JPS6141897B2 - - Google Patents
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- JPS6141897B2 JPS6141897B2 JP53046002A JP4600278A JPS6141897B2 JP S6141897 B2 JPS6141897 B2 JP S6141897B2 JP 53046002 A JP53046002 A JP 53046002A JP 4600278 A JP4600278 A JP 4600278A JP S6141897 B2 JPS6141897 B2 JP S6141897B2
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- plasma
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/576—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for hepatitis
- G01N33/5761—Hepatitis B
- G01N33/5762—Hepatitis B core antigen
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2730/00—Reverse transcribing DNA viruses
- C12N2730/00011—Details
- C12N2730/10011—Hepadnaviridae
- C12N2730/10111—Orthohepadnavirus, e.g. hepatitis B virus
- C12N2730/10122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
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- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/961—Chemistry: molecular biology and microbiology including a step of forming, releasing, or exposing the antigen or forming the hapten-immunogenic carrier complex or the antigen per se
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Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、競合ラジオイムアツセイ等の診断ア
ツセイに使用される肝炎Ｂ核抗原の製法に関する
ものである。
ツセイに使用される肝炎Ｂ核抗原の製法に関する
ものである。
HBcAgはHBsAg陽性供給者から流体の同密度
バンデイング（isopycnic banding）によつてデ
ーン粒子を分離し、しかし所望により好適にはデ
ーン粒子をペレツトにし次いでメルカプトエタノ
ールのような還元剤の存在下、約15〜35オキシエ
チレンを有する非イオン界面活性剤とデーン粒子
を接触させることによつて表面抗原を除去するこ
とによつて製造される。分離した核抗原は診断剤
および免疫剤として使用される。
バンデイング（isopycnic banding）によつてデ
ーン粒子を分離し、しかし所望により好適にはデ
ーン粒子をペレツトにし次いでメルカプトエタノ
ールのような還元剤の存在下、約15〜35オキシエ
チレンを有する非イオン界面活性剤とデーン粒子
を接触させることによつて表面抗原を除去するこ
とによつて製造される。分離した核抗原は診断剤
および免疫剤として使用される。
本発明の精製肝炎Ｂ核抗原（HBcAg）の出発
物質はHBsAgに陽性の供給者から得られた血漿
である。血漿は例えば血漿搬出法による通常の方
法によつて得られる。HBsAgレベルは例えば逆
受動血球凝集（reversed passive
hemagglutination）または補体結合などあらゆる
手段による公知の方法で測定されることができ
る。所望により血漿は冷却され生成する寒冷沈殿
物は光遠心分離によつて除去される。生成血漿中
のデーン粒子は同密度バンデイングによつて分離
される。デーン粒子に富む留分は好ましくはペレ
ツトにしてデーン核抗体を除去するために処理さ
れ次いで表面抗原を除去し核抗原を遊離するため
に処理される。表面抗原の除去は例えばメルカプ
トエタノール、ジチオスレイトール、ジチオエリ
スソトールおよびジチオカプリル酸などのメルカ
プタン還元剤の存在下分子中に約15〜35好ましく
は18〜33オキシエチレン単位を有する非イオン界
面活性剤とデーン粒子を接触させることによつて
行なわれる。好適な非イオン界面活性剤はオキシ
エチル化アルキルフエノール・ポリオキシエチレ
ンソルビタン脂肪酸エステル・ポリオキシエチレ
ン酸、ポリオキシエチレンアルコールポリオキシ
エチレン油およびポリオキシエチレンオキシプロ
ピレン脂肪酸である。
物質はHBsAgに陽性の供給者から得られた血漿
である。血漿は例えば血漿搬出法による通常の方
法によつて得られる。HBsAgレベルは例えば逆
受動血球凝集（reversed passive
hemagglutination）または補体結合などあらゆる
手段による公知の方法で測定されることができ
る。所望により血漿は冷却され生成する寒冷沈殿
物は光遠心分離によつて除去される。生成血漿中
のデーン粒子は同密度バンデイングによつて分離
される。デーン粒子に富む留分は好ましくはペレ
ツトにしてデーン核抗体を除去するために処理さ
れ次いで表面抗原を除去し核抗原を遊離するため
に処理される。表面抗原の除去は例えばメルカプ
トエタノール、ジチオスレイトール、ジチオエリ
スソトールおよびジチオカプリル酸などのメルカ
プタン還元剤の存在下分子中に約15〜35好ましく
は18〜33オキシエチレン単位を有する非イオン界
面活性剤とデーン粒子を接触させることによつて
行なわれる。好適な非イオン界面活性剤はオキシ
エチル化アルキルフエノール・ポリオキシエチレ
ンソルビタン脂肪酸エステル・ポリオキシエチレ
ン酸、ポリオキシエチレンアルコールポリオキシ
エチレン油およびポリオキシエチレンオキシプロ
ピレン脂肪酸である。
ある種の特定具体例としては次の通りである：
アルキルフエノキシポリエトキシ（30）エタノ
ール ポリオキシエチレン（20）ソルビタンモノラウ
レート ポリオキシエチレン（20）ソルビタンモノパル
ミテート ポリオキシエチレン（20）ソルビタンモノステ
アレート ポリオキシエチレン（20）ソルビタントリステ
アレート ポリオキシエチレン（20）ソルビタンモノオレ
エート ポリオキシエチレン（20）ソルビタントリオレ
エート ポリオキシエチレン（20）パルミテート ポリオキシエチレン（20）ラウリルエーテル ポリオキシエチレン（20）セチルエーテル ポリオキシエチレン（20）ステアリルエーテル ポリオキシエチレン（20）オレイルエーテル ポリオキシエチレン（25）水素化ヒマシ油 ポリオキシエチレン（25）オキシプロピレンモ
ノステアレート 同密度バンデイングにおいて部分的に精製され
た濃縮物は分離される特定抗原密度を包含する密
度勾配を有する液状媒質と接触される。次いで液
状媒質は超遠心分離にかけられ個々の密度に従つ
て密度勾配により血清成分の平衡分布が得られ
る。媒質の連続した留分は置換され希望する抗原
を含む留分即ち約1.26〜1.30ｇ／c.c.を有する留分
が分離される。勾配を生成する溶液の濃度は約
1.0〜1.41ｇ／c.c.の密度範囲を包囲するように選
択される。液状媒質は線状勾配または階段勾配の
形で使用されることができる。好ましくは固有の
より高い分別力のため階段勾配の形で使用され
る。
ール ポリオキシエチレン（20）ソルビタンモノラウ
レート ポリオキシエチレン（20）ソルビタンモノパル
ミテート ポリオキシエチレン（20）ソルビタンモノステ
アレート ポリオキシエチレン（20）ソルビタントリステ
アレート ポリオキシエチレン（20）ソルビタンモノオレ
エート ポリオキシエチレン（20）ソルビタントリオレ
エート ポリオキシエチレン（20）パルミテート ポリオキシエチレン（20）ラウリルエーテル ポリオキシエチレン（20）セチルエーテル ポリオキシエチレン（20）ステアリルエーテル ポリオキシエチレン（20）オレイルエーテル ポリオキシエチレン（25）水素化ヒマシ油 ポリオキシエチレン（25）オキシプロピレンモ
ノステアレート 同密度バンデイングにおいて部分的に精製され
た濃縮物は分離される特定抗原密度を包含する密
度勾配を有する液状媒質と接触される。次いで液
状媒質は超遠心分離にかけられ個々の密度に従つ
て密度勾配により血清成分の平衡分布が得られ
る。媒質の連続した留分は置換され希望する抗原
を含む留分即ち約1.26〜1.30ｇ／c.c.を有する留分
が分離される。勾配を生成する溶液の濃度は約
1.0〜1.41ｇ／c.c.の密度範囲を包囲するように選
択される。液状媒質は線状勾配または階段勾配の
形で使用されることができる。好ましくは固有の
より高い分別力のため階段勾配の形で使用され
る。
同密度バンデイング段階で使用される液状媒質
は例えばシヨ糖、臭化カリウム、塩化セシウム、
酒石酸カリウムまたは臭化ナトリウムなどの特定
範囲のあらゆる密度勾配であることができる。
は例えばシヨ糖、臭化カリウム、塩化セシウム、
酒石酸カリウムまたは臭化ナトリウムなどの特定
範囲のあらゆる密度勾配であることができる。
尚、同密度バンデイングとは、低分子によつて
形成される媒体の密度勾配および溶質の等密度点
への分布が時間とともに変化しなくなる平衡状態
に達するまで遠心し、溶質の浮遊密度の測定ある
いは浮遊密度による溶質の分離精製を行なうもの
である。なお、その具体的操作法については後述
の実施例１中のＡの項に記載されている。
形成される媒体の密度勾配および溶質の等密度点
への分布が時間とともに変化しなくなる平衡状態
に達するまで遠心し、溶質の浮遊密度の測定ある
いは浮遊密度による溶質の分離精製を行なうもの
である。なお、その具体的操作法については後述
の実施例１中のＡの項に記載されている。
実施例 １
Ａ デーン粒子の製造（HBV）
遠心機エレクトロヌクレオニクスＫの回転子を
リン酸塩緩衝液8.400mlで充填した。系を脱ガス
するために回転子を10.000rpmまで回転させた
後、次の階段勾配を固定回転子の底部に注入し
た： １ 10％NaBr2.400ml ρ＝1.08 ２ 20％NaBr1.000ml ρ＝1.17 ３ 30％NaBr1.500ml ρ＝1.28 ４ 40％NaBr3.500ml ρ＝1.41 HBsAg含有血漿1.750mlを固定回転子の頭部に
注入して回転子の底部から40％NaBr1.750mlを置
換せしめた。回転子を30.000rpmに加速し、この
速度で４時間回転させた。次いで回転子を停止し
40％NaBr1.750mlを回転子の底部に注入し血漿を
頭部から押し出した。HBsAgを含有する追加の
新鮮な血漿1.750mlを回転子の頭部に注入し回転
子の底部から40％NaBrの等量を置換排出せしめ
た。次いで回転子を30.000rpmで18時間回転させ
た。回転子を停止した後1.26〜1.30密度範囲のデ
ーン粒子に富んだ物質1.000mlを収集した。
リン酸塩緩衝液8.400mlで充填した。系を脱ガス
するために回転子を10.000rpmまで回転させた
後、次の階段勾配を固定回転子の底部に注入し
た： １ 10％NaBr2.400ml ρ＝1.08 ２ 20％NaBr1.000ml ρ＝1.17 ３ 30％NaBr1.500ml ρ＝1.28 ４ 40％NaBr3.500ml ρ＝1.41 HBsAg含有血漿1.750mlを固定回転子の頭部に
注入して回転子の底部から40％NaBr1.750mlを置
換せしめた。回転子を30.000rpmに加速し、この
速度で４時間回転させた。次いで回転子を停止し
40％NaBr1.750mlを回転子の底部に注入し血漿を
頭部から押し出した。HBsAgを含有する追加の
新鮮な血漿1.750mlを回転子の頭部に注入し回転
子の底部から40％NaBrの等量を置換排出せしめ
た。次いで回転子を30.000rpmで18時間回転させ
た。回転子を停止した後1.26〜1.30密度範囲のデ
ーン粒子に富んだ物質1.000mlを収集した。
デーン粒子（HBV）を次の操作でNaBr帯状留
分から分離した。帯状留分（1.000ml）をリン酸
塩緩衝生理食塩水を使用して3.000mlに希釈し
た。次いでこの物質を12タイプ19回転子プラスチ
ツクビン（約250ml／ビン）に入れた。次いで物
質をタイプ19回転子（ベツクマン）を使用して遠
心分離した。回転子をデーン粒子をペレツトにす
るために17.000rpm（45.000×ｇ）で24時間回転
させた。次いで回転子を停止し各ビンからの上澄
みを傾瀉させた。全ての12ビンからのペレツト物
質を総容量５〜７mlのトリス・サリーン緩衝液に
回収し−70℃に貯蔵した。この物質はデーン粒子
濃縮物である。
分から分離した。帯状留分（1.000ml）をリン酸
塩緩衝生理食塩水を使用して3.000mlに希釈し
た。次いでこの物質を12タイプ19回転子プラスチ
ツクビン（約250ml／ビン）に入れた。次いで物
質をタイプ19回転子（ベツクマン）を使用して遠
心分離した。回転子をデーン粒子をペレツトにす
るために17.000rpm（45.000×ｇ）で24時間回転
させた。次いで回転子を停止し各ビンからの上澄
みを傾瀉させた。全ての12ビンからのペレツト物
質を総容量５〜７mlのトリス・サリーン緩衝液に
回収し−70℃に貯蔵した。この物質はデーン粒子
濃縮物である。
Ｂ デーン粒子の精製
Ａ部からの濃縮デーン粒子１mlを１／２×2″セ
ルロース硝酸塩管を有するSW65回転子にトリス
緩衝液（PH7.6）中20％シヨ糖―１％牛の清アル
ブミン（BSA）４ml上に積層した。粒子を
35.000rpmで４時間遠心分離した。遠心分離後上
澄み流体を傾瀉しペレツトを先に綿をつけた棒
（緩衝液で予め湿した）を用いて１％BSAを含む
トリス緩衝液0.5mlに緩やかに再懸濁させた。次
いで綿棒を0.5ml緩衝液ですすいだ。デーン粒子
物質の最終容量は１mlであつた。デーン粒子を−
70℃で貯蔵した。
ルロース硝酸塩管を有するSW65回転子にトリス
緩衝液（PH7.6）中20％シヨ糖―１％牛の清アル
ブミン（BSA）４ml上に積層した。粒子を
35.000rpmで４時間遠心分離した。遠心分離後上
澄み流体を傾瀉しペレツトを先に綿をつけた棒
（緩衝液で予め湿した）を用いて１％BSAを含む
トリス緩衝液0.5mlに緩やかに再懸濁させた。次
いで綿棒を0.5ml緩衝液ですすいだ。デーン粒子
物質の最終容量は１mlであつた。デーン粒子を−
70℃で貯蔵した。
Ｃ HBcAg（核抗原）の製造
Ｂ部からの材料、１mlを脱イオン水中２―メル
カプトエタノール１％（Ｖ／Ｖ）および脱イオン
水中ポリオキシエチレン20ソルビタンモノオレエ
ート１％（Ｖ／Ｖ）１mlに添加した。生成混合液
を静かに撹拌し、37℃水浴に置いた。１時間後、
混合液をml当り32IAHA単位を含有するまで先に
前もつて計算した量の希釈剤を使用して（0.08M
トリス、0.008MMgClおよび0.14MNaclおよび１
％BSAを含有する溶液）TMN―１％BSAで希釈
した。次いで溶液をプラスチツク２mlねじぶた血
清管（0.5ml／管）に分配し液体窒素フリーザー
に貯蔵した。
カプトエタノール１％（Ｖ／Ｖ）および脱イオン
水中ポリオキシエチレン20ソルビタンモノオレエ
ート１％（Ｖ／Ｖ）１mlに添加した。生成混合液
を静かに撹拌し、37℃水浴に置いた。１時間後、
混合液をml当り32IAHA単位を含有するまで先に
前もつて計算した量の希釈剤を使用して（0.08M
トリス、0.008MMgClおよび0.14MNaclおよび１
％BSAを含有する溶液）TMN―１％BSAで希釈
した。次いで溶液をプラスチツク２mlねじぶた血
清管（0.5ml／管）に分配し液体窒素フリーザー
に貯蔵した。
実施例 ２
12個の６mlガラスバアイアルの各々に実施例１
に記載した通りに製造した精製デーン粒子１ml、
脱イオン水中１％（Ｖ／Ｖ）２―メルカプトエタ
ノール１mlおよび脱イオン水中下に挙げた物質の
１％（Ｖ／Ｖ）溶液１mlを添加した。混合液を静
かに撹拌し、37℃水浴においた。１時間後、生成
混合液をHBcAgに対して免疫付着血球凝集検定
（IAHA）によつて検定した。
に記載した通りに製造した精製デーン粒子１ml、
脱イオン水中１％（Ｖ／Ｖ）２―メルカプトエタ
ノール１mlおよび脱イオン水中下に挙げた物質の
１％（Ｖ／Ｖ）溶液１mlを添加した。混合液を静
かに撹拌し、37℃水浴においた。１時間後、生成
混合液をHBcAgに対して免疫付着血球凝集検定
（IAHA）によつて検定した。
尚、下記IAHA単位は、下記非イオン界面活性
剤とデーン粒子を接触させることにより得られた
HBcAgに対する血球の凝集の程度を示すもので
あり、その数値の大きいものほど、血球の凝集程
度が高く、したがつて、得られたHBcAgの量も
多いということになる。非イオン界面活性剤 IAHA単位 ポリオキシエチレン（20）ソルビタンモノオレ
エート 1000 ポリオキシエチレン（20）ソルビタンモノウラ
レート 1000 ポリオキシエチレン（23）ラウリルエーテル
1000 ポリオキシエチレン（20）セチルエーテル 1000 アルキルフエノキシポリエトキシ（30）エタノ
ール 1000 アルキルフエノキシポリエトキシ(9)エタノール
240 アルキルフエノキシポリエトキシ（40）エタノ
ール 240 ポリオキシエチレン(9)オクタフエノール 60 ソルビタンモノウラレート 30 ソルビタンモノステアレート 30 ドデシル硫酸ナトリウム 30 ポリアルキルアリールスルホン酸 30 前述の結果は９または40オキシエチレン単位を
含有する非イオン界面活性剤が20〜30オキシエチ
レン単位を含有するそれに劣つていることを意味
し、一方ではいくつかのオキシエチレン単位を有
しないそれはほとんど全体的に効果を有しないこ
とを示すものである。
剤とデーン粒子を接触させることにより得られた
HBcAgに対する血球の凝集の程度を示すもので
あり、その数値の大きいものほど、血球の凝集程
度が高く、したがつて、得られたHBcAgの量も
多いということになる。非イオン界面活性剤 IAHA単位 ポリオキシエチレン（20）ソルビタンモノオレ
エート 1000 ポリオキシエチレン（20）ソルビタンモノウラ
レート 1000 ポリオキシエチレン（23）ラウリルエーテル
1000 ポリオキシエチレン（20）セチルエーテル 1000 アルキルフエノキシポリエトキシ（30）エタノ
ール 1000 アルキルフエノキシポリエトキシ(9)エタノール
240 アルキルフエノキシポリエトキシ（40）エタノ
ール 240 ポリオキシエチレン(9)オクタフエノール 60 ソルビタンモノウラレート 30 ソルビタンモノステアレート 30 ドデシル硫酸ナトリウム 30 ポリアルキルアリールスルホン酸 30 前述の結果は９または40オキシエチレン単位を
含有する非イオン界面活性剤が20〜30オキシエチ
レン単位を含有するそれに劣つていることを意味
し、一方ではいくつかのオキシエチレン単位を有
しないそれはほとんど全体的に効果を有しないこ
とを示すものである。
実施例 ３
実施例２で使用した同一ロツトから精製したデ
ーン粒子の最初の試料１mlにポリオキシエチレン
（20）ソルビタンモノオレエート１mlおよび２―
メルカプトエタノール１mlを添加した。２―メル
カプトエタノールを脱イオン水１mlに代えた以外
は第二の１ml試料を同様に処理した。各試料を混
合し１時間37℃で培養してHBcAgに対して免疫
付着血球凝集検定によつて分析した。２―メルカ
プトエタノールを有しない第二の試料は最初の試
料のHBcAg量の半分以下を含有することがわか
つた。
ーン粒子の最初の試料１mlにポリオキシエチレン
（20）ソルビタンモノオレエート１mlおよび２―
メルカプトエタノール１mlを添加した。２―メル
カプトエタノールを脱イオン水１mlに代えた以外
は第二の１ml試料を同様に処理した。各試料を混
合し１時間37℃で培養してHBcAgに対して免疫
付着血球凝集検定によつて分析した。２―メルカ
プトエタノールを有しない第二の試料は最初の試
料のHBcAg量の半分以下を含有することがわか
つた。
実施例 ４
実施例１で製造したHBcAgを次の通りミヨウ
バンに吸着させた。16〜32IA単位／mlを含有す
るHBcAg（タイプAd）10mlを10％ミヨウバン溶
液KAl（SO4）2、12H2Oと混合した。撹拌しなが
ら0.1N NaOHを徐々に添加し、PHを6.8に調整し
た。混合を１時間室温で続けた。次いで溶液を
1500×ｇで10分間遠心分離した。上澄みを傾瀉し
ペレツトを生理食塩水で最初の容量（10ml）に再
懸濁した。次いで溶液を抗原として使用する前に
５〜10分間撹拌した。
バンに吸着させた。16〜32IA単位／mlを含有す
るHBcAg（タイプAd）10mlを10％ミヨウバン溶
液KAl（SO4）2、12H2Oと混合した。撹拌しなが
ら0.1N NaOHを徐々に添加し、PHを6.8に調整し
た。混合を１時間室温で続けた。次いで溶液を
1500×ｇで10分間遠心分離した。上澄みを傾瀉し
ペレツトを生理食塩水で最初の容量（10ml）に再
懸濁した。次いで溶液を抗原として使用する前に
５〜10分間撹拌した。
実施例 ５
HBcAg10ml（タイプAy）を使用した以外は実
施例４の操作を用いた。
施例４の操作を用いた。
実施例 ６
実施例４および５で製造したミヨウバン抗原を
高力価HBcAb血清を調整するために使用した。
てんじくねずみをHBcAb抗血清を製造するため
に使用する２つのグループに分けた。第一のグル
ープに実施例４の生成物の筋肉内注射を月一回の
間隔で0.5mlを３用量で投与した。第二のグルー
プは実施例５の生成物で同様に処理した。高力価
肝炎Ｂ抗体血清を各グループにおいて製造した。
高力価HBcAb血清を調整するために使用した。
てんじくねずみをHBcAb抗血清を製造するため
に使用する２つのグループに分けた。第一のグル
ープに実施例４の生成物の筋肉内注射を月一回の
間隔で0.5mlを３用量で投与した。第二のグルー
プは実施例５の生成物で同様に処理した。高力価
肝炎Ｂ抗体血清を各グループにおいて製造した。
実施例 ７
酵素結合イミユノソーバント検定
（Enzyme―linked immunosorbant assay）
（ELISA）
実施例１で得られたHBcAgを200.000×ｇで2.5
時間20〜60％シヨ糖勾配で遠心分離によつて精製
した。次いでHBcAgを蛋白質含有量を決定する
ために検定した。
時間20〜60％シヨ糖勾配で遠心分離によつて精製
した。次いでHBcAgを蛋白質含有量を決定する
ために検定した。
HBcAgをELISA検定で使用のため0.1M炭酸塩
緩衝液PH9.7で１μｇ／mlに希釈した。
緩衝液PH9.7で１μｇ／mlに希釈した。
検定に使用した固体相は96ウエル・クツケ
（Cooke）ミクロ力価、Ｕ―底部ポリスチレンプ
レートである。
（Cooke）ミクロ力価、Ｕ―底部ポリスチレンプ
レートである。
酵素配合体は山羊の抗―ヒト免疫グロブリンに
接合したアルカリ性ホスフアターゼである（エン
グヴアル（Engvall）等）１。使用レベルは滴定
によつて同定される。
接合したアルカリ性ホスフアターゼである（エン
グヴアル（Engvall）等）１。使用レベルは滴定
によつて同定される。
酵素基質は0.001M MgCl2を含有する。0.1M炭
酸塩緩衝液PH9.8中の0.01％ｐ―ニトロフエニル
ホスフエートである。
酸塩緩衝液PH9.8中の0.01％ｐ―ニトロフエニル
ホスフエートである。
検定方法はＥ・ナツソイ（Nassau）等によつ
て記述される２。この方法は血漿および血清試料
中にHBcAbを検出するために使用される。
て記述される２。この方法は血漿および血清試料
中にHBcAbを検出するために使用される。
１ 免疫雑誌（The Journal of Immunology）
第109巻第129頁（1972年） ２ 結核（Tubercle）第57巻第67〜70頁（1976
年） 実施例 ８ 実施例１の最終生成物を殺菌条件下37℃で72時
間に4000ホルマリンで処理した。次いで過剰のホ
ルマリンを重亜硫酸ナトリウムで中和した。次い
で核抗原を実施例４の操作に従つてミヨウバンに
吸着させた。
第109巻第129頁（1972年） ２ 結核（Tubercle）第57巻第67〜70頁（1976
年） 実施例 ８ 実施例１の最終生成物を殺菌条件下37℃で72時
間に4000ホルマリンで処理した。次いで過剰のホ
ルマリンを重亜硫酸ナトリウムで中和した。次い
で核抗原を実施例４の操作に従つてミヨウバンに
吸着させた。
HBcAbに対して陽性で32IAHA単位／mlまたは
それ以上のHBcAb抗体力価（免疫付着血球凝集
検定IAHAによつて測定）を有する個体にワクチ
ン１ml（40μｇ）用量を筋肉内に投与した。追加
の注射を最初の注射の次に１ケ月および３ケ月に
した。三番目の注射後１週間固体は血漿搬出し
HBcAb力価を免疫付着血球凝集検定を用いて個
体血漿について続けた。大多数の個体は最初の力
価に比較してHBcAb力価の増大を経験した。
2000またはそれより高い抗体力価を有する血漿は
高HBcAb力価を有するガンマグロブリンを生じ
るための方法である。
それ以上のHBcAb抗体力価（免疫付着血球凝集
検定IAHAによつて測定）を有する個体にワクチ
ン１ml（40μｇ）用量を筋肉内に投与した。追加
の注射を最初の注射の次に１ケ月および３ケ月に
した。三番目の注射後１週間固体は血漿搬出し
HBcAb力価を免疫付着血球凝集検定を用いて個
体血漿について続けた。大多数の個体は最初の力
価に比較してHBcAb力価の増大を経験した。
2000またはそれより高い抗体力価を有する血漿は
高HBcAb力価を有するガンマグロブリンを生じ
るための方法である。
実施例 ９
実施例１のＢ部からの物質１mlを脱イオン水中
２―メルカプトエタノール１％（Ｖ／Ｖ）溶液１
mlおよび脱イオン水中ポリオキシエチレン20ソル
ビタンモノオレエート１％（Ｖ／Ｖ）溶液１mlに
添加した。生成混合液を緩やかに撹拌し37℃水浴
中においた。１時間後混合液をml当り32IAHAを
含有するまで前もつて計算した量の希釈剤を用い
てSPGAで希釈した。次いで溶液をプラスチツク
の２mlねじぶた血清管（0.5ml／管）に分配し、
液体窒素フリーザーに貯蔵した。
２―メルカプトエタノール１％（Ｖ／Ｖ）溶液１
mlおよび脱イオン水中ポリオキシエチレン20ソル
ビタンモノオレエート１％（Ｖ／Ｖ）溶液１mlに
添加した。生成混合液を緩やかに撹拌し37℃水浴
中においた。１時間後混合液をml当り32IAHAを
含有するまで前もつて計算した量の希釈剤を用い
てSPGAで希釈した。次いで溶液をプラスチツク
の２mlねじぶた血清管（0.5ml／管）に分配し、
液体窒素フリーザーに貯蔵した。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ メルカプタン還元剤の存在下、デーン粒子を
約15〜35オキシエチレン単位を有する非イオン界
面活性剤で処理することを特徴とする肝炎Ｂ核抗
原の製造方法。 ２ 還元剤がメルカプトエタノールである特許請
求の範囲第１項の方法。 ３ 非イオン界面活性剤がポリオキシエチレン
（20）ソルビタンモノオレエート、ポリオキシエ
チレン（20）ソルビタンモノラウレート、ポリオ
キシエチレン（23）ラウリルエーテル、ポリオキ
シエチレン（20）セチルエーテルまたはアルキル
フエノキシポリエトキシ（30）エタノールである
特許請求の範囲第１項の方法。 ４ デーン粒子がヒトの肝炎Ｂ供給者の生物学的
流体を好適な密度勾配中の同密度バンデイングに
かけることによつて得られる特許請求の範囲第１
項の方法。 ５ 密度勾配が階段勾配であり、生物学的流体が
血漿である特許請求の範囲第４項の方法。 ６ 密度勾配が臭化ナトリウムである特許請求の
範囲第４項の方法。 ７ デーン粒子が同密度バンデイング後、非イオ
ン界面活性剤で処理する前にペレツトにされる特
許請求の範囲第４項の方法。
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US05/789,033 US4102996A (en) | 1977-04-20 | 1977-04-20 | Method of preparing hepatitis B core antigen |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS53133628A JPS53133628A (en) | 1978-11-21 |
| JPS6141897B2 true JPS6141897B2 (ja) | 1986-09-18 |
Family
ID=25146371
Family Applications (4)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP4600278A Granted JPS53133628A (en) | 1977-04-20 | 1978-04-20 | Hepatisis b nuclear antigen |
| JP57083347A Pending JPS57201854A (en) | 1977-04-20 | 1982-05-19 | Hepatitis b nucleus antigen |
| JP57083346A Pending JPS57203016A (en) | 1977-04-20 | 1982-05-19 | Hepatitis b antigen |
| JP58002940A Pending JPS58180430A (ja) | 1977-04-20 | 1983-01-13 | 肝炎ｂ核抗原 |
Family Applications After (3)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP57083347A Pending JPS57201854A (en) | 1977-04-20 | 1982-05-19 | Hepatitis b nucleus antigen |
| JP57083346A Pending JPS57203016A (en) | 1977-04-20 | 1982-05-19 | Hepatitis b antigen |
| JP58002940A Pending JPS58180430A (ja) | 1977-04-20 | 1983-01-13 | 肝炎ｂ核抗原 |
Country Status (14)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4102996A (ja) |
| JP (4) | JPS53133628A (ja) |
| BE (1) | BE866096A (ja) |
| CA (1) | CA1106279A (ja) |
| DE (1) | DE2816864C2 (ja) |
| DK (1) | DK158678C (ja) |
| FR (1) | FR2387656A1 (ja) |
| GB (3) | GB1596593A (ja) |
| HK (3) | HK67684A (ja) |
| IE (1) | IE46793B1 (ja) |
| IT (1) | IT1102573B (ja) |
| LU (1) | LU79477A1 (ja) |
| NL (1) | NL7803625A (ja) |
| SG (1) | SG41884G (ja) |
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|---|---|---|---|---|
| DE2750045A1 (de) * | 1977-11-09 | 1979-05-10 | Behringwerke Ag | Verfahren zur entfernung von detergentien aus virusantigensuspensionen |
| US4204989A (en) * | 1978-12-13 | 1980-05-27 | Merck & Co., Inc. | Isolation of hepatitis B e antigen |
| US4241175A (en) * | 1978-12-18 | 1980-12-23 | Merck & Co., Inc. | Assay for hepatitis B core antibody |
| LU88258I2 (ja) * | 1978-12-22 | 1994-02-03 | ||
| US6270955B1 (en) | 1978-12-22 | 2001-08-07 | Biogen, Inc. | Pharmaceutical compositions and methods for producing antibodies to hepatitis b virus and kits and methods for detecting antibodies to hepatitis b virus |
| US4395395A (en) * | 1979-05-21 | 1983-07-26 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Detection of non-A, non-B hepatitis associated antigen |
| CA1148859A (en) * | 1979-06-14 | 1983-06-28 | Lacy R. Overby | Simultaneous assay of two hepatitis viruses using a solid phase |
| FR2470795A1 (fr) * | 1979-12-07 | 1981-06-12 | Pasteur Institut | Procede de purification de particules d'origine biologique, notamment de l'antigene de surface du virus de l'hepatite b (aghbs) et les produits obtenus |
| JPH0625069B2 (ja) * | 1981-01-29 | 1994-04-06 | ブリティッシュ・テクノロジー・グループ・リミテッド | Ｂ型肝炎ワクチン製造方法 |
| AU8746582A (en) * | 1981-09-02 | 1983-03-10 | Biogen N.V. | Hepatitis b virus e type antigen |
| US4721675A (en) * | 1982-02-01 | 1988-01-26 | Abbott Laboratories | Production of hepatitis A virus in vitro utilizing a persistently virus infected cell culture system |
| EP0121303B1 (en) * | 1983-03-04 | 1989-07-26 | Noctech Limited | Diagnostic agent, a process for its preparation and its use in diagnostic methods |
| US4547368A (en) * | 1983-12-20 | 1985-10-15 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services | Hepatitis B core antigen vaccine made by recombinant DNA |
| US4547367A (en) * | 1983-12-20 | 1985-10-15 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Hepatitis B core antigen vaccine |
| JPS60197629A (ja) * | 1984-03-16 | 1985-10-07 | Chemo Sero Therapeut Res Inst | ＨＢｓ抗原の精製方法 |
| JPS60258127A (ja) * | 1984-06-04 | 1985-12-20 | Green Cross Corp:The | Ｂ型肝炎ワクチンの製造方法 |
| US4683294A (en) * | 1985-04-03 | 1987-07-28 | Smith Kline Rit, S.A. | Process for the extraction and purification of proteins from culture media producing them |
| US4649192A (en) * | 1985-05-30 | 1987-03-10 | Smith Kline-Rit | Method for the isolation and purification of hepatitis B surface antigen using polysorbate |
| DE3604947A1 (de) * | 1986-02-17 | 1987-08-20 | Biotest Pharma Gmbh | Verfahren zur herstellung eines immunglobulinhaltigen praeparates und dessen verwendung zur prophylaxe und therapie von aids |
| ATE92633T1 (de) * | 1988-05-11 | 1993-08-15 | Abbott Lab | Verfahren zur erhoehung der spezifizitaet in kompetitiven immuntests. |
| BR0205774A (pt) * | 2002-02-27 | 2004-04-20 | Fundacao De Amparo A Pesquisa | Sistema adjuvante para produção de anticorpos, vacina e uso |
Family Cites Families (5)
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|---|---|---|---|---|
| US3636191A (en) * | 1969-10-08 | 1972-01-18 | Cancer Res Inst | Vaccine against viral hepatitis and process |
| SE437329B (sv) * | 1975-03-14 | 1985-02-25 | Community Blood Council | Sett att ur blodserum framstella vaccin mot virushepatit |
| GB1518582A (en) * | 1975-11-17 | 1978-07-19 | Community Blood Council | Viral hepatitis vaccine |
| DE2611723C3 (de) * | 1976-03-19 | 1978-09-21 | The Green Cross Corp., Osaka (Japan) | Verfahren zur Herstellung von einheitlichen kugelförmigen HBsAg-Teilchen |
| NL7711378A (nl) * | 1976-11-02 | 1978-05-05 | Merck & Co Inc | Werkwijze voor het bereiden van preparaten die dane-deeltjes bevatten. |
-
1977
- 1977-04-20 US US05/789,033 patent/US4102996A/en not_active Expired - Lifetime
-
1978
- 1978-02-24 CA CA297,711A patent/CA1106279A/en not_active Expired
- 1978-04-05 NL NL7803625A patent/NL7803625A/xx not_active Application Discontinuation
- 1978-04-12 IT IT48873/78A patent/IT1102573B/it active
- 1978-04-12 IE IE716/78A patent/IE46793B1/en not_active IP Right Cessation
- 1978-04-18 FR FR7811390A patent/FR2387656A1/fr active Granted
- 1978-04-18 GB GB44611/79A patent/GB1596593A/en not_active Expired
- 1978-04-18 GB GB15228/78A patent/GB1596591A/en not_active Expired
- 1978-04-18 GB GB23093/79A patent/GB1596592A/en not_active Expired
- 1978-04-18 BE BE186878A patent/BE866096A/xx not_active IP Right Cessation
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- 1978-04-19 DK DK171178A patent/DK158678C/da active IP Right Grant
- 1978-04-20 LU LU79477A patent/LU79477A1/xx unknown
- 1978-04-20 JP JP4600278A patent/JPS53133628A/ja active Granted
-
1982
- 1982-05-19 JP JP57083347A patent/JPS57201854A/ja active Pending
- 1982-05-19 JP JP57083346A patent/JPS57203016A/ja active Pending
-
1983
- 1983-01-13 JP JP58002940A patent/JPS58180430A/ja active Pending
-
1984
- 1984-06-05 SG SG418/84A patent/SG41884G/en unknown
- 1984-08-30 HK HK676/84A patent/HK67684A/xx unknown
- 1984-08-30 HK HK675/84A patent/HK67584A/xx unknown
- 1984-08-30 HK HK677/84A patent/HK67784A/xx unknown
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| IE780716L (en) | 1978-10-20 |
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| IT7848873A0 (it) | 1978-04-12 |
| DK158678C (da) | 1990-12-31 |
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