNA
に組込まれたかどうかは、宿主大腸菌に紫外線を
照射する等、フアージを誘発した後に宿主菌を振
盪培養し、Ｂフアージが遊離してくれば宿主細胞
DNAにＢフアージが組込まれていたことにな
る。 このようにしてフアージDNAのコート蛋白質
製造の遺伝情報部分のみにエンドヌクレアーゼ感
受性を有するテンペレートフアージであるバクテ
リオフアージDNAは該エンドヌクレアーゼによ
りその部分のみが開裂し目的とする遺伝情報をコ
ート蛋白質製造のための情報と置換えることを効
率よく容易に可能ならしめる。 この新種フアージのDNAのコート蛋白質製造
の遺伝情報の部分に目的とするDNA断片を組み
換え、得られた混成DNAを宿主に感染させて宿
主のDNAに組込ませた後保存し、必要に応じて
誘発させることにより遺伝情報を『増幅』し、そ
の宿主細胞をたとえばトリプトン培地に培養する
ことにより増幅された情報に基づいて特定の蛋白
質を大量に生産せしめることが出来、産業的有益
性は多大なものがある。 次に本発明の実施例を示すが、本発明はこれに
よつて制限されるものではない。 実施例 大腸菌制限酵素EcoRIによりコート蛋白質製造
に関する遺伝情報をもつDNA部分のみが切断
される新種フアージλcI857RIrh80の作成 １ フアージλcI857から欠失変異株フアージλ
cI857b6042の分離。 １−１ 大腸菌（E.coli）K12ストレイン
（strain）W3350（λcI 857）〔微工研菌寄第
8603号（FERM Ｐ−8603）、ATCC 31278〕
を１白金耳トリプトン培地３mlに接種し、30
℃で16時間振盪前培養する。得られた前培養
液３mlを30mlのトリプトン培地に入れ、30℃
で３時間振盪培養後、43℃で20分間振盪し、
λcI857を誘発する。その後、更に30℃で３
−６時間培養を続け、溶菌現象が起り、培養
液が透明に近くなつたところで培養をやめ、
培養液を遠心分離して細胞破片を除去し、そ
の上澄液をフアージλcI857液とした。この
時のフアージ数は約1011／mlであつた。 １−２ 該フアージλcI857液0.1mlを0.02Mエチ
レンジアミンテトラ酢酸（EDTA）を含むト
リス緩衝液（PH8.2）５mlに懸濁し、40℃に
10分間保つた後に、0.01M MgCl2を含む
0.01Mトリス緩衝液（PH7.2、トリス−Mg緩
衝液と略す）で107／mlになる様に稀釈し、
その0.1mlとトリプトン培地で37℃で16時間
静置培養した大腸菌W3110（ATCC 27325）
培養液0.25mlとを46℃に加温したB1−ソフト
アガー３mlと共にトリプトン寒天平板培地に
撤き、37℃で４〜５時間培養した。平板上の
フアージは４mlのトリス−Mg緩衝液で洗い
出しゴム栓付の殺菌した小試験管に保存し
た。続いてこのフアージ液の一部を用いて上
と全く同様の操作を５回繰返した。 １−３ 更に上記１−２で得られたフアージを、
１−２の40℃に10分間処理の代りに60℃に10
分間処理する以外は１−２と全く同様の方法
で４回繰返し、得られたフアージ液を103／
mlに稀釈し、その0.1mlを上記大腸菌W3110
の培養液0.25mlに混合し、トリプトン寒天平
板培地に撒き、37℃で一晩培養した後に100
個前後の溶菌斑が見られる平板からその１つ
の溶菌斑中のフアージを竹串でとりトリス−
Mg緩衝液に懸濁し、フアージλcI857b6042
株を得た。 この欠失変異株は親株λcI857の比重1.493
よりもやや軽い比重1.465を示し、その比重
から計算によりDNAの約23％が欠失してい
ることがわかつた。又、親株のフアージλ
cI857DNAは制限酵素EcoRI（生化学工業K.
K.より入手）により５ケ所で切断される
が、フアージλcI857b6042株では、大腸菌
W3110並びにW3110（RI）を用いてその生菌
数を測定し、計算式により算出したところ、
EcoRIによる切断部位が３ケ所になつたこと
が確認された。 なお大腸菌W3110（RI）は次の様にして
分離した。薬剤耐性因子RI（ペニシリン、
ストレプトマイシン、テトラサイクリン、サ
ルフア剤に耐性）をもつ大腸菌（E.coli）
RY−13（カリフオルニア大学、H.W.Boyer
より入手）〔微工研菌寄第8606号（FERMP
−8606）〕と大腸菌W3110（ATCC 27325）
を混合培養し、薬剤耐性因子をもつ大腸菌
W3110（RI）を分離した。 ２ フアージλcI857b6042株より制限酵素EcoRI
の作用を全く受けないフアージλ
cI857b6042RIr株の分離 ２−１ １−２の方法で培養した大腸菌W3110株
の16時間静置培養液0.25mlとフアージλ
cI857b6042液0.1mlとを46℃に加温したB1−
ソフトアガー３ml中で混合し、トリプトン寒
天平板培地上に撒き、37℃で４〜4.5時間培
養した後に、トリス−Mg緩衝液４mlとクロ
ロホルム３滴を加えて37℃に15分間放置し、
次いで上澄をピペツトでゴム栓付の小試験管
に移した。この時のフアージ数は６×1010／
mlであつた。 ２−２ ２−１で得られたフアージ粒子の数を制
限酵素EcoRIをもつ大腸菌W3110（RI）株を
用いて測定する（大腸菌W3110（RI）株は
制限酵素によりその細胞内に浸入したフアー
ジDNAを切断し不活性化する。その為に大
腸菌W3110（RI）株を用いて測定したフア
ージ数は制限酵素をもつていない大腸菌
W3110株を用いて測定した数に比べて遥かに
低く1/600の108／mlを示した）。 １−２の方法で培養した大腸菌W3110
（RI）の培養液0.25mlと、２−１で得られた
フアージをW3110（RI）で測定した場合に
107／mlになる様に稀釈し、その0.1mlを用い
て２−１と同く同様の操作を行いフアージ液
を得た。 ２−３ ２−２で得られたフアージは今度は２−
１の方法で処理した。この様に２−１と２−
２を交互に10回繰り返し最後に２−１の方法
で処理した標品のフアージ数を大腸菌W3110
（RI）で測定したところ、大腸菌W3110で測
定した数と変らない値を示した。つまり、得
られたフアージ標品はEcoRIの作用を全く受
けない変異株から成つていることが示され
た。このフアージ液を103／mlに稀釈し、そ
の0.1mlを大腸菌W3110培養液の0.25mlに混
合し、トリプトン寒天平板上で互に重ならな
い溶菌斑をつくらせ、そこからEcoRIの作用
を全くうけないフアージλcI857b6042RIr株
を単離した。 ３ フアージλcI857b6042RIrとフアージφ80と
の雑種形 λcI857フアージDNAにはもともとコート蛋
白質製造の遺伝情報部分にEcoRIによる切断部
位が存在しない。この部分に切断部位を付与す
るためにλフアージに類似のフアージφ80と
EcoRIに抵抗性のフアージλcI857b6042RIrと
の間で次のようにして雑種を形成させ新種のフ
アージλcI857RIrh80を得た。 即ち大腸菌W3110を１mlのトリプトン培地に
１白金耳接種し、37℃で16時間振とう培養し、
その0.1mlを15mlのトリプトン培地に加え、37
℃で振盪培養し菌数が３×108／mlに達した時
に菌体を10000回転／分で10分遠心分離し、５
mlのトリス−Mg緩衝液に懸濁した。この懸濁
液を37℃で１時間振とうした後に0.2mlを試験
管にとつた。別に大腸菌W3110をトリプトン培
地で37℃で３時間振盪培養後、これにλ
cI857b6042RIrを接種し、更に４時間培養し
た。該培養液をトリス−Mg緩衝液で30倍に稀
釈してλcI857b6042RIr液を得た。つぎに大腸
菌（E.coli）K12ストレイン（strain）W3110
（φ80）（ATCC 31277）を１白金耳、トリプト
ン培地３mlに接種し、37℃で16時間振盪前培養
して得られた前培養液３mlを30mlのトリプトン
培地に入れ、37℃で３時間振盪培養後、直径15
cmのシヤーレに該振盪培養液15mlを入れ、15W
紫外線ランプを用い、50cmの距離から１〜２分
間照射し、再び37℃で４時間振盪培養した。該
培養液を30倍に稀釈してφ80液を得た。 上記λcI857b6042RIr液（3.4×109／ml）0.2ml
と、上記φ80液（3.2×109／ml）0.2mlとを、上
記した試験管にとつた0.2mlの大腸菌W3110の懸
濁液に加え、37℃で10分間放置した後に、その
0.1mlを10mlのトリプトン培地に加え、37℃で70
分間振とうした。この振盪後、クロロホルムを７
滴加えて激しく振り、その0.1mlを大腸菌W3110
（φ80）／λ（λレジスタントでφ80が溶原化さ
れている大腸菌）と混合し46℃のB1−ソフトア
ガー３mlを加えてトリプトン寒天平板培地を撒い
た。37℃に一晩放置して生じた溶菌斑の１つから
フアージを竹串でとりトリス−Mg緩衝液に懸濁
した。その後更に大腸菌W3110（φ80）／λを用
いて溶菌斑をつくらせることを２度繰り返して精
製しλcI857RIrh80の新種フアージを得た。 なお上記大腸菌W3110（φ80）／λは次のよう
にして得たものである。 大腸菌（E.coli）K12ストレイン（strain）
W3110（φ80）〔微工研菌寄第8604号（FERM Ｐ
−8604）、ATCC 31277〕の１白金耳を２mlのト
リプトン培地に接種し、37℃で16時間静置培養す
る。この培養液0.1mlとλｖフアージ液（IFO
20017）の0.1mlを混合し、37℃で30分間保つた
後、46℃に加温したB1−ソフトアガー３mlを加
え、トリプトン寒天平板培地に撒き、37℃で48時
間培養する。培養後、平板上のコロニーの１つか
ら大腸菌を白金耳で滅菌した５mlの0.9％食塩水
にとり、その0.05mlを滅菌した0.9％食塩水で
10000倍に稀釈する。この稀釈液の0.1mlをトリプ
トン寒天平板培地上に撒き、37℃で48時間培養し
た平板上に生じたコロニーの１つから大腸菌を取
りW3110（φ80）／λとして用いる。 （注） トリプトン寒天平板培地 トリプトン（Difco）１％、NaCl 0.25
％、寒天1.2％；加圧滅菌後30mlずつを
直径９cmのシヤーレに分注した。 B1−ソフトアガー トリプトン（Difco）１％、NaCl 0.25
％、MgCl25ｍＭ、ビタミンB11.5μｇ/
ml、寒天0.5％；３mlずつ小試験管に分
注し加圧滅菌した。 トリプトン培地 トリプトン（Difco）１％、NaCl 0.25
％。 上記のようにして得た新種のフアージλ
cI857RIrh80の性質は次の如くである。 宿主：φ80レジスタントな大腸菌には感染出来
ず、λレジスタントの大腸菌には感染し、フア
ージφ80の宿主域と全く同じで、フアージλの
宿主域とは異つていた。このことはフアージλ
cI857RIrh80のコート蛋白質の少くとも一部は
フアージφ80と同じであることを示している。 免疫：フアージλの免疫を示した。 EcoRIによる制限：両親株の中間の値を示した。 温度感受性：フアージλcI857RIrh80は43℃では
活性のあるフアージ粒子を生産できなかつた。
これはフアージφ80のコート蛋白質の合成が43
℃では不可能（フアージλでは可能）であるこ
とと一致している。 溶原菌よりのλcI857RIrh80の生産：大腸菌
W3110をトリプトン培地で37℃で24時間振盪培
養し、得られた培養液（４×109／ml）の0.25
mlにλcI857RIrh80の103／ml液の0.1mlを添加
混合し46℃に加温したB1−ソフトアガー３ml
を加えてトリプトン寒天培地に撒き、30℃１晩
培養し、溶菌斑中の溶原菌を白金耳で取り、別
のトリプトン寒天地に塗抹し、30℃で１晩培養
し、出現したコロニーを採取する。得られた大
腸菌はλcI857RIrh80を溶原化した大腸菌であ
る。 該λcI857RIrh80を溶原化した大腸菌W3110を
トリプトン培地に33℃で２時間振盪培養した後、
43℃で20分間加温することによりλcI857RIrh80
を「誘発」した後、再び33℃で５時間培養し、３
×1011／mlのλcI857RIrh80フアージが得られ
た。これは上記と全く同じ方法を用い、λcI857
を大腸菌W3110に溶原化した後、該大腸菌を培養
し、フアージを誘発し、更に培養した場合の約３
倍の収量であつた。 形質導入：トリプトフアン合成酵素の生合成を支
配している遺伝子を形質導入は出来るが、ガラ
クトースの資化能を支配している遺伝子を導入
できない。 以上の性質から、フアージλcI857RIrh80が
DNAの自己複製に関与する遺伝情報を含むDNA
部分はフアージλに、又コート蛋白質製造の遺伝
情報を含むDNA部分はフアージφ80に由来する
ことは明らかである。 なお、得られたλcI857RIrh80はアメリカン・
タイプ・カルチユア・コレクシヨン（American
Type Culture Collection）に寄託され、その寄
託番号はATCC 31285であり、また上記λ
cI857RIrh80を大腸菌（E.coli）1100（Max−
Plank−Institut西独、ハイデルベルクより入手）
に溶原化して得られた溶原菌、すなわち大腸菌
（E.coli）1100（λcI857RIrh80）は、工業技術院
微生物工業技術研究所に、微工研菌寄第8605号
（FERM Ｐ−8605）として寄託されている。
作成法に関する。 遺伝子操作の分野は、一方ではプラスミド
（plasmid）、バクテリオフアージ
（bacteriophage）などのレプリコン（repliocn）
の遺伝学的、化学的性質の研究が急速に進展した
ことと、他方でDNA（デオキシリボ核酸）関係
の酵素、特にDNA上のヌクレオチド配列を認識
して特異的な切断を起こすエンドヌクレアーゼ
（制限酵素）とDNAリガーゼの研究の進歩がちよ
うどタイミングよく結びついた結果可能になつた
新領域である。 遺伝子操作の研究はこれまでの科学的方法をも
つてしまつては到達できなかつた新しく深い領域
に生物学を導くものと思われ、何よりも遺伝子系
が自然に起こる組み換え現象への依存から解放さ
れることであり、又この問題について“好ましい
形質”をもつ微生物を作り、発酵工業的経験など
を活用し、やがてより高等な系の遺伝子操作によ
つて人類社会に役だたせようとするものである。 従来、種々の遺伝子の組み替え方法が提案さ
れ、その例としては、たとえばλ（ラムダ）フア
ージDNAにシヨウジヨウバエのDNA断片を組み
換える方法は知られているが、組み換えられる場
所がフアージの溶原化に必要な遺伝情報を持つ部
分であるので、出来た混成DNAは宿主DNAに組
込ませることが出来ない。そのため、実際の使用
に際しては、たえず宿主細胞と該フアージを用意
しておかねばならないが、該フアージの保存等に
問題があり、またプラスミドに特定の酵素蛋白の
遺伝情報を組込んで宿主に感染させた場合には、
特定の酵素が常に生産される状態にあり、保存時
においても酵素を作り続けるように働くため、宿
主の代謝は著しく撹乱され、これを補償する二次
的な変異がいろいろと誘起される。たとえば、感
染したプラスミドに変異を生じてプラスミドのコ
ピー数を減じるように変わつたものや、酵素の機
能や合成能を低下させるような変異を獲得したも
のや、あるいは他の代謝系を変えてひずみを補正
するような変異体が出現し、実際にはこの二次的
に起こる変異に左右されることが多く、遺伝子の
組み替え操作はまだ充分でない。 そこで本発明者らは、上記諸欠点を解消するた
め、バクテリオフアージを用いて種々検討を行つ
た。 一般にフアージ粒子は蛋白質と核酸（DNAあ
るいはRNA）とから構成されており、核酸の囲
りを蛋白質（コート蛋白質と呼ばれている）が包
むような構造をとつている。核酸には、バクテリ
オフアージが宿主に感染し、その細胞内で増殖す
るのに必要な全ての遺伝情報が記憶されている。
例えばバクテリオフアージλ（ラムダ）の場合に
は、DNA鎖の一方の半分にはフアージDNAの自
己複製に必要とされる遺伝情報が記憶されてお
り、もう一方の半分にコート蛋白質の合成に関与
する遺伝情報が記憶されている（A.D.Hershey編
Cold Spring Harbor Lab.発行「The
Bacteriophage Lambda」45頁、1971年）。そこ
でもしフアージDNAのこのコート蛋白質の合成
に関与する遺伝情報の部分の代りに他の遺伝情
報、例えば有用酵素の合成に関する遺伝情報を有
するDNA部分をエンドヌクレアーゼとDNAリガ
ーゼを利用し入れ替えるならば、フアージ感染宿
主細胞内でコート蛋白質の代りに大量の有用酵素
を合成させることが可能と考えられる。 しかし、一般にフアージは自己複製に関与する
DNA部分にもエンドヌクレアーゼ感受性を有し
ているため、エンドヌクリアーゼによりその
DNA部分が開裂されて自己増殖が不可能にな
る。 そこで本発明者等は、自己複製に関与する
DNA部分に損傷を与えずしてその部分のエンド
ヌクレアーゼ感受性を消去し、そしてコート蛋白
質の合成（製造）に関与するDNA部分にのみ
「エンドヌクレアーゼ感受性」をもたせる方法を
鋭意研究した結果、エンドヌクレアーゼによる開
裂部位が全く存在しないフアージとそれと同種又
は類縁でしかも目的とするDNA部分又は類似の
部分に開裂部位をもつフアージとの雑種をつくる
ことにより、目的とするDNA領域にのみエンド
ヌクレアーゼ感受性を残し、遺伝子操作における
遺伝子のクローン化に際し、自己複製可能な混成
DNA分子の作成を効率よく、容易に可能ならし
めることの新知見を得、この知見に基いて本発明
を完成したのである。 すなわち、本発明はフアージDNAのコート蛋
白質製造の遺伝情報の部分のみをエンドヌクレア
ーゼ感受性としたテンペレートフアージであるバ
クテリオフアージであり、また本発明はλ（ラム
ダ）系フアージに属するバクテリオフアージをエ
ンドヌクレアーゼ抵抗性としたのち、コート蛋白
質製造の遺伝情報部分にエンドヌクレアーゼ感受
性を有するλ（ラムダ）系フアージと掛合わせて
フアージDNAのコート蛋白質製造の遺伝情報の
部分のみをエンドヌクレアーゼ感受性としたテン
ペレートフアージを得ることを特徴とする新種バ
クテリオフアージの作成法であり、その目的とす
るところはバクテリオフアージDNAのコート蛋
白質製造の遺伝情報の部分のみをエンドヌクレア
ーゼ感受性とし、その部分の遺伝情報を他の目的
とする遺伝情報に置き換え、自己複製可能な混成
DNA成分に作成することを可能ならしめる有用
な新種のバクテリオフアージを提供することにあ
る。 以下本発明について具体的に説明する。 一般にバクテリオフアージは多かれ少なかれ宿
主の機能に依存し増殖殖しているわけであるが、
宿主の染色体外に独立して増殖できるレプリコン
であり、自律的状態にあるが、本発明に使用され
るバクテリオフアージとしては宿主細胞に感染し
た場合、宿主細胞のDNAにフアージDNAが組込
まれる性質（溶原性）を有するテンペレートフア
ージ（Temperate phage）が用いられる。この
テンペレートフアージとしてはλ系
（lambdoid）が好ましく、λ系フアージとしては
λ（ラムダ）（IFO 20016）、434（IFO 20018）、
82（（IFO 20019）、φ80（IFO 20020）、φ170
（IFO 20021）などが挙げられ、また宿主DNAに
組込まれたこれらフアージDNA、たとえば大腸
菌（E.coli）W3110に溶原化されたφ80〔大腸菌
（E.coli）K12ストレイン（strain）W3110（φ
80）（ATCC 31277）〕、大腸菌（E.coli）W3350
に溶原化されたλcI857〔大腸菌（E.coli）K12ス
トレイン（strain）W3350（λcI 857）（ATCC
31278）〕なども用いられる。 次に本発明に用いられるエンドヌクレアーゼ抵
抗性のフアージの作成であるが、まずエンドヌク
レアーゼとしては、DNA鎖の特定の部位を認識
することができ、その認識部位のDNA二重らせ
んを千鳥足状の付着端（cohesive ends）を生じ
させるように切断を行なう特異性の極めて高いエ
ンドヌクレアーゼが好ましく、この酵素としては
制限酵素が好適であり、具体的にはEcoRI、Bam
Ｉ、HindIII等が挙げられる。なお制限酵素は生
化学工業又はベーリンガー・マンハイム・山乃内
より入手できる。 エンドヌクレアーゼ抵抗性のフアージ、たとえ
ば制限酵素に全く開裂されない変異株フアージ
は、たとえば次のようにして得ることができる。
λ系フアージを制限酵素をもつている宿主ともた
ない宿主に交互に培養すると、制限酵素の作用を
受けるフアージは死滅し、制限酵素の作用を受け
にくい変異株が次第に増加する。このような微生
物的濃縮法によりついには制限酵素の作用を全く
受けない（制限酵素によりDNA鎖が全く開裂さ
れない）DNAをもつフアージ（制限酵素抵抗性
フアージ）を得ることができる。 また制限酵素の切断部位を部分的に欠失させた
後、微生物的濃縮法を用いることにより、より早
く抵抗性フアージを得ることができる。例えば
DNA上の制限酵素の切断部位を部分的に消去す
る方法としてはフアージの切断部位を含むDNA
部分を欠失させた欠失変異株を分離することであ
る。即ちフアージの生存に不必要なDNA部分に
制限酵素の切断部位が存在する場合、そのDNA
部分が欠失した変異株を分離することにより、そ
のフアージの制限酵素に対する抵抗性を増加させ
ることが出来る。欠失変異株は、切断部位を含む
DNA部分が欠失しているため比重が軽く又熱安
定性がよいので、この性質を利用して通常のフア
ージ培養液から分離できる。たとえば培養液に
CsCl（塩化セシウム）を添加して遠心分離する
CsCl密度こう配遠心法又はフアージ培養液を60
℃位に加熱した生き残つたフアージを分離するこ
とにより欠失変異株を得ることができる。この変
異株を使用して制限酵素をもつている宿主ともた
ない宿主に交互に培養する微生物的濃縮法により
制限酵素の作用を全く受けないDNAをもつフア
ージをより早く得ることができる。 次にこのようにして得た制限酵素による開裂部
位の全く存在しないフアージDNAに、目的とす
る部位に制限酵素による開裂部位を入れるため
に、λ系フアージの内、コート蛋白質製造の遺伝
情報部分にエンドヌクレアーゼ感受性を有するフ
アージを用い掛合せを行なう。掛合せの方法とし
ては制限酵素抵抗性のフアージ液（109〜1010／
ml）と感受性のフアージ液（109／1010／ml）と
を混合し、両者に感受性のある大腸菌（108〜
109／ml）に２種のフアージを同時に又は相前後
して感染させる。あるいはK12株に含まれる大腸
菌に溶原化されたエンドヌクレアーゼ抵抗性又は
感受性のフアージを誘発した後に別のエンドヌク
レアーゼ感受性又は抵抗性のフアージを感染させ
ることによつても可能である。その後上記のよう
にフアージを感染させた大腸菌を培地（培地とし
ては大腸菌の生長可能な培地であれば特に制限さ
れない）、たとえばトリプトン培地に入れ、37℃
で１〜２時間振盪培養する。 なお感受性の大腸菌としては、一般的なK12株
に含まれる大腸菌ならばいずれでもよく、たとえ
ばW3110（ATCC 27325）、W3350（ATCC
27020）、1100（Max−Plank−Institut西独）等が
挙げられる。また大腸菌は培養液の状態で用いて
もよいが、培養液を遠心分離して培養液を除去し
た後、10ｍＭのMgCl2に懸濁し、37℃で１時間振
盪した後使用した方がフアージの吸着感染が良く
なる。 このようにしてフアージDNAのコート蛋白質
製造の遺伝情報の部分のみにエンドヌクレアーゼ
感受性を有するフアージを105／ml程度得ること
が出来る。 得られたフアージから目的とするフアージを分
離するには次の方法による。 たとえば、λ系フアージの内の任意のものをＡ
フアージおよびＢフアージとし、エンドヌクレア
ーゼ抵抗性のＡフアージとコート蛋白質製造の遺
伝情報部分にエンドヌクレアーゼ感受性を有する
Ｂフアージを掛合せ、フアージDNAのコート蛋
白質製造の遺伝情報部分が感受性Ｂのフアージの
部分であり、自己複製に関与する遺伝情報部分が
抵抗性Ａフアージの部分の新種フアージを得れ
ば、ＡレジスタントＢ免疫性の大腸菌において、
新種フアージのみが増殖することが出来、他のフ
アージは生育することが出来ず、この方法により
新種フアージを分離することが出来る。 このＡレジストＢ免疫性の大腸菌を得るには次
の方法による。 まずＡフアージ、好ましくは溶原化の起らない
条件でＡフアージを大腸菌に感染させる。たとえ
ば大腸菌１に対して溶原性を失つたＡフアージの
変異株100程度を混合し、生残つた大腸菌はＡフ
アージにレジスタントな大腸菌である。一般にテ
ンペレートフアージはある確率で大腸菌に溶原化
されるため、にごつたプラーク（溶菌斑）を作る
が、溶原性を失つた変異株は透明なプラークを作
るため、この透明なプラークからフアージを採取
すれば、溶原性を失つたフアージを得ることがで
き、該フアージを用いると、Ａフアージレジスタ
ントな大腸菌を得るための選別操作が簡単で好ま
しい。 即ちこの大腸菌は使用したＡフアージに抵抗性
を有し、Ａフアージを吸着しない性質を有するも
のである。吸着の特異性はフアージの尾部に存在
する蛋白質によつて支配されている。このフアー
ジの吸着に関する遺伝情報がコート蛋白質製造の
遺伝情報DNA部分に含まれているので、Ａフア
ージコート蛋白質製造の遺伝情報を有するフアー
ジはＡフアージにレジスタントな大腸菌には吸着
出来ず、大腸菌中には進入出来ない。宿主大腸菌
がフアージ抵抗性変異をもつているかは次の方法
で確認することが出来る。例えばλフアージにレ
ジスタントな大腸菌はマルトースを資化すること
ができないので、マルトースと指示薬（メチレン
ブルー及びエオシンイエロー）を含む培地に培養
した場合、菌体が赤く染色されないことで確認さ
れる。 次にＡレジスタント宿主に対してＢ免疫性を付
与する。即ち免疫性を支配している遺伝情報が自
己複製に関与するDNA部分に存在する、たとえ
ばＢフアージをＡレジスタント宿主細胞に感染さ
せ宿主DNAにＢフアージDNAが組込まれた宿主
細胞を作成する。この宿主細胞に組込まれたＢフ
アージDNAと同じ免疫性を有するフアージが宿
主細胞内に進入してもそのフアージは宿主細胞内
では増殖出来ない。ＢフアージDNAが宿主DNA
に組込まれたかどうかは、宿主大腸菌に紫外線を
照射する等、フアージを誘発した後に宿主菌を振
盪培養し、Ｂフアージが遊離してくれば宿主細胞
DNAにＢフアージが組込まれていたことにな
る。 このようにしてフアージDNAのコート蛋白質
製造の遺伝情報部分のみにエンドヌクレアーゼ感
受性を有するテンペレートフアージであるバクテ
リオフアージDNAは該エンドヌクレアーゼによ
りその部分のみが開裂し目的とする遺伝情報をコ
ート蛋白質製造のための情報と置換えることを効
率よく容易に可能ならしめる。 この新種フアージのDNAのコート蛋白質製造
の遺伝情報の部分に目的とするDNA断片を組み
換え、得られた混成DNAを宿主に感染させて宿
主のDNAに組込ませた後保存し、必要に応じて
誘発させることにより遺伝情報を『増幅』し、そ
の宿主細胞をたとえばトリプトン培地に培養する
ことにより増幅された情報に基づいて特定の蛋白
質を大量に生産せしめることが出来、産業的有益
性は多大なものがある。 次に本発明の実施例を示すが、本発明はこれに
よつて制限されるものではない。 実施例 大腸菌制限酵素EcoRIによりコート蛋白質製造
に関する遺伝情報をもつDNA部分のみが切断
される新種フアージλcI857RIrh80の作成 １ フアージλcI857から欠失変異株フアージλ
cI857b6042の分離。 １−１ 大腸菌（E.coli）K12ストレイン
（strain）W3350（λcI 857）〔微工研菌寄第
8603号（FERM Ｐ−8603）、ATCC 31278〕
を１白金耳トリプトン培地３mlに接種し、30
℃で16時間振盪前培養する。得られた前培養
液３mlを30mlのトリプトン培地に入れ、30℃
で３時間振盪培養後、43℃で20分間振盪し、
λcI857を誘発する。その後、更に30℃で３
−６時間培養を続け、溶菌現象が起り、培養
液が透明に近くなつたところで培養をやめ、
培養液を遠心分離して細胞破片を除去し、そ
の上澄液をフアージλcI857液とした。この
時のフアージ数は約1011／mlであつた。 １−２ 該フアージλcI857液0.1mlを0.02Mエチ
レンジアミンテトラ酢酸（EDTA）を含むト
リス緩衝液（PH8.2）５mlに懸濁し、40℃に
10分間保つた後に、0.01M MgCl2を含む
0.01Mトリス緩衝液（PH7.2、トリス−Mg緩
衝液と略す）で107／mlになる様に稀釈し、
その0.1mlとトリプトン培地で37℃で16時間
静置培養した大腸菌W3110（ATCC 27325）
培養液0.25mlとを46℃に加温したB1−ソフト
アガー３mlと共にトリプトン寒天平板培地に
撤き、37℃で４〜５時間培養した。平板上の
フアージは４mlのトリス−Mg緩衝液で洗い
出しゴム栓付の殺菌した小試験管に保存し
た。続いてこのフアージ液の一部を用いて上
と全く同様の操作を５回繰返した。 １−３ 更に上記１−２で得られたフアージを、
１−２の40℃に10分間処理の代りに60℃に10
分間処理する以外は１−２と全く同様の方法
で４回繰返し、得られたフアージ液を103／
mlに稀釈し、その0.1mlを上記大腸菌W3110
の培養液0.25mlに混合し、トリプトン寒天平
板培地に撒き、37℃で一晩培養した後に100
個前後の溶菌斑が見られる平板からその１つ
の溶菌斑中のフアージを竹串でとりトリス−
Mg緩衝液に懸濁し、フアージλcI857b6042
株を得た。 この欠失変異株は親株λcI857の比重1.493
よりもやや軽い比重1.465を示し、その比重
から計算によりDNAの約23％が欠失してい
ることがわかつた。又、親株のフアージλ
cI857DNAは制限酵素EcoRI（生化学工業K.
K.より入手）により５ケ所で切断される
が、フアージλcI857b6042株では、大腸菌
W3110並びにW3110（RI）を用いてその生菌
数を測定し、計算式により算出したところ、
EcoRIによる切断部位が３ケ所になつたこと
が確認された。 なお大腸菌W3110（RI）は次の様にして
分離した。薬剤耐性因子RI（ペニシリン、
ストレプトマイシン、テトラサイクリン、サ
ルフア剤に耐性）をもつ大腸菌（E.coli）
RY−13（カリフオルニア大学、H.W.Boyer
より入手）〔微工研菌寄第8606号（FERMP
−8606）〕と大腸菌W3110（ATCC 27325）
を混合培養し、薬剤耐性因子をもつ大腸菌
W3110（RI）を分離した。 ２ フアージλcI857b6042株より制限酵素EcoRI
の作用を全く受けないフアージλ
cI857b6042RIr株の分離 ２−１ １−２の方法で培養した大腸菌W3110株
の16時間静置培養液0.25mlとフアージλ
cI857b6042液0.1mlとを46℃に加温したB1−
ソフトアガー３ml中で混合し、トリプトン寒
天平板培地上に撒き、37℃で４〜4.5時間培
養した後に、トリス−Mg緩衝液４mlとクロ
ロホルム３滴を加えて37℃に15分間放置し、
次いで上澄をピペツトでゴム栓付の小試験管
に移した。この時のフアージ数は６×1010／
mlであつた。 ２−２ ２−１で得られたフアージ粒子の数を制
限酵素EcoRIをもつ大腸菌W3110（RI）株を
用いて測定する（大腸菌W3110（RI）株は
制限酵素によりその細胞内に浸入したフアー
ジDNAを切断し不活性化する。その為に大
腸菌W3110（RI）株を用いて測定したフア
ージ数は制限酵素をもつていない大腸菌
W3110株を用いて測定した数に比べて遥かに
低く1/600の108／mlを示した）。 １−２の方法で培養した大腸菌W3110
（RI）の培養液0.25mlと、２−１で得られた
フアージをW3110（RI）で測定した場合に
107／mlになる様に稀釈し、その0.1mlを用い
て２−１と同く同様の操作を行いフアージ液
を得た。 ２−３ ２−２で得られたフアージは今度は２−
１の方法で処理した。この様に２−１と２−
２を交互に10回繰り返し最後に２−１の方法
で処理した標品のフアージ数を大腸菌W3110
（RI）で測定したところ、大腸菌W3110で測
定した数と変らない値を示した。つまり、得
られたフアージ標品はEcoRIの作用を全く受
けない変異株から成つていることが示され
た。このフアージ液を103／mlに稀釈し、そ
の0.1mlを大腸菌W3110培養液の0.25mlに混
合し、トリプトン寒天平板上で互に重ならな
い溶菌斑をつくらせ、そこからEcoRIの作用
を全くうけないフアージλcI857b6042RIr株
を単離した。 ３ フアージλcI857b6042RIrとフアージφ80と
の雑種形 λcI857フアージDNAにはもともとコート蛋
白質製造の遺伝情報部分にEcoRIによる切断部
位が存在しない。この部分に切断部位を付与す
るためにλフアージに類似のフアージφ80と
EcoRIに抵抗性のフアージλcI857b6042RIrと
の間で次のようにして雑種を形成させ新種のフ
アージλcI857RIrh80を得た。 即ち大腸菌W3110を１mlのトリプトン培地に
１白金耳接種し、37℃で16時間振とう培養し、
その0.1mlを15mlのトリプトン培地に加え、37
℃で振盪培養し菌数が３×108／mlに達した時
に菌体を10000回転／分で10分遠心分離し、５
mlのトリス−Mg緩衝液に懸濁した。この懸濁
液を37℃で１時間振とうした後に0.2mlを試験
管にとつた。別に大腸菌W3110をトリプトン培
地で37℃で３時間振盪培養後、これにλ
cI857b6042RIrを接種し、更に４時間培養し
た。該培養液をトリス−Mg緩衝液で30倍に稀
釈してλcI857b6042RIr液を得た。つぎに大腸
菌（E.coli）K12ストレイン（strain）W3110
（φ80）（ATCC 31277）を１白金耳、トリプト
ン培地３mlに接種し、37℃で16時間振盪前培養
して得られた前培養液３mlを30mlのトリプトン
培地に入れ、37℃で３時間振盪培養後、直径15
cmのシヤーレに該振盪培養液15mlを入れ、15W
紫外線ランプを用い、50cmの距離から１〜２分
間照射し、再び37℃で４時間振盪培養した。該
培養液を30倍に稀釈してφ80液を得た。 上記λcI857b6042RIr液（3.4×109／ml）0.2ml
と、上記φ80液（3.2×109／ml）0.2mlとを、上
記した試験管にとつた0.2mlの大腸菌W3110の懸
濁液に加え、37℃で10分間放置した後に、その
0.1mlを10mlのトリプトン培地に加え、37℃で70
分間振とうした。この振盪後、クロロホルムを７
滴加えて激しく振り、その0.1mlを大腸菌W3110
（φ80）／λ（λレジスタントでφ80が溶原化さ
れている大腸菌）と混合し46℃のB1−ソフトア
ガー３mlを加えてトリプトン寒天平板培地を撒い
た。37℃に一晩放置して生じた溶菌斑の１つから
フアージを竹串でとりトリス−Mg緩衝液に懸濁
した。その後更に大腸菌W3110（φ80）／λを用
いて溶菌斑をつくらせることを２度繰り返して精
製しλcI857RIrh80の新種フアージを得た。 なお上記大腸菌W3110（φ80）／λは次のよう
にして得たものである。 大腸菌（E.coli）K12ストレイン（strain）
W3110（φ80）〔微工研菌寄第8604号（FERM Ｐ
−8604）、ATCC 31277〕の１白金耳を２mlのト
リプトン培地に接種し、37℃で16時間静置培養す
る。この培養液0.1mlとλｖフアージ液（IFO
20017）の0.1mlを混合し、37℃で30分間保つた
後、46℃に加温したB1−ソフトアガー３mlを加
え、トリプトン寒天平板培地に撒き、37℃で48時
間培養する。培養後、平板上のコロニーの１つか
ら大腸菌を白金耳で滅菌した５mlの0.9％食塩水
にとり、その0.05mlを滅菌した0.9％食塩水で
10000倍に稀釈する。この稀釈液の0.1mlをトリプ
トン寒天平板培地上に撒き、37℃で48時間培養し
た平板上に生じたコロニーの１つから大腸菌を取
りW3110（φ80）／λとして用いる。 （注） トリプトン寒天平板培地 トリプトン（Difco）１％、NaCl 0.25
％、寒天1.2％；加圧滅菌後30mlずつを
直径９cmのシヤーレに分注した。 B1−ソフトアガー トリプトン（Difco）１％、NaCl 0.25
％、MgCl25ｍＭ、ビタミンB11.5μｇ/
ml、寒天0.5％；３mlずつ小試験管に分
注し加圧滅菌した。 トリプトン培地 トリプトン（Difco）１％、NaCl 0.25
％。 上記のようにして得た新種のフアージλ
cI857RIrh80の性質は次の如くである。 宿主：φ80レジスタントな大腸菌には感染出来
ず、λレジスタントの大腸菌には感染し、フア
ージφ80の宿主域と全く同じで、フアージλの
宿主域とは異つていた。このことはフアージλ
cI857RIrh80のコート蛋白質の少くとも一部は
フアージφ80と同じであることを示している。 免疫：フアージλの免疫を示した。 EcoRIによる制限：両親株の中間の値を示した。 温度感受性：フアージλcI857RIrh80は43℃では
活性のあるフアージ粒子を生産できなかつた。
これはフアージφ80のコート蛋白質の合成が43
℃では不可能（フアージλでは可能）であるこ
とと一致している。 溶原菌よりのλcI857RIrh80の生産：大腸菌
W3110をトリプトン培地で37℃で24時間振盪培
養し、得られた培養液（４×109／ml）の0.25
mlにλcI857RIrh80の103／ml液の0.1mlを添加
混合し46℃に加温したB1−ソフトアガー３ml
を加えてトリプトン寒天培地に撒き、30℃１晩
培養し、溶菌斑中の溶原菌を白金耳で取り、別
のトリプトン寒天地に塗抹し、30℃で１晩培養
し、出現したコロニーを採取する。得られた大
腸菌はλcI857RIrh80を溶原化した大腸菌であ
る。 該λcI857RIrh80を溶原化した大腸菌W3110を
トリプトン培地に33℃で２時間振盪培養した後、
43℃で20分間加温することによりλcI857RIrh80
を「誘発」した後、再び33℃で５時間培養し、３
×1011／mlのλcI857RIrh80フアージが得られ
た。これは上記と全く同じ方法を用い、λcI857
を大腸菌W3110に溶原化した後、該大腸菌を培養
し、フアージを誘発し、更に培養した場合の約３
倍の収量であつた。 形質導入：トリプトフアン合成酵素の生合成を支
配している遺伝子を形質導入は出来るが、ガラ
クトースの資化能を支配している遺伝子を導入
できない。 以上の性質から、フアージλcI857RIrh80が
DNAの自己複製に関与する遺伝情報を含むDNA
部分はフアージλに、又コート蛋白質製造の遺伝
情報を含むDNA部分はフアージφ80に由来する
ことは明らかである。 なお、得られたλcI857RIrh80はアメリカン・
タイプ・カルチユア・コレクシヨン（American
Type Culture Collection）に寄託され、その寄
託番号はATCC 31285であり、また上記λ
cI857RIrh80を大腸菌（E.coli）1100（Max−
Plank−Institut西独、ハイデルベルクより入手）
に溶原化して得られた溶原菌、すなわち大腸菌
（E.coli）1100（λcI857RIrh80）は、工業技術院
微生物工業技術研究所に、微工研菌寄第8605号
（FERM Ｐ−8605）として寄託されている。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ フアージDNAのコート蛋白質製造の遺伝情
報の部分のみをエンドヌクレアーゼ感受性とした
テンペレートフアージであるバクテリオフアー
ジ。 ２ テンペレートフアージがλ（ラムダ）系フア
ージである特許請求の範囲第１項記載のバクテリ
オフアージ。 ３ エンドレヌクレアーゼが制限酵素である特許
請求の範囲第１項又は第２項記載のバクテリオフ
アージ。 ４ λ（ラムダ）系フアージに属するバクテリオ
フアージをエンドヌクレアーゼ抵抗性としたの
ち、コート蛋白質製造の遺伝情報部分にエンドヌ
クレアーゼ感受性を有するλ（ラムダ）系フアー
ジと掛合せてフアージDNAのコート蛋白質製造
の遺伝情報の部分のみをエンドヌクレアーゼ感受
性としたテンペレートフアージを得ることを特徴
とする新種バクテリオフアージの作成法。
Priority Applications (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP4740977A JPS53133684A (en) | 1977-04-26 | 1977-04-26 | Novel bacteriophage and fabricating same |
| US05/895,602 US4332897A (en) | 1977-04-26 | 1978-04-12 | Novel bacteriophage and method for preparing same |
| GB16242/78A GB1598019A (en) | 1977-04-26 | 1978-04-25 | Bacteriophage and method for preparing same |
| DK179078A DK161105C (da) | 1977-04-26 | 1978-04-25 | Bakteriophag samt fremgangsmaade til fremstilling deraf |
| NL7804483A NL191440C (nl) | 1977-04-26 | 1978-04-26 | Bacteriofaag, cultuur van E. coli en werkwijze voor het vormen van een nieuwe bacteriofaag. |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP4740977A JPS53133684A (en) | 1977-04-26 | 1977-04-26 | Novel bacteriophage and fabricating same |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS53133684A JPS53133684A (en) | 1978-11-21 |
| JPS6137915B2 true JPS6137915B2 (ja) | 1986-08-26 |
Family
ID=12774319
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP4740977A Granted JPS53133684A (en) | 1977-04-26 | 1977-04-26 | Novel bacteriophage and fabricating same |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4332897A (ja) |
| JP (1) | JPS53133684A (ja) |
| DK (1) | DK161105C (ja) |
| GB (1) | GB1598019A (ja) |
| NL (1) | NL191440C (ja) |
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| US20010043924A1 (en) * | 1994-04-05 | 2001-11-22 | Exponential Biotherapies, Inc. | Antibacterial therapy with bacteriophage physico-chemically altered to delay inactivation by the host defense system |
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-
1978
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- 1978-04-25 GB GB16242/78A patent/GB1598019A/en not_active Expired
- 1978-04-25 DK DK179078A patent/DK161105C/da not_active IP Right Cessation
- 1978-04-26 NL NL7804483A patent/NL191440C/xx not_active IP Right Cessation
Also Published As
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