JPS6146783B2

JPS6146783B2 -

Info

Publication number: JPS6146783B2
Application number: JP54084866A
Authority: JP
Inventors: Emu Matsukooneru Haaden
Original assignee: Becton Dickinson and Co
Current assignee: Becton Dickinson and Co
Priority date: 1978-09-27
Filing date: 1979-07-04
Publication date: 1986-10-16
Also published as: DE2938646A1; US4222744A; GB2034886A; JPS5546189A; GB2034886B; DE2938646C2

Description

【発明の詳細な説明】

この発明はリガンドの検定法、特に螢光物質を
用いるリガンドの検定法に関している。一般にリガンドおよび放射性ラベルしたリガン
ドの間のバインダーの限られたサイト数に対する
競合性を利用する放射性検定法によりリガンドは
検定されている。例えば既知量のラベルしたリガ
ンド、既知量のリガンド用バインダーおよびリガ
ンド含有試料を一緒にして放置したとき、バイン
ダーに結合したラベルしたリガンドのパーセント
は試料中のリガンド量と反比例して変化する。バ
インダーに結合したリガンドおよび放射性ラベル
したリガンドをバインダーに結合しなかつたリガ
ンドおよび放射性ラベルしたリガンドから分離し
た後、結合したまたは遊離部分の放射性ラベルし
たリガンドの何れかあるいは両者の量を標準カー
ブと比較して試料中に存在するリガンドの量を決
定できる。この検定法は放射性物質を用いる必要があり、
これは廃物の廃棄、放射性物質の貯蔵、高価なカ
ウンターの使用等の欠点がある。さらにこの検定
法は、結合部分と遊離部分との分離を必要として
一般に時間のかかる方法である。その結果、改良したリガンド検定法が要望され
ている。この発明では、流体中でリガンドを含むまたは
含むと思われる試料を(1)検知可能な物質でラベル
したリガンド用バインダーまたは(2)リガンド用バ
インダーおよび検知可能な物質でラベルした対照
リガンドと接触させ、そして流体領域中でのラベ
ルした材料の移動を決定して試料中のリガンドの
存在を決定するリガンドの検定法を提供する。流
体領域でのラベルした材料の移動は、流体領域で
のラベルした材料の量の変化および時間の関係、
すなわち一定の変化量を達成する時間および／ま
たは一定時間後に達成した変化量の測定で決定で
きる。この検定法は、流体中の各成分（バインダ
および／またはリガンドおよび／または対照リガ
ンド）の移動は、リガンドおよび／または対照リ
ガンドのバインダーへの結合により変化する原理
に基づいている；すなわち(1)リガンドとバインダ
ーとの結合生成物は流体中を未結合バインダーと
は異なる測定可能な速度で移動すること、(2)未結
合対照リガンドは流体中を対照リガンドとバイン
ダーとの結合生成物とは異なる測定可能な速度で
移動すること、または(3)対照リガンドとバインダ
ーとの結合生成物は流体中をリガンドとバインダ
ーとの結合生成物とは異なる測定可能な速度で移
動することに基づいてなされた。その中で検定を行う流体は、液体が好ましい
が、固形物例えばゲルでもよい。“流体”とはそ
の中をリガンド以外にバインダーおよび対照リガ
ンド（もし用いれば）が移動できるものである。リガンド、バインダーおよび対照リガンドの流
体中の移動は、外力の存在および／または不存在
下での拡散によりもたらされる。外力の不存在で
は、リガンド、バインダーおよび対照バインダー
の移動は熱拡散によりもたらされる。このような
熱拡散移動は、一種またはそれ以上の電力、磁力
または重力のような外力により補強される。この発明によれば、未結合バインダーが流体中
をリガンドに結合したバインダーと異なる測定可
能な速度で移動する場合には、リガンドを含むか
または含むと考えられる試料を、検知可能な物質
でラベルしたバインダーを含む流体に添加する。
試料に存在するあらゆるリガンドはバインダーに
結合し、未結合バインダーとリガンドに結合した
バインダーとの移動速度の差の結果として流体中
のラベルした全バインダーの移動速度を変化させ
る。試料中のリガンドの存在は、ラベルした材料
（流体領域中の結合または未結合のラベルしたバ
インダー）の移動を測定して定量的または定性的
に決定できる。この移動の測定は、流体領域での
ラベルした材料の量の変化を時間に関して測定す
ることにより行う。この発明の別の観点により、未結合対照リガン
ドが流体中をバインダーに結合した対照リガンド
と異なる測定可能な速度で移動する場合には、リ
ガンドを含むまたは含むと考えられる試料を流体
中でバインダーおよび検知可能な物質でラベルし
た対照リガンドと接触させる。試料におけるリガ
ンドの存在は、結合および未結合対照リガンドの
相対的量に影響し、そのために未結合のラベルし
た対照リガンドとバインダーに結合したラベルし
た対照リガンドとの移動速度の差の結果としてラ
ベルした全対照リガンド（結合および未結合のも
の）の移動速度に影響する。試料におけるリガン
ドの存在は、ラベルした材料すなわち流体領域で
のラベルした対照リガンド（結合および未結合の
もの）の移動を測定して定量的または定性的に決
定できる。この移動は流体領域でのラベルした材
料の量の時間に関しての変化を測定して行われ
る。この発明の第３の観点によれば、バインダーに
結合した対照リガンドが流体中でバインダーに結
合したリガンドと異なる測定可能な速度で移動す
る場合には、リガンドを含むまたは含むと考えら
れる試料を流体中で検知可能な物質でラベルした
バインダーおよびバインダーと対照リガンドとの
結合生成物が流体中でバインダーとリガンドとの
結合生成物とは異なる速度で移動するように修飾
したリガンドの形態である対照リガンドと接触さ
せる。この対照リガンドの修飾は、例えば対照リ
ガンドを固体支持体に支持させることで行われ
る。試料中のリガンドの存在は、流体中の結合お
よび未結合リガンドの相対的量に影響し、そのた
めにリガンドに結合したラベルしたバインダーと
対照リガンドに結合したラベルしたバインダーと
の移動の測定可能な差の結果として流体中のラベ
ルした全バインダー（対照リガンドに結合したも
のおよびリガンドに結合したもの）の移動速度に
影響する。試料のリガンドの存在は、ラベルした
材料すなわち流体領域中のラベルしたバインダー
（リガンドと結合したものおよび対照リガンドに
結合したもの）の移動を決定して定量的または定
性的に行われる。この移動は、流体領域中のラベ
ル材料の量の時間に関する変化を測定して行われ
る。この発明は適当なバインダーが存在する広範な
リガンドの検定に適用でき、リガンドには例えば
(1)抗原、これは脊椎動物の血液流に注入したとき
抗体を形成する、(2)ハプテン、これは抗原性キヤ
リヤーに結合しかつ脊椎動物の血液流に注入した
ときハプテンに対する抗体特異性を与える、また
は(3)リガンド、これはリガンドに対し特異性の形
態で単離できる天然に存在するバインダー、例え
ば血清蛋白質、各種の動物器官から抽出したバイ
ンダー、血清、ミルクバインダー、バクテリア源
バインダー例えばブドウ球菌（これはIgGに対す
るバインダー）等を有するものである。リガンド
が抗体または天然に存在するバインダーの場合も
あり、このときはリガンドに対するバインダー
は、抗体、このような抗体に対する抗体または天
然に存在するバインダーである。この発明で検定できるリガンドの代表例は次の
通りである： (1) 医薬品、例えばモルヒネ、ヘロイン等のよう
なアルカロイド、メタドンおよび類似物、メゲ
ルジンおよび類似物、インドールアルカロイ
ド、カテコールアミン、バルビツール酸塩、グ
ルテスイミド、コカインおよびその代謝物、ジ
フエニルヒダントイン、マリフアナ、トランキ
ライザー例えばメプロバメート、ベンゾリアゾ
シクロヘプタン、フエノチアジン等、 (2) アミノ酸、ポリペプチド、ヌクレオチド、ヌ
クレオシドおよび蛋白質、例えばACTH、オ
キシトシン、黄体ホルモン、インスリン、ベン
スジヨンズ氏蛋白、コリオニツクゴナドロピ
ン、成長ホルモン、レニン、チロキシン結合グ
ロブリン、ブラジキニン、アンギオテンシン、
脳下垂体前葉ホルモン、環状AMP、コリルグ
リシン、環状GMP等、 (3) ステロイド類；エストロゲン、ゲストロゲ
ン、アンドロゲン、副腎皮質ホルモン、胆汁
酸、強心性、配糖体、アグリコーン、サポニン
等。特にテストステロン、アンドロステロン、
エクイレニン、エストン、エストリオール、プ
ロゲステロン、プレグネノロン、17−ヒドロキ
シジオキシ−コルチコステロン（化合物Ｓ）、
デオキシコルチコセロン、コルチゾン、コルチ
コステロン、コルチゾール、アルドステロン、
ジゴキシン、ジジトキシン等である。 (4) ビタミン類；例えばビタミンＡ、ビタミンＢ
類、ビタミンＣ、ビタミンＤ類、ビタミンＥお
よびビタミンＫ；ならびに各種の生物学的物
質、例えばペニシリン、テトラサイクリンのよ
うな抗生物質、ビルス性肝炎Ａ，Ｂ抗原、風疹
抗原、単純性ヘルペス抗原、胎児蛋白質、
T₃，T₄，TSH，LEA、淋疾に対する抗体、ビ
ールス、ビールス誘導体蛋白質、核酸および類
脂体。 “リガンド”は抗原、ハプテン、天然に存在す
るバインダーを有する物質、抗体および天然に存
在するバインダーを含んでいる。 “バインダー”はリガンドに結合する物質で、
抗原、抗体、天然に存在するバインダーおよび抗
体に感応して産生された抗体例えば抗IgG−
IgG、を含んでいる。 “対照リガンド”はリガンドに対するバインダ
ーで結合されうる物質である。対照リガンドは、
検知可能な物質でラベルしたまたは未ラベルのあ
るいはリガンドと異なる速度で移動するように修
飾したリガンドまたは適当な類似物である。した
がつて、対照リガンドは抗体抗原、ハプテンまた
は天然に存在するバインダを有する物質である。検定を行う際には、バインダーおよび／または
対照リガンドは検知可能な物質でラベルする。検知できる物質は光学的に検知できるものが好
ましく、螢光を発する物質が特に好ましい。ラベ
ルとして用いる物質は免疫化学反応を妨害しない
すなわち最小交叉反応性のものでなければならな
い。螢光物質を用い検定で光漂白（詳細は後述す
る）する場合には、螢光物質は光漂白可能なもの
が好ましく、低パワーレベルで光漂白可能なもの
が特に好ましい。ラベルするのに適当な材料の選
択は当業者には自明なことである。適当な螢光物
質の代表例は、フルオレスセン、アミノフルオレ
セン、ローダミン、DANS〔（１−ジメチルアミ
ノ−ナフタレン−５−スルフオン酸）エチジウム
ブロマイド〕、NBDクロライド、ローザミン、ア
クリジンオレンジ、レーザー用染料等である。検知可能な物質特に螢光物質は、バインダーお
よび／または対照リガンドに結合させることによ
りラベルとして用いられる。多くの場合、螢光物
質はバインダーまたは対照リガンドに直接結合す
る。別の場合としては、適当なカツプリング剤を
用いて螢光物質を対照リガンドまたはバインダー
に結合できる。適当なカツプリング剤の代表例
は、ジアルデヒド例えばグルタルアルデヒド、サ
クシンアルデヒドおよびマロンアルデヒド、カル
ボジイミド、ジイソシアネート、ジメチルアジペ
ート、イソチオシアネート、シアヌル酸クロリド
等である。多数のサイトを与えることでバインダ
ーおよび／または対照リガンドに２個以上の螢光
物質分子を結合でき、例えば多数の螢光物質分子
をカツプルした重合体鎖を結合させる。この処理
法はUSP4018530に記載されている。さらに別法
としては、多数の螢光物質分子をビーズのような
固体材料中またはその上に含ませ、バインダーを
ビーズに結合させることで多数の螢光物質分子を
与えることもできる。この方法は、バインダーを
検定に用いる固体支持体に支持させる場合に特に
用いるものである。螢光物質をバインダーとして用いた抗体に対す
る抗体に結合させることにより、螢光物質をバイ
ンダー（例えば抗体）に結合させることができ、
例えば螢光物質でラベルした抗IgG−IgGをIgGに
結合させる。螢光物質ラベルをバインダーおよび／または対
照リガンドに与える便利な方法は、バインダーお
よび／または対照リガンドの第１級アミノ基を介
することで、これをイソチオシアネートで誘導体
化したフルオレスセンと反応させる。末端糖基を
有する物質例えばジゴキシンは、末端糖基を過ヨ
ー素酸塩で開裂させてからエチレンジアミンとの
反応により螢光物質でラベルすることができる。
得られるシツフ塩基を水素化硼素で還元し、得ら
れた第１級アミンはイソチオシアネート誘導体化
フルオレスセンと反応させる。バインダーまたは対照リガンドの螢光物質によ
りラベルすることは上記より充分に理解でき、そ
れ以上の説明は必要がないだろう。この発明の好ましい態様によれば、検定は流体
領域中で螢光ラベルした材料の移動を決定して試
料中のリガンドの存在を決定して行われる。流体
領域中の螢光ラベルした材料の移動は、領域中の
螢光ラベルした材料の量の時間に関する変化を測
定して決定できる、この流体中のラベルした材料
の量の時間に関する変化は、領域中での螢光の増
加および／または減少を時間に関して測定して決
定できる。例えば、このような移動は液体領域を光漂白照
射に付して螢光増加（その程度は領域中またはそ
の一部への追加の螢光物質の移動に依存する）を
時間に関して測定して決定できる。別法として、
流体領域を光漂白照射に付し、螢光減少（これは
追加の螢光物質の領域への移動に応じる）を漂白
中の時間に関して測定して決定できる。すなわ
ち、流体領域中の螢光は、螢光物質の漂白領域の
外部から内部への移動速度が上昇すればゆつくり
した速度で増加するか、または漂白された物質の
隣接領域への移動に左右される隣接領域での螢光
の減少を測定して行う。螢光物質の移動は、外力
の存在または不存在下に拡散により得られる。流体中のバインダーの移動速度がこれへのリガ
ンドの結合により測定可能なように変化するこの
発明の態様によれば、リガンドの検定は、流体中
でリガンドを螢光物質でラベルしたバインダーと
接触させて行われる。流体領域を光漂白して同領
域での螢光回復を時間に関して測定する。この発
明により流体中のリガンドの量が増加しリガンド
と螢光物質でラベルしたバインダーとの結合生成
物が螢光物質でラベルした未結合バインダーの移
動速度よりも緩漫な速度で移動するとき、同領域
での時間に関する螢光回復は低下することが判明
した。流体領域での時間に関する螢光回復は試料
中のリガンドの量と関聯しているので、試料中の
リガンドの存在を定量的に決定できる。したがつ
て、この発明により、種々の既知量のリガンドと
螢光物質でラベルした一定量のバインダー（この
一定量は全リガンドを結合するに要する量以上で
ある）とを接触させ、光漂白してから既知量のリ
ガンドの個々について時間に関する螢光回復を測
定して標準を設定する。リガンドを含むまたは含
むと考えられる試料と螢光物質でラベルした一定
量のバインダーとを流体中で接触させ、光漂白し
てから螢光回復一時間の関係（すなわち特定の螢
光回復を達成する時間または特定の時間後の螢光
回復）を測定して試料中の未知量のリガンドを決
定する。試料中に存在するリガンドの量は、予じ
め決定した値すなわち標準値との比較により決定
できる。流体中の対照リガンドの移動速度が、バインダ
ーに対照リガンドを結合することにより測定可能
な程変化するこの発明の態様によれば、流体中で
リガンドを含むまたは含むと考えられる試料、バ
インダーおよび螢光物質でラベルした対照リガン
ドを接触させて検定できる。流体領域を光漂白し
て同領域の螢光回復と時間との関係を決定する。
試料中のリガンドの量が増加し試料中のリガンド
の量が増加したときにバインダーに結合した螢光
物質でラベルした対照リガンドの量が減少すれ
ば、螢光回復速度が上昇することが判明した。バ
インダーに結合した対照リガンドは未結合対照リ
ガンドより緩漫な速度で移動する点から、試料中
のリガンド量が増加すると領域中の螢光回復速度
は上昇する。種々の既知量のリガンドを一定量のバインダー
および一定量の螢光物質でラベルした対照リガン
ド（螢光物質でラベルした対照リガンドの一定量
はバインダーに結合できる量より過剰である）と
接触させ、光漂白してから個々の既知量のリガン
ドについて領域中での螢光回復−時間の関係を決
定して標準を設定する。試料中の未知量のリガン
ドの決定は、流体中でリガンドを含むまたは含む
と考えられる試料、一定量のバインダーおよび一
定量の螢光物質でラベルした対照リガンドを接触
させ、光漂白してから領域中での螢光回復−時間
の関係を決定して行われる。試料に存在するリガ
ンドの量は、一定時間後の螢光回復または一定の
螢光回復を得るに要する時間を、既知量のリガン
ドで予じめ決定した量と比較して決定する。種々の既知量のリガンドについての光漂白およ
び光漂白中の螢光の減少−時間の関係を測定して
も標準は得られる。試料中の未知量のリガンド
は、試料についての螢光の減少−時間の関係を測
定し、予じめ得てある一定時間後の螢光減少また
は一定の螢光減少を得る時間の値と比較して決定
する。対照リガンドに結合したバインダーが、流体中
でリガンドに結合したバインダーと測定可能な異
なる速度で移動するこの発明の別の態様によれ
ば、リガンドの検定は流体中でリガンド、螢光物
質でラベルしたリガンドおよびリガンドと異なる
測定可能な速度で移動するように修飾した対照リ
ガンドと接触させ、バインダーと対照リガンドと
の結合生成物を流体中でバインダーとリガンドと
の結合生成物と異なる速度で移動させて行う。
種々の方法で前記の異なる移動速度を有するよう
に対照リガンドを修飾でき、例えば対照リガンド
をビーズのような適当な固体の上に置くことであ
る。移動を外力、例えば電力により行う場合に
は、対照リガンドに電荷を与えて対照リガンドが
リガンドと異なる速度で移動するように対照リガ
ンドを修飾できる。移動を磁力の適用により行う
ときは、対照リガンドを適当な磁性材料に結合さ
せて対照リガンドに磁力場においてリガンドと異
なる移動速度を与える。対照リガンドをリガンド
より緩漫な速度で移動するように修飾した場合、
試料中のリガンドの量が増加しリガンドに結合し
たバインダーの量が対照リガンドに結合したバイ
ンダーの量と比較したとき試料に存在するリガン
ドの量の増加に応じて増大するときには、時間に
関する螢光回復が上昇することが判明した。リガ
ンドに結合したとき螢光物質でラベルしたバイン
ダーは、対照リガンドに結合した螢光物質でラベ
ルしたバインダーよりは早い速度で移動するの
で、試料中のリガンド量の増大は時間に関する領
域中での螢光回復の上昇をもたらす。この発明に
より、種々の既知量のリガンドを一定量の螢光物
質でラベルしたバインダーおよび一定量の修飾し
た対照リガンドと接触させ、流体領域を光漂白し
てから個々の既知量のリガンドについて領域中で
の螢光の増加と時間との関係を決定して標準が設
定できる。試料中の未知量のリガンドの決定は、
流体中でリガンドを含むまたは含むと考えられる
試料、一定量の螢光物質でラベルしたバインダー
および一定量の修飾した対照リガンドを接触さ
せ、領域中での螢光回復を時間と関聯させて行わ
れる。一定時間での螢光回復または一定の螢光回
復を得るに要する時間を、既知のリガンドについ
て得た値と比較して試料に存在するリガンドの量
を決定する。別法として、標準は流体領域を光漂
白して領域での螢光の減少の時間に対する関係を
決定して設定する、この際螢光減少は試料中のリ
ガンド量の増加につれてより緩漫な速度で進行し
螢光物質の領域内への移動速度はリガンド量の増
加につれて上昇し螢光ラベルしたバインダーとリ
ガンドとの結合生成物は螢光ラベルしたバインダ
ーと対照リガンドとの結合生成物よりも早い速度
で移動する。上述のように流体中の移動は適当な外力の場、
例えば一種またはそれ以上の電気の場、沈降、遠
心力のような重力の場、または磁力の場を適用し
て行うこともできる。例えば、直流または交流電
位を印加して流体に電場を適用し、電荷、流体の
イオン強度に応じてリガンド、バインダーまたは
対照リガンドの移動を増大できる。このような電
気泳動効果は、検定実施に対する別の追加的手段
を与える。したがつて、電気泳動電圧を用いて検
定の精度を強化できる。例えば、電圧パルスなし
では、単一の螢光ラベルした物質は漂白に対する
感度および移動速度特に拡散定数の２種の性質で
特徴づけられる。電圧パルスの存在で、螢光ラベ
ルした物質は印加電位への依存性を示す。したが
つて、流体中での物質の移動は、物質の電荷を変
えて変化できる。例えば、リガンドおよびバイン
ダーが類似の拡散定数を有する場合、リガンドお
よびバインダーの移動速度の差をバインダーの電
荷を調節することで与えられ、適当な電圧を印加
したときバインダーとリガンドは類似の拡散定数
に係らず流体で異なる移動速度を有する。同様
に、ラベルした対照リガンドとバインダーとの移
動速度の差を電気泳動電圧の印加で増大させて検
定精度を向上できる。例えば、漂白および螢光回
復の両者を、電気泳動電圧を印加してバインダー
とラベルした対照リガンドとの適当な移動速度差
を与えながら測定できる。電気泳動電圧を漂白中だけ印加して例えばバイ
ンダーとラベルした対照リガンドとの差を増大す
ることができる。例えば、バインダーに電荷を与
えラベルした対照リガンドを無電荷とし漂白中に
直流場を印加することで、結合したラベルした対
照リガンドは漂白領域の内外に駆動されるが未結
合のラベルした対照リガンドはそうならない。結
合したラベルした対照リガンドの漂白の増大の結
果として、その回復速度は検定の回復部の間（こ
れは直流場なしで行う）は低下し、結合および未
結合のラベルした対照リガンドの差は向上する。
直流場は検定の回復部中のみで適用して結合した
ラベルした対照リガンドの回復速度を上昇させ結
合および未結合のラベルした対照リガンドの差を
増大する。電気泳動電圧の使用は、流体中に存在する妨害
物質の問題を回避するためにも用いられる。これ
はPHを変えることによる電気泳動移動度を調節お
よび電圧パルスを調節して妨害物質を区別するこ
とで達成できる。直流電気泳動電圧の印加は、も
し背景物質および／または検知すべき物質の電気
泳動移動度を適当に調節できれば、螢光背景また
はノイズのようなフアクターを差別するのにも用
いられる。例えば、ラベルした対照リガンドおよ
びバインダーを用いる検定において、バインダー
に電荷を与えラベルした対照リガンドには与えず
におく。直流電場を印加したとき、バインダーに
結合したラベルした対照リガンドは一定の周期で
移動しそして検定はこの周期で移動する螢光物質
から発散する光線のみを検知して行つて結合した
ラベルした対照リガンドを未結合のラベルした対
照リガンド以外にももし存在すれば妨害螢光物質
から識別する。別の態様では、磁力の場を適用して検定に用い
る各種物質の移動に影響させることもできる。磁
場を用いる場合には、検定に用いる一種またはそ
れ以上の物質に例えば磁性粒子またはビーズの形
態の適当な磁性材料を結合させる。例えば検定を
磁性ビーズに支持させた螢光ラベルしたバインダ
ーで実施する。試料中にリガンドの存在はビーズ
を架橋結合して磁場における螢光物質の移動速度
を変化させる。流体領域を光漂白する場合、上記
の原理により、試料中のリガンドの量が増加すれ
ば螢光ラベルしたバインダーを被覆した磁性ビー
ズの架橋結合は増大して螢光変化と時間との関係
を変化させる。螢光ラベルをビーズに支持された
物質の代りにビーズに適用することもできる。し
かしこの手段はビーズ中間体を介してではある
が、上記物質は依然として螢光物質でラベルされ
たことになる。電気泳動電圧を用いたのと同様に
して、磁場を用いてラベルした対照リガンドとバ
インダーとの移動速度差を増大させることにより
検定の感度を向上できる。したがつて、例えばバ
インダーを磁性粒子に支持させ、磁場を漂白中に
適用してバインダーに結合したラベルした対照リ
ガンドの光漂白を増大させ、この際磁場は検定の
回復部の間は適用されずに結合したラベルした対
照リガンドの回復速度を低下させて未結合および
結合したラベルした対照リガンド間の識別を増大
させる。別法としては、電場の適用の場合のよう
に、磁場を検定の回復部の期間中のみ適用する。
磁場の使用で検定に用いる各種物質の移動差の範
囲を大きくできる。重力の場例えば沈降によりまたは遠心力により
移動は影響される。例えば、検定に用いる物質の
一つを固体支持体例えばビーズに支持させ、支持
した物質を流体中で重力を作用させる。一例とし
て、螢光ラベルしたバインダーを適当なビーズに
被覆し、試料中のリガンドの存在でビーズを架橋
結合させて沈降速度を増加させる。例えば光漂白
を用いる検定法において、検定は光漂白領域を下
部とした縦に取付けた試料容器中で行はれる。試
料中のリガンドの量が増加すると、螢光ラベルし
たバインダーを被覆したビーズの架橋結合は増加
してその沈降速度も大きくなり、光漂白した領域
での時間に関しての螢光回復は増大する。したが
つて、重力場の使用は流体中で検定に用いた物質
の移動を変える別の手段を提供する。検定は固体支持体に支持させた物質の一種で外
力を適用することなく移動は熱拡散により行はせ
て実施することもできる。例えば、バインダーと
螢光ラベルした対照リガンドとが類似の拡散定数
を有するときは、バインダーをビーズのような固
体支持体に支持させて拡散定数を変えて、バイン
ダーとラベルした対照リガンドとの結合生成物を
螢光物質ラベルした未結合対照リガンドと異なる
速度で移動させる。固体支持体は、適当な拡散定
数差を増大させることで検定感度を向上させるの
にも用いられる。例えば、バインダーを固体支持
体に支持させてバインダーと対照リガンドとの拡
散定数差をさらに増大できる。さもなければ、対
照リガンドを固体支持体に支持させてその拡散定
数をリガンドとは異ならせ検定はラベルしたバイ
ンダーで行う。ビーズのような固体物質は、検定で用いる物質
をラベルするのに用いる螢光物質の量を増加する
のにも用いられる。例えばバインダーを螢光物質
でラベルする場合は、多数の螢光物質の分子をビ
ーズの上または内部に適用してからバインダーを
このビーズの上に支持させてバインダーに多数の
螢光ラベルした分子を与える。この多数の螢光ラ
ベルした分子を用いて、検定に用いるバインダー
の量を減少させて検定感度を向上できる。流体領域の漂白は光漂白によるのが好ましい
が、このような漂白は光線の漂白パルス以外を用
いて行うこともできる、例えば、領域での漂白を
電気的に行うこともできる。この発明をさらに詳細に説明する。検知システムは熱拡散により移動を行ない、検
定はバインダーおよび螢光物質でラベルした対照
リガンドを使用して光漂白を用いる方法について
説明する。この検定法は、溶液中で試料リガン
ド、螢光物質でラベルした対照リガンド、および
バインダーを混合し、照射領域で螢光物質ラベル
の漂白（非可逆的光分解）を生ずるに充分な強度
の光線で一定時間照射することを含んでいる。こ
の領域は、それ以上起きないか無視できる程度の
漂白しか生じないようにして光線ビームで螢光を
監視する。それ以上起きないか無視できる程度の
漂白（以下無漂白と称す）しか生じないような監
視または検査は、小さな強度の光線および／また
は類似強度の光線で短時間行つて無漂白にする。
バインダーに結合した螢光ラベルした対照リガン
ドおよび未結合の螢光ラベルした対照リガンドの
形態で、螢光ラベルのビーム中熱拡散により螢光
は時間とともに回復（増大）する。結合対照リガ
ンドの大きなコムプレツクスは未結合対照リガン
ドよりゆつくり拡散するので、螢光回復速度は未
結合対照リガンド対結合対照リガンドの比に依存
する。したがつて、試料リガンド濃度に対する特
定の時間での螢光回復または一定の螢光回復に要
する時の標準カーブが作製でき、これからリガン
ド試料の未知濃度が決定できる。図面では検定に用いた螢光物質の波長を励起し
て螢光を発せさせる源のような放射源が示されて
いる。光源は、光線ビームを発生するアルゴンイ
オンレーザーのようなレーザー１０である。光源
１０からの光線ビーム通路中に光源１０からの光
線をシヤツター１２を通つてつぼのような試料保
持部材１３に集中させる１個またはそれ以上のレ
ンズを含む光学系１１を取付ける。この装置は試
料保持部材１３中の試料の限られた部分のみを光
源が照射するように設計する。光導電素子例えば光電子増倍管１４は、試料保
持部材１３中の励起螢光物質から発する光の強さ
を比例的な電気信号例えば電流に変換する。光電
子増倍管１４からの出力は光度計２１および信号
コンデイシヨナー２２を介してアナログデジタル
変換器１５に接続して電流を数字に変換し、必要
に応じてコンピユーター１６に送つて数字を読み
取る。光電子増倍管１４は、出力表示システム例
えば貯蔵型陰極線オツシロスコープに接続して可
視読取りを提供する。アナログデジタル変換器１
５およびシヤツター１２は、マイクロプロセツサ
ー１８で作動させる。操業に際し、例えば流体中のリガンド、螢光物
質でラベルした対照リガンドおよびバインダー
は、試料保持部材１３に入れる。マイクロプロセ
ツサー１８はシヤツター１２を開放して非漂白光
線パルス（検査パルス）を与えて漂白前の照射領
域における螢光物質の量を測定する。変換器１５
は光電子増倍管１４から受けた電流をコンピユー
タ用の数字に変換する。次いで、試験領域の螢光
物質の光漂白を行う期間中第２の光線パルスを発
して試験部での光線の発生を減少させる。すべて
の光の発生を消滅させるための時間光漂白を実施
する必要はない。試験領域で漂白を行うための光
線ビームは小さくかつ強力に集中し、そして漂白
中に拡散が起きないように漂白時間をできるだけ
短くするように行うのが好ましい。引き続き所定
の時間間隔でシヤツターを所定の期間開放し、光
電子増倍管１４はその時間に試験領域から発する
光の量を検知して比例した電気信号に変換する。
変換器１５はこの電気パルスをコンピユーター１
６に送る数字に変換する。コンピユーターは任意
の時間ｔでの螢光回復の読みを次式で与える： Rt＝Ｐｔ−Ｐ_３／Ｐ_１−Ｐ_３式中Rt：時間ｔでの螢光回復、 Pt：時間ｔで試験領域での光量を示す信
号、 P₁：光漂白直前に試験領域での光量を示す
信号、 P₃：光漂白直後に試験領域での光量を示す
信号。熱拡散の結果として、螢光物質の増大した量は
試験領域に移動して、試験の長さにわたつての
個々の検査パルスは、光電子増倍管１４に入る増
大した光量をもたらす。このようにして、光電子
増倍管１４は試験領域での螢光回復と時間との関
係を測定し、この関係は流体中での全部の螢光ラ
ベルした対照リガンドすなわち結合および遊離の
螢光ラベルした対照リガンド両者の熱拡散速度に
依存する。螢光ラベルした対照リガンドおよび限
られたバインダーサイトに対するリガンドの競合
の結果、流体中のリガンドの量の増加はバインダ
ーに結合した螢光ラベルした対照リガンドの量を
減少させる試料中の全部の螢光ラベルした対照リ
ガンドの拡散速度を向上し、これは試験領域での
螢光回復速度の増加として検知できる。したがつてこの発明により、一定量のバインダ
ー、一定量の螢光ラベルした対照リガンドおよび
既知量のリガンドを含む流体を試料保持部材に置
くことによるリガンドの検定法が開発された。先
ず試験領域に漂白用パルスを一定時間与えてか
ら、一定間隔で一定時間検査パルスを与え、この
検査時間における試験領域での螢光を光電子倍増
管１４で検知する。コンピユーター１６は試験領
域での螢光回復と時間との関係を読み出す。この
処理を種々の既知量のリガンドに関して反復し、
個々の既知量のリガンドの螢光回復と時間との関
係の情報を得る。この情報を、試料のリガンド濃
度に対して特定の時間で達成した螢光回復または
試料のリガンド濃度に対して特定の螢光回復を達
成するに要する時間の関係でプロツトした標準カ
ーブと称するものを得る。例えば血清試料に存在するリガンドの量の決定
は、熱拡散に影響する粘度を大幅に低下するよう
に適当に稀釈した血清試料を、一定量の螢光ラベ
ルした対照リガンドおよび一定量のバインダーと
接触させ、引き続き一定時間漂白し一定時間間隔
で一定期間検査パルスを与える。特定時間後の螢
光回復または特定の螢光回復達成に要する時間を
検知し、血清試料に存在するリガンドの量を決定
するために標準カーブと比較する。螢光ラベルした対照リガンドおよび未ラベルバ
インダーを用いる具体例について上記で説明した
が、この方法は既に説明した他の態様、例えば螢
光ラベルしたバインダーのみを用いる検定または
流体中をリガンドと異なる速度で移動するように
修飾した対照リガンドおよび螢光ラベルしたバイ
ンダーを用いる検定にも応用できる。この方法を光漂白に引き続き所定の時間間隔で
検査パルスの使用に関して説明したが、この方法
は光漂白に引き続き所定の時間にわたつて維持し
た単一の非漂白パルスで行うこともできる、すな
わち、試験領域から発する光の量をパルス期間に
わたつて恒常的に監視してこの時間の螢光回復を
読み取りを与える。しかし、所定の間隔で複数の
効査パルスを用いるのが検定精度向上の点から好
ましい。上記の試験システムは、試験領域での螢光減少
と時間との関係の読み取りを有する装置で試験領
域をある時間光漂白して上記の実施態様で用いら
れる。この光漂白は一種類の光漂白パルスにより
または所定の時間周期で複数の光漂白パルスを用
いて行はれる。試験方法は単一の光線ビームを使用する場合に
ついて説明したが、一つ以上の光線ビームを用い
ても行はれる。さらに、試験方法は流体中の単一
の試験領域に関して説明したが、流体中の複数の
試験領域で試験を行うこともできる。例えば試料
を格子でカバーし、試料全体に漂白パルスおよび
検査パルスを与え、格子は試料の到達部分から光
線を阻止する機能を有し試料に複数の試験領域を
与える、例えば試料の約50％が照射に曝露され試
料の約50％は照射から保護される。他の変更では、螢光の漂白および監視を別々の
領域で行う。例えば平行の隣接した光線ビームを
漂白および検査を行うのに用いる。この場合、検
査光線パルスは漂白領域から検査領域への漂白さ
れた物質の移動による検査領域での螢光低下を測
定する。漂白照射される試料領域を、検査照射される試
料領域とは異なる寸法とすることもできる。例え
ば適当な光学系の使用により漂白用のレーザービ
ームの直径(D)は検査用レーザービームの直径(d)よ
り大きくし、検査光線パルスに当るためにラベル
した物質が大きな距離（Ｄ−ｄ）を移動する回復
時間を増大する。距離（Ｄ−ｄ）が大きい程、緩
漫な移動と迅速な移動との識別が良好であるが、
レーザー出力、加熱効果等の実際上に数値に制限
はある。つぼのような試料保持部材中の液体試料につい
て説明したが、この検定法はゲルのような固体状
媒質中でも行える。例えばポリアクリルアミドゲ
ルまたは寒天のようなゲルが、小さな試料貯槽例
えば直径100ミクロンを与え、適当な試料をその
中に置けば試料の一部はゲル中に移動する。漂白
用および検査用パルスは、試料貯槽に集中するレ
ーザービームにより得られ材料はゲルから貯槽に
戻る。さもなければ、レーザービームは試料貯槽
の代りにゲル領域に集中させ、各種物質を液体の
代りにゲル中に移動させて前記のようにして検定
が行はれる。この具体例で用いた試験流体として
用いた固体またはゲルは種々の物質が移動できる
ものでなければならず、検査および漂白をゲル領
域で行うときは、漂白および検査を行えるように
ゲルは光線を伝達できるものである。この発明は適当の外力の場の適用によりまたは
１種またはそれ以上の物質を固体支持体に支持さ
せることで修正できる。この螢光ラベルした物質を用いる試験法は、基
本的にはリガンドとバインダーの結合による一定
領域での螢光量の変化を測定することである。こ
の試験領域における光の変化は、前記の結合によ
る試験領域での移動の変化によりもたらされる。
検定法は極めて迅速に行はれ、移動の変化は非常
に短かい距離例えば１〜500ミクロンで感知でき
る。これは光線ビームを１つまたはそれ以上の狭
い領域に集中して達成できる。この発明を次の実施例で説明する。実施例１検定を行う装置は第１図に示され、次の部品を
用いた。レーザー：モデル162 10ミリワツトアルゴンイ
オンレーザー（カリフオルニア州、マウテン
ビユー在、スペクトラフイジクス社製）シヤツター：ユニブリツツモデル26L2A14×５
（ニユーヨーク州、ロチエスター在、ビンセ
ントアソシエーツ社製）シヤツター駆動制御：ユニブリツツモデル
SD122B 光電子増倍管：ハママツIP21 光度計：パシフイツクフオトメトリツクモデル
110実験室用光度計信号コンデイシヨナー：パルスピーク高さを変
換し５マイクロ秒パルスで送り出す自家製回
路、アナログデジタル変換器（ADC）：ニユーク
レアデータ575ADC、コンピユーター：モデルPDP11（デジタルエク
イツプメント社製）、ターミナル：テクトロニツクスモデル4010−
１、シヤツタータイミング回路：インテル＃8748マ
イクロプロセツサーで調節自在のトリガーお
よびタイミング回路をコントロールする、レンズ：69ミリ焦点距離二重凸レンズ、セル：１cm²の水晶またはボロンシリケートガラ
スポリスチレンマイクロセル（エルケイプロ
ダクツ社製）フイルター：525nmバンド通過フイルター螢光ラベルしたインシユリン（螢光ラベルした対
照リガンド）の調製フルオレスセンイソシアネート（FITC）１mg
をリン酸塩緩衝食塩水（PBS、PH7.4）30mlに懸
濁した牛インシユリン100mlに撹拌しながら添加
した。懸濁液を４℃に冷却し反応を16時間進行さ
せた。遠心分離後、上澄液をセフアデツクスＧ−
25でクロマトグラフしてからPBSで溶離した。未
反応FITCはカラムに残留し、螢光物質溶離液を
集めた。冷却すると沈澱が生じたが、上澄液は
10^-6Mのフルオレスセンに匹敵する螢光強度を示
した。この原液を免疫反応に用いた。競合結合検定 FITC−インシユリン（ラベルした対照リガン
ド）原液の１：250稀釈容液0.2mlおよび適当な未
ラベルインシユリン稀釈液（リガンド）を混合し
た。ギニア豚抗牛インシユリン（バインダー）を
各試料に加え、溶液を過動させてから６℃で２〜
４時間静置した。測定の10分前に各試料を室温に
した。螢光を１cm²の水晶つぼ中でアルゴンイオンレー
ザーからの488nmの励起線で測定した。バイドパ
スフイルター525nm以上の照射波長のみを通過さ
せた。光漂白（0.13秒パルス）からの回復パーセ
ントを0.50秒、1.00秒および2.00秒の遅延時間で
測定した。結果を下記表に示し、対数インシユリン濃度対
特定時間での螢光回復パーセントの標準カーブを
第２〜３図にプロツトした。任意の標準カーブを
用いて試料中の未知インシユリン濃度が測定でき
る。

【表】実施例２この発明の検定法を、抗原Ａ（リガンド）、フ
ルオロスセンでラベルした抗原FA（対照リガン
ド）および抗体Ab（バインダー）を混合した場
合で説明する。免疫反応は次の通りである、 (1) Ab＋FAAbFA (2) Ab＋ＡAbA この場合、抗体分子の熱拡散定数は抗原よりは
その大きなサイズのために１ケタまた２ケタ小さ
いとし、かつ螢光物質分子の光学漂白した領域へ
の帰還は熱拡散運動によるものとする。平衡状態
で、得られる溶液は平衡濃度のAbA，AbFA，Ａ
およびFAを含んでいる。遊離の分子FAの画分は
よび抗体に結合した分子FA（AbFA）の画分は
明らかに化学平衡の理論にしたがつてAb，Ａお
よびFAの相対的量に依存する。したがつて、末
知溶液のＡの量は、最初の混合物のFAおよびAb
の濃度と定量的に関係し、特定の条件下でのこれ
らの濃度比の決定は未知溶液中のＡの決定に充分
である。さもなければ、これら濃度の比に定量的
かつ単調に関聯するシステムの任意の性質の測定
は、未知溶液中のＡの検定の基礎として用いられ
る。 _FA（ｔ）をFAの標準化光漂白回復関数と
し、_AbFA（ｔ）をAbFAの標準化光漂白回復関
数とする。例えば次の関係にある：（ｔ）＝Ｌ−Ｌｍｉｎ／Ｌｍａｘ−Ｌｍｉｎ (3) 式中Ｌ：時間ｔでの螢光、 Lmax：光漂白直前の螢光 Lmin：光漂白直後の螢光。もし、“結合”および“遊離”分子の平均寿命
を光漂白および回復時間と匹敵する長さとする
と、検定混合物の回復カーブは次式で示される：（ｔ）＝Ｘ_FA（ｔ）
＋（１−Ｘ）_AbFA（ｔ） (4) 式中Ｘ：漂白前の遊離分子に基づく螢光部分。式(4)によれば、特定時間での部分的回復例えば
（１秒）を測定および予じめ測定した値_FA
（１秒）すなわち遊離のラベルした抗原のみを含
む試料の螢光回復および_AbFA（１秒）すなわち
結合したラベルした抗原のみを含む試料の螢光回
復からＸの値が決定できる。回復カーブの線状重畳の有効性（式４）は、
FAを示すリン酸塩緩衝液中のフルオレスセンの
ナトリウム塩10^-8モルを含むものとAbFAを示す
リン酸塩緩衝液中のフルオレスセンでラベルした
抗体（FITG−IgG）溶液（第２溶液は第１溶液
の２倍の螢光強度を有する）の２種の溶液を種々
の割合で混合して実験的に示される。これら溶液
の９種類の混合物を調製し、光漂白回復カーブを
決定した（488nmレーザー源、60mm焦点レンズ、
漂白パルス＝140マイクロ秒、検査パルス＝1.4マ
イクロ秒、ｔ＝１秒での螢光回復を測定）。部分
回復（１秒）でのＸが決定され、Ｘは溶液の組
成と定量的に関聯させられる。同様にして第５図
に示した50％回復に要した時間のプロツトは定量
分析の基礎になる。競合的結合性の検定は次のようにして行はれ
る。未知濃度のＡを含む溶液を、Ａ（および
FA）に対し適当な濃度のFAおよびAbを含む溶
液と混合する。式(4)を適用し、第４図または第５
図に示したようなプロツトからＸが決定できる。
一般に、Ａの濃度およびＸに関する検定実験カー
ブを決定して未知試料のＡの濃度をＸの測定値と
関聯できるようにする。Ｘが遊離のFA分子の部
分と等しく（１−Ｘ）がAbFAとして結合した
FA分子の部分である単純な場合には、溶液中の
抗原の濃度Ａは次式の通りである：Ａ＝Fb／（１−Ｘ）−C₀−Ｋ／Ｘ式中Fb：結合できるラベルした抗原FAの最高
濃度で測定した全部の抗体レセプターサイトの濃
度、Ｋ：ラベルした抗原FAの解離恒数、 C₀：ラベルした抗原FAの全濃度。第６図は、代表的なRIA標準カーブと対比した
T₄の光漂白回復検定の理論的標準カーブの結果
を示す（RIAカーブに関しては、ベクトンデイツ
キンソンアンドカンパニー、T₄ Solid Phase
Radioimmunoassay Kit〔I¹²⁵〕〔1978年３月〕を
参照）。この理論カーブは次の仮定で作られた：Ｋ＝10^-10／モル、C₀＝５×10^-8モル／、 Fb＝2.5×10^-8モル／、結合T₄の熱拡散定数＝４×10^-7cm²／秒、遊離T₄の熱拡散定数＝４×10^-6cm²／秒、 FT₄およびAbFT₄の螢光性質は同じ、レーザービーム半径＝40μ、漂白パラメーターは70％漂白に対応する。

【図面の簡単な説明】

第１図は、この発明の検定を行う検知システム
を示す。第２図および第３図は、インシユリン濃
度の対数に対する特定時間での螢光回復のグラフ
である。第４図は、フルオレスセンおよびフルオ
レスセンでラベルした抗体の混合物の特定時間で
の螢光回復のグラフである。第５図はフルオレス
センおよびフルオレスセンでラベルした抗体の混
合物の50％螢光回復を達成する時間のグラフであ
る。第６図はT₄放射性免疫検定標準カーブと比
較したT₄の光漂白回復検定の理論的標準カーブ
である。

Claims

【特許請求の範囲】１流体中でリガンドを(a)螢光ラベルした前記リ
ガンドに特異的なバインダーまたは(b)前記リガン
ドに特異的なバインダーおよび螢光ラベルした対
照リガンドと接触させ、該流体の少なくとも１つ
の領域を漂白し、そして該流体の少なくとも一つ
の領域で螢光の時間的変化を測定することよりな
る、リガンドの検定法。２螢光の増加と時間との関係を測定する特許請
求の範囲第１項記載の検定法。３測定を漂白領域内の領域で行う特許請求の範
囲第１項記載の検定法。４測定を漂白領域よりも小さな断面積を有する
領域で行なう特許請求の範囲第３項記載の検定
法。５測定および漂白を同一領域で行う特許請求の
範囲第３項記載の検定法。６螢光の減少と時間との関係を測定する特許請
求の範囲第１項記載の検定法。７漂白および測定を隣接する別の領域で行う特
許請求の範囲第６項記載の検定法。８漂白および測定を同一領域で行う特許請求の
範囲第６項記載の検定法。９漂白および測定の少なくとも１つの期間中は
適用した電気の場で検定を行う特許請求の範囲第
１項記載の検定法。１０リガンドを、印加した電気の場でリガンド
と異なる移動速度を有する螢光ラベルした電荷を
有するバインダーと接触させる特許請求の範囲第
９項記載の検定法。１１リガンドを、螢光ラベルしたバインダーお
よび印加した電気の場で前記リガンドと異なる移
動速度を有する電荷を帯びた対照リガンドと接触
させる特許請求の範囲第９項記載の検定法。１２リガンドを、螢光ラベルした対照リガンド
およびラベルした対照リガンドと結合したとき印
加した電気の場で未結合対照リガンドより速い移
動速度を有するバインダーと接触させ、漂白およ
び測定の少なくとも一つの期間中に電気の場を印
加する特許請求の範囲第９項記載の検定法。１３検定は漂白および測定の少なくとも１つの
期間中磁力の場を印加して行う特許請求の範囲第
１項記載の検定法。１４リガンドを磁性物質に支持した螢光ラベル
したバインダーと接触させてバインダーへのリガ
ンドの結合が印加した磁力の場でのラベルしたバ
インダーの移動を変化させる特許請求の範囲第１
３項記載の検定法。１５リガンドを磁性物質に支持したバインダー
およびラベルした対照リガンドと接触させる特許
請求の範囲第１３項記載の検定法。１６リガンドをラベルしたバインダーおよび磁
性物質に支持した対照リガンドと接触させる特許
請求の範囲第１３項記載の検定法。１７リガンドを固体支持体に支持したラベルし
たバインダーと接触させる特許請求の範囲第１項
記載の検定法。１８リガンドを固体支持体に支持したバインダ
ーおよびラベルした対照リガンドと接触させる特
許請求の範囲第１項記載の検定法。１９リガンドをラベルしたバインダーおよび固
体支持体に支持した対照リガンドと接触させる特
許請求の範囲第１項記載の検定法。２０リガンドをバインダーおよび螢光ラベルし
た対照リガンドと接触させる特許請求の範囲第１
項記載の検定法。２１漂白を狭い領域に集中させた光線ビームで
行う特許請求の範囲第２０項記載の検定法。２２螢光の増加と時間との関係を漂白される少
なくとも１つの領域で測定する特許請求の範囲第
２１項記載の検定法。２３螢光の減少と時間との関係を少なくとも１
つの領域で漂白中に測定する特許請求の範囲第２
１項記載の検定法。２４リガンドを螢光ラベルしたバインダーと接
触させる特許請求の範囲第１項記載の検定法。２５漂白を狭い領域に集中した光線ビームで行
う特許請求の範囲第２４項記載の検定法。２６螢光の増加と時間との関係を漂白される少
なくとも１つの領域で行う特許請求の範囲第２５
項記載の検定法。２７螢光の減少と時間との関係を少なくとも１
つの領域で漂白中に行う特許請求の範囲第２５項
記載の検定法。２８リガンドを螢光ラベルしたバインダーおよ
び流体中でリガンドと異なる速度で移動するよう
に修飾した対照リガンドと接触させる特許請求の
範囲第１項記載の検定法。２９流体が液体である特許請求の範囲第１項記
載の検定法。３０流体中でリガンドを(a)前記リガンドに特異
的なバインダーおよび螢光ラベルした対照リガン
ドまたは(b)螢光ラベルした前記リガンドに特異的
なバインダーと接触させ、該流体の少なくとも１
つの領域を光漂白光線パルスに曝露し、次いで前
記少なくとも１つの領域内の領域を時間間隔のあ
る無漂白性検知光線パルスに曝露し、検知光線パ
ルス照射中に螢光光線放射を検出して前記少なく
とも１つの領域内での螢光回復と時間との関係を
測定することによりなる特許請求の範囲第１項記
載のリガンドの検定法。３１流体が液体である特許請求の範囲第３０項
記載の検定法。３２リガンドをバインダーおよび螢光ラベルし
た対照リガンドと接触させる特許請求の範囲第３
１項記載の検定法。３３所定の蛍光回復を達成する時間を測定する
特許請求の範囲第３２項記載の検定法。３４所定の時間後の螢光回復を測定する特許請
求の範囲第３２項記載の検定法。３５光漂白光線パルスおよび検知光線パルスは
集中したレーザービームである特許請求の範囲第
３２項記載の検定法。３６リガンドを螢光ラベルしたバインダーと接
触させる特許請求の範囲第３１項記載の検定法。３７光漂白光線パルスおよび検知光線パルスは
集中したレーザービームである特許請求の範囲第
３６項記載の検定法。３８所定の時間後の螢光回復を測定する特許請
求の範囲第３６項記載の検定法。３９所定の螢光回復を達成する時間を測定する
特許請求の範囲第３６項記載の検定法。４０領域内の螢光ラベルした材料の量と時間と
の関係を、少なくとも１つの領域での螢光物質か
ら放出される光線の量の変化を検知して測定する
特許請求の範囲第１項記載の検定法。