【発明の詳細な説明】[Detailed description of the invention]
本発明は、アルブミン製剤に関する。さらに詳
しくは、アルブミン中のメルカプトアルブミンの
割合が高いアルブミン製剤に関する。
近年、輸血を行なうに際して新鮮な血液をその
まま用いるのではなく、保存血あるいは血液中の
必要な成分のみを用いる、いわゆる血液製剤の利
用が盛んになつてきた。なかでも血液中の特定の
成分からなる血液製剤の利用は、必要量を十分投
与できるばかりでなく、不必要な成分投与による
副作用を防止し、血液のより有効な利用につなが
るもので、今後ますます用いられるようになると
思われる。
アルブミン製剤は最も多く用いられている血液
製剤の一つで、厚生省薬務局の生物学的製剤基準
によれば、「加熱人血漿蛋白」と「人血清アルブ
ミン」とがあり、種々の疾患の治療に用いられて
いる。
通常、人血漿中のアルブミンは、メルカプトア
ルブミンとノンメルカプトアルブミンよりなる。
以下、アルブミン中のメルカプトアルブミンの割
合をＰHMA（％）で表わし、式(1)で定義する。
ＰHMA＝ＱＨＭＡ／ＱＨＭＡ＋ＱＨＮＡ×100 (1)
ここでＱHMA、ＱHNAは、それぞれメルカプトア
ルブミン、ノンメルカプトアルブミンの量を表わ
す。その測定法は後述する。
本発明者らの研究によれば、腎臓や肝臓の疾患
者をはじめ種々の疾患者の血漿に含まれるアルブ
ミンは、健常人血清のそれとくらべてＰHMAが低
い。したがつて、これらの疾患者の治療にはＰHM
Ａの高いアルブミン製剤を用いるのが好ましい。
しかしながら、通常市販されているアルブミン
製剤中のアルブミンは、健常人血清のそれとくら
べてＰHMAが低く、アルブミン製剤として好まし
い組成とはいえなかつた。
その理由の一つは、アルブミンの中にメルカプ
トアルブミンとノンメルカプトアルブミンがある
ことや、その割合が健常人と疾患者で異なること
が必ずしも一般に知られておらず、したがつて、
メルカプトアルブミンまたはノンメルカプトアル
ブミンを分析し管理することもなかつたためであ
る。しかも、本発明者らの研究によれば、人体か
ら採血して得た血漿中のＰHMAは経時変化を示
し、時間とともに低下することがわかつたが、従
来のアルブミン製剤は、通常、採血後長時間経過
した血漿を用いてつくられており、その上シスチ
ン、酸化型グルタチオンの共存下で熱処理されて
いたので、必然的にメルカプトアルブミンの少な
い製剤になつていた。
本発明者らは、前記のような従来のアルブミン
製剤の問題点を解決すべく鋭意検討を重ねた結
果、ＰHMAの高いアルブミン製剤の開発に成功
し、本発明を完成するに到つた。すなわち、本発
明は、アルブミン中のメルカプトアルブミンが60
％以上であることを特徴とするアルブミン製剤に
関する。
本発明におけるアルブミン製剤とは、厚生省薬
務局監修「生物学的製剤基準」（1979）における
「加熱人血漿蛋白」と「人血清アルブミン」のこ
とである。
また、メルカプトアルブミンとは、アルブミン
を形成するアミノ酸のうち34番目のものが−SH
基を有するシステインよりなるアルブミンのこと
である。
一方、ノンメルカプトアルブミンとは、メルカ
プトアルブミンの34番目のシステインと、シスチ
ンまたは酸化型グルタチオン等の−Ｓ−Ｓ−結合
をもつ比較的低分子量のものが、分子間SH、Ｓ
−Ｓ交換反応により結合したものをいう。
製剤中のアルブミンのメルカプトアルブミンの
割合、つまりＰHMAは60％以上であるのがよい。
本発明者らの研究によれば、健常人血漿のアルブ
ミンは、ＰHMAが60％以上であり（表１）、腎臓、
肝臓等多くの疾患者においては、その値は健常人
よりはるかに低い。したがつて、これら疾患者に
対して投与するアルブミン製剤は、ＰHMAの高い
ものを用いるべきである。ＰHMAが本発明の範囲
にあるアルブミン製剤は、この条件を満たしてお
り、製剤として好ましい組成を有する。本発明の
ＰHMAは、65％以上であればさらに好ましい。
血漿や製剤等の中のＰHMAは、波長280nｍの紫
外吸収を検出器とする液体クロマトグラフイーに
よつて得られるクロマトグラムのメルカプトアル
ブミンとノンメルカプトアルブミンの面積、また
は面積に相当する値を各々ＱHMA、ＱHNAとし、(1)
式から求められる。液体クロマトグラフイーを行
なう際の充填剤や移動相は、メルカプトアルブミ
ンとノンメルカプトアルブミンを分離できるもの
であれば任意に選び得るが、硬質ゲルを充填剤と
して用いる高速液体クロマトグラフイーは、迅速
性においてすぐれており好ましい。このような条
件は、例えば特願昭57−177505号に示されてい
る。
さらに、本発明のアルブミン製剤中のシスチン
および／または酸化型グルタチオンは、アルブミ
ン全量に対して5mol％以下であるのが好まし
い。メルカプトアルブミンはシスチンや酸化型グ
ルタチオンと反応して、ノンメルカプトアルブミ
ンに変化する。共存するシスチンや酸化型グルタ
チオンが前記範囲にあることによつて、アルブミ
ンの組成は熱処理中や保存中にほとんど変化する
ことがなく、ＰHMAの高い好ましい組成を維持す
ることができる。アルブミンをより安定に保つに
は、シスチンおよび／または酸化グルタチオンは
なるべく少ない方がよく、3mol％以下であれば
より好ましく、1mol％以下であれば最も好まし
い。ここでシスチン、酸化型グルタチオンの構造
は、それぞれ次式(2)、(3)で表わされる。
シスチンや酸化型グルタチオンの分析は、通常
のアミノ酸分析計を用いた方法により行なうこと
ができる。
次に、本発明のアルブミン製剤の製法例を述べ
るが、この製法によつて本発明が限定されるもの
ではない。
一般的操作は厚生省薬務局監修「生物学的製剤
基準」に準じて行なわれる。用いる原血漿は、ア
ルブミン中ＰHMAが60％以上である健常人の新鮮
な血漿であることが好ましく、65％以上であれば
さらに好ましい。この血漿を用いて素早く分画を
行なう。分画法はCohnの冷エタノール法等一般
に行なわれている方法でよい。分画操作の前後ま
たは中間のどこかで、アルブミンが透過しない膜
を用いた透析や限外液によつて、シスチンや酸
化型グルタチオン等の−Ｓ−Ｓ−結合を含む分子
量の低い化合物を除く。この操作は少なくとも加
熱処理以前に行なうのがよい。さらに必要により
精製したのち、アセチルトリプトフアンナトリウ
ム・カプリル酸ナトリウム液で溶かし、分注後加
温して製剤とする。
ＰHMAが60％以下である血漿を用いる場合は、
例えば特願昭57−177505号に示された条件で液体
クロマトグラフイーを行なつて、クロマトグラム
上でメルカプトアルブミンとノンメルカプトアル
ブミンのピークを分離し、メルカプトアルブミン
が60％以上になるように分取することによつて、
本発明の製剤を得るためのアルブミン分画を得る
こともできる。
また、ジチオスライトールをアルブミンと反応
させ、ノンメルカプトアルブミンをメルカプトア
ルブミンに変えたのち、必要な精製を十分に行な
つて、ＰHMAの高いアルブミン分画を得ることも
可能である。
これらの操作を行なうに際し、各段階において
「生物学的製剤基準」の試験の項目を満たすよう
十分注意しなければならないのはいうまでもな
い。
本発明のアルブミン製剤はＰHMAが高く、健常
人の血漿とほとんど同程度あるいはそれ以上のＰ
HMAを示すので、腎臓や肝臓の疾患者をはじめ、
血漿アルブミンのＰHMAの低い疾患者の治療に用
いるのに適している。しかも、製剤中のシスチン
や酸化グルタチオン等が少ないので、前記の好ま
しい状態を長期間維持することができる。
以下、本発明に関連して行なつた実験や実施例
を述べるが、本発明が実施例に限定されるもので
はない。
実験 １
健常人血清中のアルブミンの分析高速液体クロ
マトグラフイーを用いて行なつた。
（条件）
カラム Asahipak GS520、内径7.5mm、長さ50
cm、４本〔旭化成工業(株)〕
ポンプ 日本分光工業(株)Twincle
検出器 UV検出器（280nｍ）日本分光工業(株)
UVIDEC
サンプル 採血後１日以内の健常人血漿
移動相 0.1Mリン酸ナトリウム＋0.3M塩化ナト
リウム（PH7.0）
流 量 0.5ml/min
温 度 28℃
（結果）
第１図のように得られるクロマトグラムのＡ
（メルカプトアルブミン）とＢ（ノンメルカプト
アルブミン）の面積をそれぞれＱHMA、ＱHNAとし
て求め、(1)式により計算してＰHMAを得た。
The present invention relates to albumin formulations. More specifically, the present invention relates to an albumin preparation containing a high proportion of mercaptalbumin in albumin. In recent years, the use of so-called blood products, which uses only stored blood or necessary components of blood, has become popular when performing blood transfusions, instead of using fresh blood as is. In particular, the use of blood products made from specific blood components not only allows the necessary amount to be administered sufficiently, but also prevents side effects caused by unnecessary component administration, leading to more effective use of blood, and will continue to be used in the future. It seems that it will be used more and more. Albumin products are one of the most commonly used blood products, and according to the Biological Product Standards of the Pharmaceutical Affairs Bureau of the Ministry of Health and Welfare, there are two types of albumin products: heated human plasma protein and human serum albumin. Used for treatment. Normally, albumin in human plasma consists of mercaptalbumin and non-mercaptalbumin.
Hereinafter, the proportion of mercaptoalbumin in albumin will be expressed as P HMA (%) and defined by formula (1). P HMA =Q HMA /Q HMA +Q HNA ×100 (1) Here, Q HMA and Q HNA represent the amounts of mercaptoalbumin and nonmercaptoalbumin, respectively. The measurement method will be described later. According to the research conducted by the present inventors, albumin contained in the plasma of patients with various diseases including those with kidney and liver diseases has a lower P HMA than that of the serum of healthy individuals. Therefore, for the treatment of these patients, PHM
Preferably, a high A albumin preparation is used. However, albumin in commercially available albumin preparations has a lower P HMA than that of healthy human serum, and cannot be said to have a preferable composition as an albumin preparation. One of the reasons for this is that it is not generally known that albumin contains mercaptalbumin and non-mercaptalbumin, and that their ratios differ between healthy individuals and diseased individuals.
This is because mercaptalbumin or non-mercaptalbumin was not analyzed and controlled. Moreover, according to the research conducted by the present inventors, it was found that P HMA in plasma obtained by blood collection from the human body shows changes over time and decreases over time. Because it was made using plasma that had been aged for a long time and was heat-treated in the presence of cystine and oxidized glutathione, it inevitably contained less mercaptalbumin. The present inventors have made extensive studies to solve the problems of conventional albumin preparations as described above, and as a result have succeeded in developing an albumin preparation with high P HMA and have completed the present invention. That is, in the present invention, mercaptoalbumin in albumin is 60
% or more. The albumin preparation in the present invention refers to "heated human plasma protein" and "human serum albumin" in the "Biological Product Standards" (1979) supervised by the Pharmaceutical Affairs Bureau of the Ministry of Health and Welfare. In addition, mercaptoalbumin is an amino acid in which the 34th amino acid that forms albumin is -SH.
It refers to albumin consisting of cysteine with a group. On the other hand, non-mercaptalbumin is a relatively low-molecular compound with -S-S- bond such as cysteine or oxidized glutathione and the 34th cysteine of mercaptalbumin.
- Refers to those bonded by S exchange reaction. The ratio of mercaptoalbumin to albumin in the preparation, ie, P HMA , is preferably 60% or more.
According to the research conducted by the present inventors, the P HMA of albumin in the plasma of healthy individuals is 60% or more (Table 1), and the kidney,
In patients with many diseases such as liver disease, the value is much lower than in healthy individuals. Therefore, albumin preparations with high P HMA should be used for administration to patients with these diseases. An albumin preparation whose P HMA is within the scope of the present invention satisfies this condition and has a preferred composition as a preparation. The P HMA of the present invention is more preferably 65% or more. P HMA in plasma, pharmaceutical products, etc. is determined by the area of mercaptalbumin and non-mercaptalbumin in a chromatogram obtained by liquid chromatography using ultraviolet absorption at a wavelength of 280 nm as a detector, or the value equivalent to the area, respectively. Q HMA , Q HNA , (1)
It can be found from Eq. The packing material and mobile phase used in liquid chromatography can be selected as long as they can separate mercaptoalbumin from non-mercaptalbumin, but high-performance liquid chromatography using hard gel as a packing material is fast. It is excellent and preferable. Such conditions are shown, for example, in Japanese Patent Application No. 177505/1983. Further, the amount of cystine and/or oxidized glutathione in the albumin preparation of the present invention is preferably 5 mol% or less based on the total amount of albumin. Mercaptalbumin reacts with cystine and oxidized glutathione and turns into non-mercaptalbumin. Since the coexisting cystine and oxidized glutathione are within the above range, the composition of albumin hardly changes during heat treatment or storage, and a preferable composition with a high P HMA can be maintained. In order to keep albumin more stable, the amount of cystine and/or oxidized glutathione should be as small as possible, more preferably 3 mol% or less, and most preferably 1 mol% or less. Here, the structures of cystine and oxidized glutathione are represented by the following formulas (2) and (3), respectively. Cystine and oxidized glutathione can be analyzed using a conventional amino acid analyzer. Next, an example of the production method of the albumin preparation of the present invention will be described, but the present invention is not limited to this production method. General operations are conducted in accordance with the "Biological Products Standards" supervised by the Pharmaceutical Affairs Bureau of the Ministry of Health and Welfare. The raw plasma used is preferably fresh plasma from a healthy person whose albumin contains PHMA of 60% or more, more preferably 65% or more. Fractionation is quickly performed using this plasma. The fractionation method may be a commonly used method such as Cohn's cold ethanol method. Somewhere before, during or after the fractionation procedure, low molecular weight compounds containing -S-S- bonds such as cystine and oxidized glutathione are removed by dialysis using an albumin-impermeable membrane or ultrafluid. . This operation is preferably performed at least before the heat treatment. After further purification if necessary, it is dissolved in sodium acetyltryptophan/sodium caprylate solution, dispensed, and heated to form a preparation. When using plasma with P HMA of 60% or less,
For example, by performing liquid chromatography under the conditions shown in Japanese Patent Application No. 57-177505, the mercaptoalbumin and non-mercaptoalbumin peaks are separated on the chromatogram, and the mercaptoalbumin content is 60% or more. By taking
It is also possible to obtain an albumin fraction for obtaining the formulations of the invention. It is also possible to obtain an albumin fraction with a high P HMA content by reacting dithiothreitol with albumin to convert nonmercaptoalbumin into mercaptoalbumin, and then sufficiently performing the necessary purification. Needless to say, when carrying out these operations, sufficient care must be taken to ensure that the test items of the "Biological Products Standards" are met at each stage. The albumin preparation of the present invention has a high P HMA , which is almost equal to or higher than that of healthy human plasma.
It shows HMA , so it is recommended for people with kidney and liver diseases, etc.
It is suitable for use in treating patients with low plasma albumin PHMA . Moreover, since the formulation contains less cystine, oxidized glutathione, etc., the above-mentioned preferred state can be maintained for a long period of time. Experiments and Examples conducted in connection with the present invention will be described below, but the present invention is not limited to the Examples. Experiment 1 Analysis of albumin in the serum of a healthy individual was conducted using high performance liquid chromatography. (Conditions) Column Asahipak GS520, inner diameter 7.5mm, length 50
cm, 4 pieces [Asahi Kasei Industries, Ltd.] Pump JASCO Corporation Twincle Detector UV detector (280nm) JASCO Corporation
UVIDEC sample Healthy human plasma mobile phase within 1 day after blood collection 0.1M sodium phosphate + 0.3M sodium chloride (PH7.0) Flow rate 0.5ml/min Temperature 28℃ (Results) Chromatograph obtained as shown in Figure 1 A of gram
The areas of (mercaptoalbumin) and B (nonmercaptoalbumin) were determined as Q HMA and Q HNA , respectively, and calculated using equation (1) to obtain P HMA .
【表】
実験 ２
市販アルブミン製剤中のアルブミンの分析
（条件）
サンプルを除き実験１と同様に行なつた。
（結果）
第２図のように、得られるクロマトグラムから
実験１と同様に求めた。図中、Ａはメルカプトア
ルブミン、Ｂはノンメルカプトアルブミンであ
る。[Table] Experiment 2 Analysis of albumin in a commercially available albumin preparation (conditions) The same procedure as in Experiment 1 was conducted except for the sample. (Results) As shown in FIG. 2, the results were determined in the same manner as in Experiment 1 from the obtained chromatogram. In the figure, A is mercaptalbumin and B is non-mercaptalbumin.
【表】
実施例
健常人より採血した血液を直ちに５℃で遠心分
離して血清を得た。血漿中のＰHMAは70％であつ
た。ＰHMAの測定は実験１と同じ条件で行なつ
た。この血清の透析を、含硫化合物除去の前処理
をしたセロフアン膜と0.08M NaCl＋イオン強度
0.02のリン酸ナトリウム（PH7.54）よりなる透析
液を用いて行ない、血清のシスチンや酸化型グル
タチオンの除去を行なつた。透析後の液には、シ
スチンや酸化型グルタチオンは検出されなかつ
た。さらに、この液を用いてCohnの冷エタノー
ル法によつて分画を行ないアルブミン分画を得
た。
このアルブミン分画をアセチルトリプトフアン
ナトリウム・カプリル酸ナトリウム液に溶解し、
アルブミン濃度が４％の液をつくつたのち、60℃
で10時間加温して製剤を得た。この製剤を実験１
の場合と同様に分析して得られたクロマトグラム
を第３図に示した。製剤のＰHMAは68％で、シス
チンや酸化型グルタチオンをアミノ酸分析計によ
つて分析したが検出されなかつた。また、本実施
例における中間製品および最終製品は、いずれも
「生物学的製剤基準」の試験の項目を満たすもの
であつた。この製剤を肝臓疾患者に用いたが、従
来の市販の製剤と同様に用いることができた。[Table] Example Blood collected from a healthy person was immediately centrifuged at 5°C to obtain serum. P HMA in plasma was 70%. The measurement of P HMA was carried out under the same conditions as in Experiment 1. Dialysis of this serum was performed using a cellophane membrane pretreated to remove sulfur-containing compounds and 0.08M NaCl + ionic strength.
A dialysate containing 0.02 sodium phosphate (PH7.54) was used to remove serum cystine and oxidized glutathione. Cystine and oxidized glutathione were not detected in the fluid after dialysis. Further, using this liquid, fractionation was performed by Cohn's cold ethanol method to obtain an albumin fraction. This albumin fraction was dissolved in sodium acetyltryptophan/sodium caprylate solution,
After making a solution with an albumin concentration of 4%, 60℃
A preparation was obtained by heating for 10 hours. Experiment 1 using this preparation
A chromatogram obtained by analysis in the same manner as in the case of is shown in FIG. The P HMA of the preparation was 68%, and cystine and oxidized glutathione were analyzed using an amino acid analyzer but were not detected. Further, both the intermediate product and the final product in this example met the test items of the "biological product standards". This preparation was used in patients with liver disease, and could be used in the same manner as conventional commercially available preparations.
【図面の簡単な説明】[Brief explanation of the drawing]
第１図は実験１で得られた健常人血漿を液体ク
ロマトグラフイーで分析して得られたクロマトグ
ラムの１つ、第２図は市販アルブミン製剤を同様
に分析して得られたクロマトグラム、第３図は実
施例１で得た製剤を同様に分析して得られたクロ
マトグラムである。
Figure 1 is one of the chromatograms obtained by analyzing the healthy human plasma obtained in Experiment 1 using liquid chromatography, and Figure 2 is a chromatogram obtained by similarly analyzing a commercially available albumin preparation. FIG. 3 is a chromatogram obtained by similarly analyzing the preparation obtained in Example 1.