JPS6141920B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は一般的に生長ホルモン（以下、単に
「GH」と略す。）、インシユリンおよびグルカゴン
の分泌抑制に関する生物活性を有するペプチドに
関する。さらに詳細には、本発明は脳下垂体から
のGHの分泌のみを、若しくは膵臓からのグルカ
ゴンまたはインシユリンの分泌を抑制するのに有
効な、ソマトスタチンよりも少数のアミノ酸基を
有するペプチドに関する。 本発明の様々なペプチド類は生長ホルモン、イ
ンシユリン、およびグルカゴンの分泌抑制に関し
て選択的な生理学的活性を有している。 生長ホルモンの分泌抑制効果を有するペプチド
はグイレミン（Guillemin）等の米国特許第
3904594号明細書に、その特性などが開示されて
いる。このペプチドは、“ソマトスタチン
（Somatostatin）”と命名されている。ソマトスタ
チン（別名、ソマトトロピン放出抑制因子。）は
テトラデカプチドであり、下記の構造を有する： ソマトスタチン、鎖状のソマトスタチン（ジヒ
ドロソマトスタチン）およびソマトスタチンなら
びにジヒドロソマトスタチンの各種アシル化誘導
体は前記の米国特許出願明細書に開示されてい
る。 ソマトスタチンおよび多数のソマトスタチン類
似体は、試験管内で培養され、分散されたラツト
の下垂体前葉細胞からのGH分泌抑制およびラツ
トのインシユリンおよびグルカゴンの生体内分泌
抑制に関して活性を示す。GH、インシユリンま
たはグルカゴンの分泌のみを選択的に抑制するの
にはソマトスタチンを使用することが望ましいと
大いに考究される様になつた。選択的生物活性を
有し、かつGH、インシユリンまたはグルカゴン
の分泌のみを抑制するソマトスタチン類似体の開
発に対する努力がなされてきた。ヒトおよび潅流
ラツトの膵臓を用いるインビトロ試験ではグルカ
ゴンに比較してインシユリンの抑制に必要なソマ
トスタチンの量が異なることを引証した報告が存
在するが、ソマトスタチンおよび若干のソマトス
タチン類似体はこれら二種のホルモンのインビボ
での抑制に関してはほぼ同等の力価を示す。 ソマトスタチンおよびジヒドロソマトスタチン
ペプチド中で特定のアミノ酸類を除去および／ま
たは配列し直すことによつて、少数のアミノ酸成
分を有し、そして、生長ホルモン、インシユリン
またはグルカゴンの分泌抑制に関する生物活性を
有する新規なペプチドを提供できることが本発明
者によつて発見された。本発明の新規なペプチド
のうちいくつかのものは選択的な活性を有してい
る。ソマトスタチンまたはジヒドロソマトスタチ
ンよりも少数のアミノ酸成分を有する本発明の新
規なペプチド類は極めて重要であると思われる。
なぜなら、これらのペプチド類は比較的に容易に
製造できるからである。 本発明の新規なペプチド類は次式： 〔式中、R₁はAsnまたはdesR₁であり；R₂は
TrpまたはＤ―Trpであり；R₄はThrまたは
desR₄であり；そしてＲはCysまたはＤ―Cysで
ある〕 を有するペプチドまたはその鎖状ペプチドであ
る。即と、本発明のペプチド類は次式（）で表
わされる鎖状ペプチドおよび次式（）で表わさ
れる環状ペプチドである。 （） Cys：―R₁―Phe―Phe―R₂―Lys―Thr―Phe―R₄―Ｒ （） 〔式中、R₁，R₂，R₄およびＲは上記と同じ意
味を有する〕 本発明のペプチドの説明に使用する術語は、通
俗名の最初の三文字を使用する通常の慣例に従つ
て付されたものである。また、前記の要領に従
い、他の方法で特に示さなければ、術語は企図し
たアミノ酸のうちＬ形のものを示す。 また、ペプチドの医薬的に許容しうる酸付加塩
も本発明の範囲内に含まれる。該酸付加塩の例と
しては、塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、リン酸
塩、マレイン酸塩、酢酸塩、クエン酸塩、安息香
酸塩、コハク酸塩、リンゴ酸塩、アスコルビン酸
塩、酒石酸塩等である。しかし、これらに限定さ
れるものではない。 また、本発明の範囲にあると思料されるものは
下記の式： （） Ｘ―Cys（X¹）―R₁―Phe ―Phe―R₂―Lys（X²）―Thr（X³） ―Phe―R₄（X⁴）―Ｒ（X⁶）―R₆ （式中、Ｘは水素原子またはα―アミノ保護基
のいずれかである。）で示される中間体類であ
る。Ｘで示されるα―アミノ保護基はポリペプチ
ドの段階合成において有用であると当業者に知ら
れているものである。Ｘは示されるα―アミノ保
護基の種類のうち、例えば次のものがある。 (1) ホルミル、トリフルオロアセチル、フタリ
ル、トルエンスルホニル（トシル）、ベンゼン
スルホニル、ニトロフエニルスルフエニル、ト
リチルスルフエニル、ｏ―ニトロフエノキシア
セチル、クロロアセチル、アセチル等の様なア
シル型保護基； (2) ベンジルオキシカルボニルおよびｐ―クロロ
ベンジルオキシカルボニル、ｐ―ニトロベンジ
ルオキシカルボニル、ｐ―ブロモベンジルオキ
シカルボニル、ｐ―メトキシベンジルオキシカ
ルボニル等の置換ベンジルオキシカルボニルの
様な芳香族ウレタン型保護基； (3) α―ｔ―ブチルオキシカルボニル、ジイソプ
ロピルメトキシカルボニル、イソプロピルオキ
シカルボニル、エトキシカルボニル、アリルオ
キシカルボニルの様な脂肪族ウレタン型保護
基； (4) シクロペンチルオキシカルボニル、アダマン
チルオキシカルボニル、シクロヘキシルオキシ
カルボニルの様な脂環式ウレタン型保護基； (5) フエニルチオカルボニルの様なチオウレタン
型保護基； (6) トリフエニルメチル（トリチル）、ベンジル
の様なアルキル型保護基；および (7) トリメチルシランの様なトリアルキルシラン
基 などがある。Ｘで示されるα―アミノ保護基のう
ち好ましいものはｔ―ブチルオキシカルボニルで
ある。 X¹およびX⁶は各々、Cys用の保護基であり、Ｓ
―ｐ―メトキシベンジル、Ｓ―ｐ―メチルベンジ
ル、Ｓ―アセタミドメチル、Ｓ―トリチル、Ｓ―
ベンジル等から成る群から選択される。好ましい
保護基はＳ―ｐ―メトキシベンジルである。X¹
および／またはX⁶は水素であり得、これは硫黄
基上に保護基が存在しないことを意味する。 X²は、リジンの側鎖アミノ置換基用の保護基
であるか、若しくはX²は水素原子であり、側鎖
アミノ置換基上に保護基が存在しないことを意味
する。適当な側鎖アミノ保護基の例としては、ベ
ンジル、クロロベンジルオキシカルボニル、ベン
ジルオキシカルボニル、トシル、ｔ―アミルオキ
シカボニル、ｔ―ブチルオキシカルボニル等があ
る。保護基は合成過程におけるα―アミノ基の脱
保護中に除去されない様なものでなければならな
いことを除いて、前記の側鎖アミノ保護基の選定
は本発明の絶対要件ではない。従つて、α―アミ
ノ保護基と側鎖アミノ保護基は同一とはなり得な
い。 X³およびX⁴はThrのヒドロキシ基用の保護基で
あり、アセチル、ベンゾイル、ｔ―ブチル、トリ
チル、テトラヒドロピラニル、ベンジル、２，６
―ジクロロベンジルおよびベンジルオキシカルボ
ニルから成る群から選択される。好ましい保護基
はベンジルである。X³および／またはX⁴は水素
原子であり得、これはヒドロキシル基上に保護基
が存在しないことを意味する。R₁，R₂，R₄およ
びＲは前記に定義したとうりである。R⁶は―
OH、―OCH₃、エステル類、アミド類、ヒドラ
ジド類、および、式 ―Ｏ―CH₂―ポリスチレン樹脂支持体 および Ｏ―CH₂―ベンジル―ポリスチレン樹脂支持体 で示される固体樹脂支持体に結合した固相合成で
使用するベンジルエステル固着結合またはヒドロ
キシメチルエステル固着結合から成る群から選択
される。前記重合体は架橋剤としてジビニルベン
ゼン約0.5〜2.0％を有するスチレンの共重合体で
あることが好ましい。架橋剤はポリスチレン重合
体を特定の有機溶剤に対し完全に不溶性とする。
前記の式において、Ｘ、X¹，X²，X³，X⁴およ
びX⁶のうち少なくとも一つは保護基である。 式または式のペプチドの合成に使用すべき
特定の側鎖保護基の選定においては、次の規則に
従わなければならない。 (a) 保護基は反応試薬に対し安定であり、しか
も、合成の各工程でα―アミノ保護基の除去に
関して選択された反応条件下で安定でなければ
ならない： (b) 保護基はその保護特性を維持しなければなら
ない。従つて、カツプリング条件下で分離され
てはならない： (c) 側鎖保護基は、所望のアミノ酸生成物を含有
する合成が終了したとき、ペプチド鎖を変質さ
せない様な反応条件下で除去可能でなければな
らない。 式および式のペプチドは固相合成法を用い
て合成できる。この合成はα―アミノ保護樹脂を
使用し、ペプチドのＣ末端から開始される。該出
発物質はα―アミノおよびＳ―保護Cysをクロロ
メチル化樹脂またはヒドロキシメチル樹脂に結合
させることによつて生成できる。ヒドロキシメチ
ル樹脂の生成はボタンツキー（Bodanszky）等に
よつてChem.Ind.（ロンドン）38，1597―98
（1966）に開示されている。クロロメチル化樹脂
はカリフオルニア州、リツチモンドにあるバイオ
ラドラボラトリース（Bio Rad
Laboratories）から市販されている。また、該樹
脂の生成はスチユワート（Stewart）等によつて
“固相ペプチド合成（Solid Phase Peptide
Synthesis）”（サンフランシスコのフリーマン社
によつて発行された。）、第１章、１〜６頁に開示
されている。α―アミノとＳ―保護Cysは、マナ
ハン（Monahan）とギロン（Gilon）によつて
“バイオポリマー（Biopolymer）12，2513〜19頁
（1973）に開示された方法によつてクロロメチル
化樹脂に結合される。α―アミノおよびＳ―保護
Cysの樹脂支持体への結合につづいて、α―アミ
ノ保護基を例えば、塩化メチレン中のトリフルオ
ロ酢酸、トリフルオロ酢酸単独またはジオキサン
中のHClを使用することによつて除去する。脱保
護は約０℃〜室温の範囲の温度で行なう。 シユロダー（Schroder）およびルブケ
（Lubke）によつて“ペプチド（The
Peptides）”１，72〜75頁（アカデミツクプレス
社1965年発行）に開示されている様に、特定のα
―アミノ保護基を除去するためその他の標準的開
裂剤および条件が使用できる。 Cysのα―アミノ保護基を除去した後、残つた
α―アミノと側鎖保護アミノ酸を所望の順序で段
階的にカツプリングし、式の化合物を得るか、
或いは各アミノ酸を個別に合成物に付加していく
かわりに、いくつかのアミノ酸を固相反応器に加
える前にあらかじめカツプリングしておくことも
できる。適当なカツプリング剤の選定は当業者に
公知である。カツプリング剤として特に好適なの
はＮ，N¹―ジシクロヘキシルカルボジイミドで
ある。 ペプチドの固相合成で使用する活性化剤はペプ
チド合成にたずさわる当業者に周知である。適当
な活性化剤の例は (i) Ｎ，Ｎ―ジイソプロピルカルボジイミド、Ｎ
―エチル―N¹―（ｙ―ジメチルアミノプロピ
ルカルボジイミド）の様なカルボジイミド類； (ii) Ｎ，Ｎ―ジベンジルシアナミドの様なシアナ
ミド類； (iii) ケテイミン類； (iv) Ｎ―エチル―５―フエニルイソオキサゾリウ
ム―3¹―スルホネートの様なイソオキサゾリウ
ム塩類； (v) イミダゾライド類、ピラゾライド類、１，
２，４―トリアゾライド類の様な環中にチツ素
原子を１個〜４個含有する芳香族性の単環式チ
ツ素含有異項環アミド類。好適に用いうる異項
環アミドにはＮ，N¹―カルボニルジイミダゾ
ール、Ｎ，N¹―カルボニル―ジ―１，２，４
―トリアゾールが含まれる； (vi) エトキシアセチレンの様なアルコキシル化ア
セチレン； (vii) アミノ酸のカルボキシル部分と混和無水物を
生成する化合物、例えばエチルクロロホルメー
トおよびイソブチルクロロホルメートなど；お
よび (viii) 一つの環チツ素上にヒドロキシ基を有するチ
ツ素含有異項環化合物、例えばＮ―ヒドロキシ
フタルイミド、Ｎ―ヒドロキシサクシンイミド
および１―ヒドロキシベンゾトリアゾールなど
である。その他の活性化剤およびペプチドのカ
ツプリングにおけるそれらの使用法はシユロダ
ーおよびルブケの前掲書第２章、およびカツパ
ー（Kappoor）によるJ.Pham.Sci.，59，１〜
27頁（1970）に開示されている。 各保護アミノ酸またはアミノ酸―連結合物を約
４倍過剰量で固相反応器に導入し、カツプリング
（連結）反応をジメチルホルムアミドと塩化メチ
レンの１対１混合溶剤中、またはジメチルホルム
アミド若しくは塩化メチレンの単独溶剤中で行な
う。不完全なカツプリングが起つた場合、α―ア
ミノ保護基を除去する前にカツプリング手順を再
度くりかえし、その後次のアミノ酸をカツプリン
グする。各合成工程でのカツプリング反応の首尾
はニンヒドリン反応によつて観測する。このニン
ヒドリン反応についてはイー・カイサー（E.
Kaiser）等がAnalyt.Biochem.，34，595
（1970）に開示している。 式の所望のアミノ酸配列を合成した後、液状
フツ化水素の様な試薬で処理することによつて樹
脂支持体からペプチドを除去する。このフツ化水
素はペプチドを樹脂から開裂するばかりでなく残
つている全ての側鎖保護基X¹，X²，X³，X⁴およ
びX⁶ならびにα―アミノ保護基Ｘをも除去し、
式の鎖状ペプチドを直接に生成する。式の環
状ペプチドは式のペプチドを常法に従つて酸化
することによつて得られる。すなわち、リビエル
（Rivier）らがバイオポリマース
（Biopolymers），17，1927−1938，1978に記載し
た方法に従つて、式のペプチド（鎖状ペプチ
ド）を１％酢酸に溶解し、フエリシアン化カリウ
ム溶液中に滴下しながら加えると、Cys残基間に
ジスルフイルド結合（Ｓ−Ｓ結合）が生じ、式
のペプチド（環状ペプチド）が生成する。また式
のペプチドは空気中で容易に酸化されて式の
ペプチドとなる。 別法として、樹脂支持体に結合したペプチドは
アルコール分解し、その後回収されたＣ―末端メ
チルエステルを加水分解して酸に変換することに
よつて樹脂から分離できる。いずれの側鎖保護基
も、その後前記の様にして、若しくはTrp部分を
害せずに保つ様な条件を用いる接触還元（例えば
BaSO₄に担持したPd）の様なその他の方法によ
つて除去できる。除去にフツ化水素を使用する場
合、アニソールをスカベンジヤーとして反応容器
中に配合する。 前述の固相合成方法は当業者に周知であり、か
つ、メリーフイールド（Merrifield）によつてJ.
Am.Chem.Soc.，85，2149頁（1964）に本質的に
開示されている。 GH、インシユリンおよびグルカゴンの分泌抑
制に関する選択的効果を有する本発明のペプチド
は糖尿病の治療に特に重要であると思料される。
糖尿病の伝統的な見解によれば、その病気がイン
シユリン生成の障害によつてのみ発生する病気で
あるとされてきた。しかし臨床および研究の経験
が一層広範囲にわたる様になるにつれて、インシ
ユリン分泌の障害に加えて、若干の因子が糖尿病
に作用することが明らかとなつた。糖尿病におい
てはインシユリンは通常不足するが、グルカゴン
は通常過剰に存在することが知られている。今
日、グルカゴンの存在は少なくとも、インシユリ
ンの不存在と同様に糖尿病における重要な因子で
ある。 インシユリンの不足は通常グルカゴンの過剰存
在に随伴されるという事実は、糖尿病におけるグ
ルカゴンの役割の研究を難解にしている。余分な
量のホルモン（例えばインシユリン）を添加する
のは容易であるが、グルカゴンの濃度を低下させ
ることが極めて困難であることが証明された。ソ
マトスタチンの発見は糖尿病におけるグルカゴン
の役割に関する研究を促進した。ソマトスタチン
はインシユリンおよびグルカゴンの双方の分泌を
抑制する。糖尿病研究におけるソマトスタチンの
役割は“サイエンス（Science）”，188巻，920〜
923頁、1975年５月30日発行にのつた論文に詳述
されている。しかしながら、糖尿病治療剤として
ソマトスタチンを使用することに関してはいくつ
かの問題がある。ソマトスタチンはグルカゴンと
共にインシユリンの分泌をも抑制する。従つて、
糖尿病治療に関連してインシユリンおよびグルカ
ゴンの分泌抑制に関して選択的な効果を有するペ
プチドの必要性が認識されてきた。本発明の新規
なペプチドはこのような選択的効果を提供する。
より詳細には、本発明の特定なペプチドはインシ
ユリンの分泌は抑制しないが、グルカゴンの分泌
を抑制するのに有効である。 本発明のペプチド類はソマトスタチンおよび公
知のソマトスタチン類似体の利点をもたらす。し
かし、最も周知のソマトスタチン類似体が12〜14
個のアミノ酸を有するのに比較して、本発明のペ
プチド類は一層少数、例えば８〜10個のアミノ酸
しか有していない。従つて、本発明のペプチドは
製造が比較的に容易であるため顕著な経済的利点
を有する。 次の実施例は本発明の各種の特徴を例証するも
のである。しかしながら、本発明の範囲はこれら
実施例によつて制限されるものではない。 実施例 １ 本発明のペプチドは一般に米国特許第3904595
号明細書に記載された方法に従う固相法により合
成した。この合成はクロロメチル化樹脂上で段階
的に行なつた。この樹脂はスチレンと１〜２％の
ジビニルベンゼンとの共重合により製造された合
成樹脂の微細ビーズ（直径20〜70ミクロン）から
構成されたものであつた。この樹脂のベンゼン核
を、フリーデル・クラフツ反応によりクロロメチ
ルエーテルおよび塩化第二スズを用いてクロロメ
チル化した。このようにして導入された塩素は、
反応性の塩化ベンジル型の結合である。フリーデ
ル・クラフツ反応は、樹脂がその1g当り0.5〜２
ミリモルの塩素を含有するまで、行なう。以下に
ペプチドの合成について更に説明するが、使用し
た反応成分はまずその化学名を記載し、そしてカ
ツコ内にその普通の略号を記載する。それ以降に
おいては、反応成分は普通の略号で示す。 下記の構造式、 Ｈ―Cys―Phe―Phe―Trp―Lys―Thr―Phe―
Cys―OHで示されるペプチドを下記に述べる様
な固相法によつて合成した。前記したその他のペ
プチドも同様な方法により合成した。 Cysのターシヤリ―ブチルオキシカルボニル―
Ｓ―パラメトキシベンジル（Boc―SpOMe―
Bzl）誘導体を次の三つの方法のいずれかによつ
て樹脂に結合した：(i)トリエチルアミンの存在下
エタノール中で還流される；(ii)Boc保護アミノ酸
のセシウム塩を一晩ジメチルホルムアミド
（DMF）中で50℃に保つ；(iii)Boc保護アミノ酸の
カリウム塩を２時間ジメチルスルホキシド
（DMSO）中で80℃に保つ。樹脂上Cl1ミリ当量
（mEq）あたり保護Cys1mEqのみを使用した。
方法(iii)を下記にさらに詳細に説明する：樹脂およ
びDMSO中に溶解した保護Cysのスラリーにアミ
ノ酸1mEqあたりターシヤリーブトキサイドカリ
ウム（KOtBut）0.9mEqを添加した。琥珀色が観
察されない様にできるだけ短時間その反応混合物
を空気に暴露した。温度80℃で２時間反応させる
と好適なペプチド合成用の置換樹脂が生成した
（樹脂1gあたりアミノ酸誘導体約0.2mEq）。脱保
護および中和後、ペプチド鎖を樹脂上に構築し
た。脱保護、中和および各アミノ酸の添加は以下
のスケジユール１に従つて行なつた。各アミノ酸
のＮ〓―ｔ―ブチルオキシカルボニル（Boc）誘
導体を使用した。スケジユール１（工程３〜８）
に従つて第１の残基（即ち、SpOMe Bzl Cys）
を脱保護した後、カツプリング剤、例えば、ジシ
クロヘキシルカルボジイミド（DCC）と共にThr
のNBoc誘導体を次に添加した（スケジユール１
の工程９）。Thrの側鎖はＯ―ベンジルエーテル
（OBzl）で保護した。Lys側鎖の保護基として、
ベンジルオキシカルボニル（Ｚ）またはベンジル
オキシカルボニル―2Cl〔Ｚ（２―Cl）〕を使用
した。

【表】 工程13の後、アリコートをニンヒドリン試験用
に採取する。この試験が陰性であるとき、次のア
ミノ酸をカツプリングするために工程１にもど
り、この試験が陽性ないし多少陽性であるとき、
工程９〜13にもどる。ペプチドの各アミノ酸を
Cysに結合させるのに前記スケジユール１を使用
した。 樹脂（5g）からのペプチドの開裂およびペプ
チドの側鎖保護基の脱保護は、８mlのアニソール
の存在下にフツ化水素酸（75ml）中で行なつた。
高真空下にフツ化水素酸を除去した後、樹脂―ペ
プチドをエーテルで洗浄した。 乾燥樹脂を25％酢酸150mlで迅速に抽出し、そ
して脱ガス水H₂O（N₂）で3000mlに稀釈した。溶
液のPHをNH₄OHで6.6〜7.0に調節した。その溶
液を撹拌しながらフエリシアン化カリウム溶液
（1g／500mlH₂O）で恒久的な黄色が観察されるま
で滴下して滴定した。溶液を10分間放置し、か
つ、PHを氷酢酸で5.0に調節した。BiO―Rad
AG3−X4A樹脂（100−200メツシユ、塩化物形、
10−15g）を濁り溶液に添加し、そして、15分間
撹拌した。溶液をセライトを通してロ過し、そし
て、次の二種のカラムを連続的に通した：(a)Bio
Rad AG3−X4A樹脂（塩化物形、10ml）；(b)Bio
ReX−70樹脂（カチオン形、100ml）。洗浄として
前記カラム(a)および(b)に適用された様な水でセラ
イトと樹脂のケーキを完全に洗浄した。それから
ペプチド物質をピリジン：酢酸：水（30：４：
66）または50％酢酸でBio ReX−70樹脂カラムか
ら溶出した。画分を捕集した。ペプチドを含有す
る画分（ニンヒドリン反応陽性）のみを水で希釈
し、そして、ただちに凍結乾燥した。クリーム色
に着色した粗物質950mgを得た。その物質を平衡
化したSephadexG−25Fゲルカラム（３×200
cm）に通し、そして2Nの酢酸で溶離した。 280nm（ナノメーター、以下同じ）で観察した
溶離パターンは一つの大きな対称的なピークを示
した。凍結乾燥後、中央留分として550mg得た。
これを続いて、下層として管あたり10mlを用いる
向流分配（溶剤系：ｎ―ブタノール対酢酸対水＝
４対１対５）に付した。100回分配した。その結
果、主要なピークは第57〜68番目のものに見られ
た。化合物（250mg）はTLCによつて均一である
ことが判明した。 かくして得られた環状ペプチドの比旋光度は
〔α〕^２３ _Ｄ＝−67.8゜±２（ｃ＝１、１％酢酸中）で
あつた。この物質のアミノ酸分析は各種のアミノ
酸について予期した比率を示した。 活性エステルを固相合成に使用でき、そして古
典的合成法を使用して本発明のペプチドを製造す
ることもできる。 インビトロ効力検定 本発明の各種ペプチドの効果をバーレ
（Vale）等によつてEndocrinology，91，562頁〜
571頁（1972）に開示された方法によつて酵素的
に解離されたラツトの下垂体前葉細胞の初期培養
によるGHの分泌に関しインビトロで試験した。
この効力検定はラツトから切除した下垂体を処理
して細胞をそれから分離することによつて行な
う。この細胞をダルベコの変性イーグル培地
（Dulbecco′s Modified Eagle Medium）（ダルベ
コ等、Virology，８巻、p396，1949）の入つた培
養皿に置く。この細胞培地に二酸化炭素と酸素を
供給し、効力検定使用前37℃に４〜５日間保持す
る。培地を変えた後、細胞培養物を４時間培養
し、これに特定のソマトスタチンペプチドを加え
る。放射線免疫効力検定分析
（radioimmunoassay analysis）を用いて、ナノ
グラム（ng）／時で表わした生長ホルモンの分
泌速度を決定する。 グルカゴンおよびインシユリンの分泌抑制に関
するソマトスタチン（対照）、ジヒドロソマトス
タチン（対照）ならびに本発明のペプチドの効果
試験を次の様にして行なつた： インビボ効力検定 スプラークードーレイ（Sprague―Dawley）
種の雄ラツト（体重180−220g）を14時間光線
（７時〜21時まで光線をあてる。）をあてそして10
時間暗黒にし、温度および湿度を調節した場所で
飼育し、全ての試験に、このラツトを使用した。
ラツトには標準的なエサをやり、かつ、随意に水
を飲ませた。1400〜1600時間の間に供給者からラ
ツトが致着した後少なくとも５日目に試験を行な
つた。エーテルで麻酔した後、ペプチドまたは生
理食塩水0.2mlを外部頚静脈を経て投与した。門
脈から血液を採取する時期までラツトを麻酔状態
に維持した。血液サンプルを、血液１mlあたり
EDTA10mgと2Mベンズアミジン50μを含有す
る冷却された管中においた。 血漿をインシユリンとグルカゴン測定のために
−20℃で貯蔵した。インシユリンレベルをJ.
Chem.Endocr.Metab.25，1375（1965）に開示さ
れたハーバート（Herbert）等の方法によつて測
定した。この方法はブタインシユリン抗血清と
I¹²⁵−ヨウ化インシユリントレーサーを使用す
る。ヒトインシユリン標準品はシユワルツマン
（ニユーヨーク州、オレンジバーク）（Schwary―
Mann，Orangeburg，New York）から得た。グ
ルカゴンはヤツフエ（Jaffe）等の編集した“メ
ソツド オブ ホルモン ラジオイムノアツセイ
（Methods of Hormone Radioimmunoassay）”
（アカデミツクプレス、ニユーヨーク）、317頁
（1974）におけるフアローナ（Faloana）とウン
ゲル（Unger）の方法によつて測定した。この方
法はグルカゴン抗血清30Kを使用する。グルコー
スはベツクマン グルコース アナライザ−
（Beckman Glucose Analyzer）を使用してグル
コース酸化酵素法によつて測定した。 GH測定は下記の試薬を使用する組織培養用培
地上で行なつた： NIAMDDラツトGH標準品（GH―RP―１）； NIAMDDモンキー抗ラツトGH（GH―血清―
３）； およびヨウ素化用高純度ラツトGH。 全ての測定は非規則的な遮断配列で行なつた。
次の処理間の差異の分散分析をダネツト
（Dunnett）とダンカン（Duncan）の多重範囲テ
ストによつて測定した。力価は４または６点効力
検定から算出した。 本発明の各種ペプチドを前記した固相合成法に
よつて製造した。各ペプチドの組成を次の表１に
示す。これらのペプチドはいずれも環状ペプチド
である。また、表１はソマトスタチンを基準とし
て、GH、インシユリンおよびグルカゴンの分泌
抑制に対するペプチドの効力比を示す。 また、各ペプチドの旋光度も併せて表１に示
す。旋光度〔α〕^２３ _Ｄの測定条件は実施例１と同じ
である。

【表】 本発明のペプチドのED₅₀値は体重100gあたり
10μｇである。またLD₅₀値は体重100gあたり１
mg以上である。 本発明のペプチドは単独で、あるいは適当な製
剤担体と共に哺乳類に対し、経口的に、あるいは
非経口的に投与できる。非経口投与は、該ペプチ
ドを哺乳類の血流中に直接的または間接的に注入
することによつて実施できる。従つて、静脈注、
筋肉注あるいは皮下注などの各方法によつて投与
できる。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 式： 〔式中、R₁はAsnまたはdesR₁であり；R₂は
   TrpまたはＤ―Trpであり；R₄はThrまたは
   desR₄であり；そしてＲはCysまたはＤ―Cysで
   ある〕 を有するペプチドまたはその鎖状ペプチド。 ２ R₁がdesR₁であり、R₂がＤ―Trpであり、R₄
   がdesR₄でありそしてＲがCysである特許請求の
   範囲第１項記載のペプチド。 ３ R₁がdesR₁であり、R₂がＤ―Trpであり、R₄
   がdesR₄でありそしてＲがＤ―Cysである特許請
   求の範囲第１項記載のペプチド。 ４ R₁がdesR₁であり、R₂がＤ―Trpであり、R₄
   がThrでありそしてＲがCysである特許請求の範
   囲第１項記載のペプチド。 ５ R₁がAsnであり、R₂がＤ―Trpであり、R₄が
   desR₄でありそしてＲがCysである特許請求の範
   囲第１項記載のペプチド。 ６ R₁がAsnであり、R₂がTrpであり、R₄がThr
   でありそしてＲがCysである特許請求の範囲第１
   項記載のペプチド。 ７ R₁がAsnであり、R₂がＤ―Trpであり、R₄が
   ThrでありそしてＲがCysである特許請求の範囲
   第１項記載のペプチド。