JPS6146118B2 - - Google Patents
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- Publication number
- JPS6146118B2 JPS6146118B2 JP52133005A JP13300577A JPS6146118B2 JP S6146118 B2 JPS6146118 B2 JP S6146118B2 JP 52133005 A JP52133005 A JP 52133005A JP 13300577 A JP13300577 A JP 13300577A JP S6146118 B2 JPS6146118 B2 JP S6146118B2
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- JP
- Japan
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- lysine
- present
- enzyme
- reagent
- amount
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- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Description
本発明は、Ｌーリジンの定量分析用試薬に関す
るものである。
本発明の目的は、食品、培養液、臨床検査用検
体などに含有されるＬーリジンの定量分析用試薬
を提供するものである。
本発明分析用試薬の特徴はＬーリジンに特異性
の高いＬーリジン−α−ケトグルタール酸−ε−
トランスアミナーゼ（以下酵素という）および
Ｌ−グルタミン酸脱水素酵素（以下酵素とい
う）を使用することにより他のアミノ酸の存在下
でもＬーリジンのみを簡単な操作で、短時間にし
かも極めて正確に、測定するところにある。
従来、Ｌーリジンの定量法としては、マイクロ
バイオアツセイ法や、検圧法などがあるが、これ
らは、Ｄ−およびＬーリジン双方に反応し、しか
も操作が繁雑である欠点を有している。
本発明者らは、上記の欠点を有しない、Ｌーリ
ジンのみを定量できて、操作が簡便な紫外吸収度
測定法に用いる分析用試薬について、研究を重ね
た結果、酵素および酵素を含有する本発明試
薬を利用することによりＬーリジンを高精度で定
量できることを見出して本発明を完成した。
本発明の反応を詳述すると、Ｌーリジンを含有
する分析対象物に酵素と、充分量のα−ケトグ
ルタール酸を、補酵素ピリドキサール−5′−リン
酸の存在下で、トランスアミナーゼ作用をさせ
て、α−アミノアジピン酸δ−セミアルデヒドと
Ｌ−グルタミン酸とを生成する。
生成したＬ−グルタミン酸は、酵素および補
酵素NAD又はNADPの存在下で、その脱水素反
応により、α−ケトグルタール酸とNH3と
NADH2又はNADPH2とを生成する。
生成したNADH2又はNADPH2は、紫外部の特
定の波長域において、吸収を示すので、この紫外
部吸収度を測定する。即ち、Ｌーリジンから、充
分量のα−ケトグルタール酸の存在下で、当モル
のＬ−グルタミン酸が生成し、更に当モルの
NADH2又はNADPH2を生成するので、NADH2又
は、NADPH2を測定することにより、分析対象物
中のＬーリジンの量が決定される。これを化学式
を用いて説明すれば、次の如くなる。
The present invention relates to a reagent for quantitative analysis of L-lysine. An object of the present invention is to provide a reagent for quantitative analysis of L-lysine contained in foods, culture fluids, specimens for clinical testing, and the like. The analytical reagent of the present invention is characterized by its high specificity for L-lysine-α-ketoglutaric acid-ε-
By using transaminase (hereinafter referred to as the enzyme) and L-glutamic acid dehydrogenase (hereinafter referred to as the enzyme), L-lysine alone can be measured easily, in a short time, and extremely accurately even in the presence of other amino acids. It is in. Conventional methods for quantifying L-lysine include a microbioassay method and a pressure detection method, but these methods react with both D- and L-lysine and have the drawback of being complicated to operate. The present inventors have conducted extensive research on analytical reagents for use in ultraviolet absorbance measurement methods that do not have the above drawbacks, can quantify only L-lysine, and are easy to operate. The present invention was completed by discovering that L-lysine can be quantified with high accuracy by using the invented reagent. To describe the reaction of the present invention in detail, an enzyme and a sufficient amount of α-ketoglutaric acid are allowed to act as a transaminase on an analyte containing L-lysine in the presence of the coenzyme pyridoxal-5'-phosphate. α-aminoadipic acid δ-semialdehyde and L-glutamic acid are produced. The generated L-glutamic acid is converted into α-ketoglutaric acid and NH 3 through its dehydrogenation reaction in the presence of an enzyme and coenzyme NAD or NADP.
Generates NADH 2 or NADPH 2 . Since the generated NADH 2 or NADPH 2 exhibits absorption in a specific wavelength range of ultraviolet light, this ultraviolet absorbance is measured. That is, from L-lysine, in the presence of a sufficient amount of α-ketoglutaric acid, an equimolar amount of L-glutamic acid is produced, and an equimolar amount of L-glutamic acid is produced from L-lysine.
Since NADH 2 or NADPH 2 is produced, the amount of L-lysine in the analyte is determined by measuring NADH 2 or NADPH 2 . This can be explained using a chemical formula as follows.
【表】
ここで生成したNADH2又はNADPH2は特定の
波長域に吸収を持ち、これの紫外吸収度を測定す
ることによつて、高精度の分析値が得られる。
これが本発明の特長なのである。
次に製造法について説明する。
本発明試薬は、Ｌーリジン−α−ケトグルター
ル酸−ε−トランスアミナーゼとＬ−グルタミン
酸脱水素酵素、補酵素およびα−ケトグルタール
酸を混合して製造するが、製造の一例をあげれば
後記第２表に示すような成分含量と成分液量をも
つた各成分を混合してつくる。
本発明に使用する該酵素は、酵素生産能を
有する。
アクロモバクタ− リクイダム
（Achromobacter liquidum）IFO 3084
フラボバクテリウム フスカム
（Flavobacterium fuscum）IFO 12997
フラボバクテリウム フラベセンス
（Flavobacterium flavescens）
のうち、いずれか１種又は２種以上の菌種を液体
培養し、その菌体より酵素を採取する。
この酵素は、精製結晶化した標品でもよい
し、部分精製酵素でも合目的に使用できる。
酵素は、EC class 2.6.1.36である。
本発明に使用する該酵素は、微生物起源で、
NADを補酵素とするものに、EC class 1.4.1.2が
あり、同じく微生物起源で、NADPを補酵素とす
るものにEC class1.4.1.4がある。
又動物起源でNADを補酵素とするものにEC
class1.4.1.3があり試薬として市販されている。
こられ３種とも、本発明に於て有効に使用でき
る。
本発明試薬を用いる場合の反応温度は、酵素
およびの最高温度30〜40℃とりわけ37℃が望ま
しい。その反応時間は、酵素およびの必要反
応時間60分間が望ましく、反応液のPHは、酵素
およびの最適PH7.5〜8.5とりわけPH8.2が望まし
い。
本発明試薬によるＬーリジン塩酸塩の定量可能
範囲は、標準的な反応液組成物の場合0.025〜
0.15μmoleであり、この範囲内においてＬーリジ
ンの量と紫外吸収度の間には、直線関係が成立す
る。
本発明を構成する標準的な試薬の組成物の場
合、α−ケトグルタール酸は充分量を含有する必
要があり、分析対象物であるＬーリジン塩酸塩の
定量範囲は0.025〜0.15μmoleの場合は、α−ケ
トグルタール酸は3.0μmoleを含有するのが望ま
しい。
酵素は補酵素としてピリドキサール−５−燐
酸を必要とするので、反応液組成物は、必要量の
ピリドキサール−５−燐酸を含有する。
反応液のPHは燐酸カリウム緩衝液でPH8.2に保
つ。
必要な反応時間経過後は、反応を停止させるた
めH2O2を必要量添加する。
反応の結果、分析対象物中に元来存在していた
Ｌーリジンの量に比例して、NADH2又は
NADPH2が生成する。このNADH2又はNADPH2
に吸収極大は、紫外波長域の340nmにある。
本発明に使用する該酵素は、基質特位性を持
ちＬーリジンにのみ作用する。この基質特異性を
利用して、分析対象物中のＬーリジンを定量でき
るのであり、分析対象物中に、他のＬ−アミノ酸
やＤ−アミノ酸やα−ケト酸が共存しても、定量
分析には何らの影響も与えない。
以下実施例において本発明の分析用試薬とこれ
を用いたＬーリジンの分析操作を説明する。
実施例
本発明の分析用試薬に分析対象物を加えて下記
第２表に示すような酵素反応液を調整した。
補酵素としてはNADを使用した。[Table] NADH 2 or NADPH 2 produced here has absorption in a specific wavelength range, and highly accurate analytical values can be obtained by measuring its ultraviolet absorbance. This is a feature of the present invention. Next, the manufacturing method will be explained. The reagent of the present invention is produced by mixing L-lysine-α-ketoglutarate-ε-transaminase, L-glutamate dehydrogenase, a coenzyme, and α-ketoglutarate; an example of its production is shown in Table 2 below. Prepare by mixing each component with the component content and component liquid volume as shown. The enzyme used in the present invention has enzyme production ability. Achromobacter liquidum
(Achromobacter liquidum) IFO 3084 Flavobacterium fuscum (Flavobacterium fuscum) IFO 12997 Flavobacterium flavescens (Flavobacterium flavescens) One or more species of bacteria are cultured in liquid, and enzymes are collected from the bacterial bodies. do. This enzyme may be a purified, crystallized standard product, or a partially purified enzyme may be used for any purpose. The enzyme is EC class 2.6.1.36. The enzyme used in the present invention is of microbial origin,
There is EC class 1.4.1.2 which uses NAD as a coenzyme, and EC class 1.4.1.4 which is also of microbial origin and uses NADP as a coenzyme. In addition, EC is derived from animals and uses NAD as a coenzyme.
It has class 1.4.1.3 and is commercially available as a reagent.
All three types can be effectively used in the present invention. The reaction temperature when using the reagent of the present invention is desirably a maximum temperature of 30 to 40°C, especially 37°C. The reaction time is preferably 60 minutes, and the pH of the reaction solution is preferably 7.5 to 8.5, particularly 8.2, which is the optimum pH for the enzyme. The quantifiable range of L-lysine hydrochloride using the reagent of the present invention is 0.025 to 0.025 for standard reaction solution compositions.
The amount of L-lysine is 0.15 μmole, and within this range, a linear relationship is established between the amount of L-lysine and the ultraviolet absorbance. In the case of the standard reagent composition constituting the present invention, it is necessary to contain a sufficient amount of α-ketoglutaric acid, and when the quantitative range of L-lysine hydrochloride, which is the analyte, is 0.025 to 0.15 μmole, Preferably, α-ketoglutaric acid contains 3.0 μmole. Since the enzyme requires pyridoxal-5-phosphate as a coenzyme, the reaction solution composition contains the required amount of pyridoxal-5-phosphate. The pH of the reaction solution is maintained at 8.2 with potassium phosphate buffer. After the required reaction time has elapsed, a required amount of H 2 O 2 is added to stop the reaction. As a result of the reaction, NADH 2 or
Produced by NADPH 2 . This NADH 2 or NADPH 2
The absorption maximum is at 340 nm in the ultraviolet wavelength range. The enzyme used in the present invention has substrate specificity and acts only on L-lysine. Utilizing this substrate specificity, L-lysine in the analyte can be quantified, and even if other L-amino acids, D-amino acids, or α-keto acids coexist in the analyte, quantitative analysis can be performed. has no effect on the In the following Examples, the analytical reagent of the present invention and the analysis operation of L-lysine using the same will be explained. Example An enzyme reaction solution as shown in Table 2 below was prepared by adding an analyte to the analytical reagent of the present invention. NAD was used as a coenzyme.
【表】
以上の酵素反応液組成物0.9mlを、そのまま遠
心分離できる試験管に入れ、37℃，60分間酵素反
応をおこない、その後20mM H2O2 0.1mlを加え
て、1.0mlにした。そののち該反応液を遠心分離
機にかけて、その上澄液の吸収度を、340nmで分
光光度計を用いて測定した。あらかじめ既知量の
Ｌーリジン塩酸塩により作成した検量線と対比し
て、分析対象物中のＬーリジンの含量を知る。
測定結果を下記第３表に示す。[Table] 0.9 ml of the above enzyme reaction solution composition was directly placed in a test tube that can be centrifuged, and an enzyme reaction was performed at 37° C. for 60 minutes, and then 0.1 ml of 20 mM H 2 O 2 was added to bring the volume to 1.0 ml. Thereafter, the reaction solution was centrifuged, and the absorbance of the supernatant was measured at 340 nm using a spectrophotometer. The content of L-lysine in the substance to be analyzed is determined by comparing it with a calibration curve prepared in advance using a known amount of L-lysine hydrochloride. The measurement results are shown in Table 3 below.
【表】
更に本発明試薬の高い分析精度を証明するた
め、回収試験（Recovery Test）を実施した。
即ち天然物に既知量のＬーリジン・HC1を添加
した区と、添加しない区とについて、Ｌーリジン
の量を、本分析試薬を用いて、測定した結果、リ
カバリーは99.5％であつた。[Table] Furthermore, in order to prove the high analytical accuracy of the reagent of the present invention, a recovery test was conducted. That is, as a result of measuring the amount of L-lysine using this analytical reagent in a group in which a known amount of L-lysine/HC1 was added to the natural product and in a group in which it was not added, the recovery was 99.5%.
Claims (1)
ランスアミナーゼ、Ｌ−グルタミン酸脱水素酵
素、NADまたはNADP、ピリドキサール燐酸及
びα−ケトグルタール酸を含有することを特徴と
するＬーリジン分析用試薬。1. A reagent for L-lysine analysis, characterized by containing L-lysine-α-ketoglutaric acid-ε-transaminase, L-glutamic acid dehydrogenase, NAD or NADP, pyridoxal phosphoric acid, and α-ketoglutaric acid.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP13300577A JPS5466887A (en) | 1977-11-08 | 1977-11-08 | Reagent for analyzing lllysine |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP13300577A JPS5466887A (en) | 1977-11-08 | 1977-11-08 | Reagent for analyzing lllysine |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS5466887A JPS5466887A (en) | 1979-05-29 |
| JPS6146118B2 true JPS6146118B2 (en) | 1986-10-13 |
Family
ID=15094551
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP13300577A Granted JPS5466887A (en) | 1977-11-08 | 1977-11-08 | Reagent for analyzing lllysine |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS5466887A (en) |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS6057838A (en) * | 1983-09-09 | 1985-04-03 | Konishiroku Photo Ind Co Ltd | Silver halide color photosensitive material |
-
1977
- 1977-11-08 JP JP13300577A patent/JPS5466887A/en active Granted
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS5466887A (en) | 1979-05-29 |
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