JPS6151564B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は下記構造からなるアンジオテンシン転
換酵素阻害剤に関するものである。 Thr―Thr―Met―Pro―Leu―Trp 従来、放線菌培養濾液中に見出された生体内酵
素阻害剤は、抗炎症、抗消化性潰瘍、制癌などの
様々な作用を有し、医薬あるいは研究用試薬等と
して期待されてきた。 このうち、アンジオテンシ転換酵素阻害剤に関
しては、微生物の生産する阻害剤が、最近になつ
て数種類知られるようになつたが、ブラジル産蛇
毒及び日本産蛇毒より得られたペプチド性阻害剤
及びゼラチンを微生物由来のコラゲナーゼで処理
した液中から単離したものが以前より知られてい
る。また、米国のスクイブ社ではプロリンの誘導
体であるカプトプリルを合成したが、この物質は
強力な阻害作用を有し、経口可能な新薬として注
目を集めている。しかしながら、これらの阻害剤
はいずれも高価であるため、安価に入手でき、し
かも副作用の少ない天然物由来の阻害剤の開発が
望まれている。 一方、本発明者らは先に牛由来のカゼインをト
リプシンなどにより分解してアンジオテンシン転
換酵素阻害剤を得ることに成功している（特開昭
58―109425、特開昭59―44323、特開昭59―
44324）。 今回、本発明者らは前回と同様に牛由来カゼイ
ンをトリプシンなどで処理することにより、前記
構造を有する新たなアンジオテンシン転換酵素阻
害剤を調製することに成功した。 本発明の阻害剤は、アンジオテンシン転換酵素
に対して阻害作用を示す。この場合、アンジオテ
ンシン転換酵素は、肝で分泌されるアンジオテン
シノーゲンが腎で生産される酵素レニンにより分
解されたアンジオテンシン（Asp―Arg―Val
―Tyr―Ile―His―Pro―Phe―His―Leu）に対
して作用し、このものをアンジオテンシン
（Asp―Arg―Val―Tyr―Ile―His―Pro―Phe）
に転換させる。そして、このアンジオテンシン
（）は、血管壁平滑筋を収縮させて血圧を高め
たり、血管以外にも消化管や子宮の平滑筋をも収
縮させ、さらに、副腎皮質に作用してアルドステ
ロンの分泌を促進させるなどの作用を有する。ま
た、血漿に存在する酵素カリクレインはキニノー
ゲンと呼ばれる蛋白質を分解し、血管を拡張させ
降圧させるプラジキニンンを生産するが、このプ
ラジキニンはアンジオテンシン転換酵素の作用に
より分解され、不活性化されてしまう。このよう
に、アンジオテンシン転換酵素は、一方昇圧性ペ
プチド（アンジオテンシン）を生じさせると共
に、他方で降圧性ペプチド（プラジキニン）を分
解し、結果として血圧を昇圧の方向に進める。本
発明による阻害剤は、このような作用を示すアン
ジオテンシン転換酵素に対して阻害作用を有し、
殊に血圧降下剤として有効である。 本発明によりアンジオテンシン転換酵素阻害剤
を得るには牛由来カゼインをPH5.5〜9.0の条件
下、トリプシンにより分解し、分解物に塩酸を加
えて処理することによりトリプシン及び未分解の
カゼインを沈澱させ濾紙などにより除去する。こ
のようにして得た濾液を水酸化ナトリウムなどの
アルカリで中和した後、精製して製品を得る。 本阻害剤は、更に、常套のペプチド合成手段を
利用して得ることも可能である。 即ち、一方のアミノ酸のアミノ基をベンジルオ
キシカルボニル基又は、ｔ―ブトキシカルボニル
基などで保護し、他方のアミノ酸又はペプチドの
カルボキシル基をベンジルエステルなどで保護
し、DCC（Ｎ，N′―ジシクロヘキシルカルボジ
イミド）などでカツプリングさせる。この操作を
繰り返し、保護基を離脱させ、精製して製品を得
ることができる。 本発明による阻害剤の常温における性状は、白
色粉末であり、その水溶液の高速液体クロマトグ
ラフイー（逆相カラム、リン酸緩衝液―アセトニ
トリル溶出）による溶出パターンは後述の第１図
の通りであり、薄層クロマトグラフイーによる
Rf値は後記の第１表の通りである。また、6M塩
酸に溶かし、真空下で、110℃24時間の加水分解
を行うと後述の第２表に示される組成のアミノ酸
混液が得られる。 本発明のアンジオテンシン転換酵素阻害剤の摂
取法は、一般的には静脈注射で行われ、例えば、
動物１Kg当り本阻害剤が0.01〜１mgになるよう本
阻害剤の水溶液を静注する。 本発明によるアンジオテンシン転換酵素阻害剤
は、生体内に該酵素を内生する哺乳類等に適用で
き、例えば、ヒト、ラツト、犬などが例示でき
る。 次に本発明を実施例によりさらに詳細に説明す
る。 （実施例） 牛由来カゼイン80gを２の0.04Mリン酸緩衝
液（PH7.4）中に懸濁し、トリプシン（PLバイオ
ケミカルズ社製品、膵臓由来）200mgを添加し、
37℃で撹拌しながら15時間反応させる。反応後、
生成物に100mlの濃塩酸を加え、トリプシン及び
未分解カゼインを沈澱させる。この沈澱物を濾紙
で除去した後、濾液に水酸化ナトリウムを加えPH
3.0まで中和し、再び沈澱物を濾紙で除去する。
この濾液にさらに水酸化ナトリウムを加えて中和
し、PH7.0とする。次に、この液をセフアデツク
スLH―20のカラムに添加し、蒸溜水で溶出させ
て精製する。そして、この際の最大活性フラクシ
ヨンを集め減圧濃縮する。なお、この場合のカラ
ム処理条件は次の通りである。 カ ラ ム：高さ130cm、内径５cm 試料添加量：200ml 流 速：120ml／hr 溶 出：蒸溜水 次に、前記セフアデツクスLH―20で分画した
活性フラクシヨンを、イオン遅滞樹脂（バイオラ
ド社製AG11A8）カラムに添加し、蒸溜水で溶出
する。活性フラクシヨンを集め減圧濃縮する。な
お、この場合のカラム処理条件は次の通りであ
る。 カ ラ ム：高さ63cm、内径４cm 試料添加量：200ml 流 速：100ml／hr 溶 出：蒸溜水 次に、前記で得た活性フラクシヨンを再びセフ
アデツクスLH―20カラムに添加し再クロマトを
行なう。この場合のカラム処理条件は前記と同一
であり、溶出量1.8の位置に存在する活性フラ
クシヨンを凍結乾燥すると、白色粉末物質が得ら
れる（カゼイン80gから約85mg得られる）。 次に、本物質の薄層クロマトグラフイー（シリ
カゲルプレート、UV吸収及びニンヒドリン発色
で検出）でのRf値を求めたところ、次の通りで
あつた。

【表】 次に本発明物質の液体クロマトグラフイーでの
溶出パターンを見たところ図１の通りであつた。
溶出条件は次の通りである。 カラム：ウオーターズ 逆相用ラジアルパツク
カートリツジＣ―18 溶離液：リン酸緩衝液（10mMKH₂PO₄、
50mMNa₂SO₄）PH3.0：アセトニトリル
（２：１、Ｖ／Ｖ） 流 速：１ml／min 検 出：210nmの紫外吸収 また、本発明物質を6M塩酸に溶かし、真空下
で110℃、24時間加熱後、アミノ酸分析計により
分析したところ、次の結果が得られた。

【表】 次に、本発明物質をカルボキシ ペプチダーゼ
Ａで処理したところ更に、Trp（トリプトフア
ン）が検出された。 次に、本発明物質のアミノ酸一次配列をエドマ
ン分解法及びロイシンアミノペプチダーゼ、カル
ボキシペプチダーゼＡ、カルボキシペプチダーゼ
Ｙを用いてアミノ酸分析計により決定したとこ
ろ、下記の構造を有することが確認された。 Thr―Thr―Met―Pro―Leu―Trp 次に、本発明物質の酵素阻害活性を測定するた
めに、次の実験を行つた。 先ず、5gのラビツトラングアセトンパウダー
を50mlの0.1Mホウ酸ナトリウム緩衝液（PH＝
8.3）に溶かし、40000g、40分の条件下で遠心処
理し、その上澄液をさらに上記緩衝液で５倍に希
釈して、アンジオテンシン転換酵素液を得た。 本発明物質を含む試料を試験管に0.03ml入れ、
これに基質として、0.25mlのヒプリルヒスチヂル
ロイシン（最終濃度5mM、NaCl300mM含む）を
添加し、37℃で30分間反応させた。その後、1N
塩酸0.25mlを添加して反応を停止させた後、1.5
mlの酢酸エチルを加え、酢酸エチル中に抽出され
たヒプリル酸の吸収228nmの値を測定し、これを
酵素活性とした。なお、この条件で本発明阻害剤
を含まない場合の228nmの吸収値はほぼ0.25であ
る。 このような実験を複数行い、阻害率を次の式よ
り算出した。 阻害率＝Ａ−Ｂ／Ａ×100（％） Ａ：阻害剤を含まない場合の228nm吸収値
（0.25） Ｂ：阻害剤添加の場合の228nmの吸収値 そして、阻害率50％の時の阻害剤濃度ID₅₀を求
めたところ、本発明阻害剤は、 1.6×10^-5M であつた。

【図面の簡単な説明】

第１図は、精製されたアンジオテンシン転換酵
素阻害剤の高速液体クロマトグラフイーによる分
析結果を示し、縦軸に210nm紫外吸収の強度、横
軸に溶出時間（分）を示す。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 下記構造からなるアンジオテンシン転換酵素
   阻害剤。 Thr―Thr―Met―Pro―Leu―Trp