【発明の詳細な説明】[Detailed description of the invention]
本発明は新規な酵素であるセレノシステインリ
アーゼに関する。
セレノシステインリアーゼ（Selenocystein
lyase）は、
セレノシステイン＋ジチオスレイトール→
アラニン＋セレン化水素
＋酸化型ジチオスレイトール
の反応を触媒する酵素である。
本酵素は本発明者が初めて発見した酵素であり
セレノシステインの分析および上記反応の応用面
で有用である。
セレン化合物は一般には毒性の強い化合物とさ
れているが、人間および動物にはその生命維持の
ためには不可欠の微量必須要素とされている。セ
レン化合物の生体内における作用機作については
未だほとんど知られていない。しかし乍ら、生体
にとつて必須であり重要な役割を果していること
は明らかにされている。ある疫学調査では、土壌
中に含まれているセレン化合物の濃度とそこに居
住している住民の癌発生率とは相関関係があると
いう結果が得られている。
セレン化合物は、生体内ではそのほとんどがセ
レノシステインの形で存在する。本酵素はそのセ
レノシステインに特異的に作用する酵素である。
すなわち、本酵素はジチオスレイトールの存在下
にセレノシステインを分解し、アラニンとセレン
化水素にする酵素であり、有機セレンを無機セレ
ンに変換する重要な作用を有している。
本酵素を利用することによつて、生体内で重要
なセレノシステインの定量を容易にすることが出
来る。すなわち、ジチオスレイトールの存在下で
本酵素を作用させて発生するセレン化水素または
アラニンを定量することによつてセレノシステイ
ンを定量することが出来る。このように、本発明
のセレノシステインリアーゼはセレノシステイン
の定量用試薬として有用である。
また、本発明のセレノシステインリアーゼは有
機性のセレノシステインを無機のセレン化水素に
変換させることが出来る。この現象を応用して生
体内のセレノシステインの濃度を調節したり、セ
レノシステインの代謝研究の材料として有用であ
る。
本酵素によつて触媒される反応には立体特異性
がある。すなわち、反応するセレノシステインは
Ｌ型のみであり、Ｄ型は全く反応しない。ちなみ
に、生体内に存在するセレノシステインは全てＬ
型でありＤ型は存在しない。また、酵素反応で生
成されるアラニンはＬ型のみでＤ型は生成しな
い。
本酵素は、基質特異性が強く、Ｌ―セレノシス
テインは基質になるが、Ｌ―システイン、Ｌ―ホ
モシステイン、Ｌ―セレノホモシステイン、Ｌ―
シスチン、DL―セレノシスチン、Ｌ―セレノホ
モシスチンは基質になり得ない。
本酵素は動物および細菌に広く分布している。
例えば、ラツト、マウス、ブタ、ネコ、イヌ、モ
ルモツト、サル、ウサギなどの生体組織に存在し
ている。臓器内分布は、例えばラツトを例にとれ
ば、脳、胸線、心臓、すい臓、脾臓、胃、小腸、
こう丸、骨格筋、肝臓、副腎などに多少なりとも
存在する。モルモツトの肝臓は特に活性が高い。
しかし、全血液には活性がない。
細菌では例えば、エツシエリヒア属、クラブシ
エラ属、バチルス属、アルカリゲネス属、コリネ
バクテリウム属、シユードモナス属に属する細菌
に分布する。特に、シユードモナス・アルカノリ
テイカIFO12319の培養菌体にはブタの肝臓のホ
モジネイトと同じ位の高い活性がある。
本酵素は、例えばブタの肝臓から次のような方
法で抽出精製される。
The present invention relates to a novel enzyme, selenocysteine lyase. Selenocysteine lyase (Selenocysteine)
lyase) is an enzyme that catalyzes the reaction of selenocysteine + dithiothreitol → alanine + hydrogen selenide + oxidized dithiothreitol. This enzyme is the first enzyme discovered by the present inventor, and is useful in the analysis of selenocysteine and in the application of the above reactions. Although selenium compounds are generally considered to be highly toxic compounds, they are considered to be essential trace elements for humans and animals to maintain their lives. Little is still known about the mechanism of action of selenium compounds in vivo. However, it has been revealed that it is essential for living organisms and plays an important role. An epidemiological study found that there is a correlation between the concentration of selenium compounds in soil and the incidence of cancer in people living there. Most selenium compounds exist in the form of selenocysteine in living organisms. This enzyme is an enzyme that specifically acts on selenocysteine.
That is, this enzyme is an enzyme that decomposes selenocysteine into alanine and hydrogen selenide in the presence of dithiothreitol, and has an important function of converting organic selenium into inorganic selenium. By using this enzyme, it is possible to easily quantify selenocysteine, which is important in vivo. That is, selenocysteine can be quantified by quantifying hydrogen selenide or alanine generated by the action of this enzyme in the presence of dithiothreitol. Thus, the selenocysteine lyase of the present invention is useful as a reagent for quantifying selenocysteine. Furthermore, the selenocysteine lyase of the present invention can convert organic selenocysteine to inorganic hydrogen selenide. This phenomenon can be applied to regulate the concentration of selenocysteine in living organisms, and it is useful as a material for research on selenocysteine metabolism. The reaction catalyzed by this enzyme has stereospecificity. That is, only the L-type selenocysteine reacts, and the D-type does not react at all. By the way, all selenocysteine present in living organisms is L.
type, and type D does not exist. Furthermore, only the L-type alanine is produced by the enzymatic reaction, and the D-type is not produced. This enzyme has strong substrate specificity, and L-selenocysteine is the substrate, but L-cysteine, L-homocysteine, L-selenohomocysteine, L-
Cystine, DL-selenocystine, and L-selenohomocystine cannot be substrates. This enzyme is widely distributed in animals and bacteria.
For example, it exists in living tissues of rats, mice, pigs, cats, dogs, guinea pigs, monkeys, rabbits, etc. For example, in rats, the distribution within organs includes the brain, thorax, heart, pancreas, spleen, stomach, small intestine,
It is present to some extent in testicles, skeletal muscles, liver, adrenal glands, etc. Guinea pig liver is particularly active.
However, whole blood has no activity. Among bacteria, for example, it is distributed among bacteria belonging to the genus Ethscherichia, Clubsiella, Bacillus, Alcaligenes, Corynebacterium, and Pseudomonas. In particular, cultured cells of Pseudomonas alkanolyteica IFO12319 have a high activity comparable to that of pig liver homogenate. This enzyme is extracted and purified from, for example, pig liver by the following method.
【表】
↓
ヒドロキシアパタイト、2.7×25cmカラム
↓
0.05M KP緩衝液(PH7.4)で溶出
↓
硫安濃縮：50％飽和
↓
透析
↓
セフアデツクス G−20でゲル濾過
↓
硫安濃縮：50％飽和
↓
透析
↓
ヒドロキシアパタイト、1.2×13cmカラム
↓
0.04M KP緩衝液(pH7.4)で溶出
上記した各段階における全蛋白、全活性、比活
性および収率は次表の通りである。[Table] ↓
Hydroxyapatite, 2.7×25cm column ↓
Elute with 0.05M KP buffer (PH7.4) ↓
Ammonium sulfate concentration: 50% saturation ↓
Dialysis ↓
Gel filtration with Sephadex G-20 ↓
Ammonium sulfate concentration: 50% saturation ↓
Dialysis ↓
Hydroxyapatite, 1.2×13cm column ↓
Elution with 0.04M KP buffer (pH 7.4) Total protein, total activity, specific activity, and yield at each step described above are shown in the following table.
【表】
このようにして得られた標品は、結晶化できな
かつたがデイスク電気泳動的および超遠心分析的
に均一である。
セレノシステインリアーゼの至適PHは、例えば
ラツトおよびブタの肝臓から得られた酵素では
9.0であり、シユードモナス アルカノリテイカ
から得られた酵素は7.5であり、ともにPH5.0〜
10.0の範囲で安定である。
作用適温の範囲は20〜50℃であり、−20℃で３
ケ月間、50℃で30分間は安定である。
本酵素はヒドロキシルアミンで活性を失なう
が、ピリドキサール燐酸の添加で活性が回復す
る。
ゲル過法で測定した分子量は93.000である。
本酵素の力価測定は次のように行なう。すなわ
ち、２―μmolのDL―セレノシステイン、５μ
molのジチオスレイトール、0.01μmolのピリド
キサール燐酸、40μmolのトリシン―NaOHに酵
素を加え、全液量を0.5mlとする。37℃で、窒素
ガス中で20分間反応させて後、5mMの酢酸鉛
（0.1NHCl溶液中）3.5mlを加え、15分以内に
400nmの吸光度を測定する。求められた吸光度
A400と発生したセレン化水素との関係は次の通
りである。
H2Sl（nmol／4.0ml）＝339×A400
なお、セレン化水素はＡl 2Sl3に水を加えて発生
させOTNBで定量しこれをもとに上記算出式を作
成した。
実施例
前記の力価測定法のところで酵素10μｇを使
用、２μmolのDL―セレノシステインの代りに
各種濃度のＬ―セレノシステインを添加し、次図
のような検量線が得られ、常法に従つてＬ―セレ
ノシステインの濃度を分析することが可能となつ
た。[Table] Although the specimen thus obtained could not be crystallized, it was homogeneous in disk electrophoresis and ultracentrifugation analysis. The optimum pH of selenocysteine lyase is, for example, for enzymes obtained from rat and pig liver.
9.0, and the enzyme obtained from Pseudomonas alkanolyteica has a pH of 7.5, both of which have a pH of 5.0~
It is stable within the range of 10.0. The suitable temperature range for action is 20 to 50℃, and 3 at -20℃.
It is stable for 30 minutes at 50℃ for several months. This enzyme loses its activity with hydroxylamine, but its activity is restored with the addition of pyridoxal phosphate. The molecular weight measured by gel filtration method is 93.000. The titer of this enzyme is measured as follows. That is, 2-μmol DL-selenocysteine, 5μmol
Add the enzyme to mol of dithiothreitol, 0.01 μmol of pyridoxal phosphate, and 40 μmol of tricine-NaOH to make a total volume of 0.5 ml. After reacting for 20 min in nitrogen gas at 37 °C, add 3.5 ml of 5mM lead acetate (in 0.1NHCl solution) and incubate within 15 min.
Measure the absorbance at 400nm. Determined absorbance
The relationship between A400 and generated hydrogen selenide is as follows. H 2 S 1 (nmol/4.0 ml) = 339×A 400 Hydrogen selenide was generated by adding water to A 1 2 S 13 and quantified using OTNB, and the above calculation formula was created based on this. Example 10 μg of enzyme was used in the titer measurement method described above, and various concentrations of L-selenocysteine were added in place of 2 μmol of DL-selenocysteine, and the calibration curve shown in the following figure was obtained. It has now become possible to analyze the concentration of L-selenocysteine.
【図面の簡単な説明】[Brief explanation of the drawing]
第１図はnmolで表わされたＬ―セレノシステ
インの濃度と400nmにおける吸光度A400との関
係を示した検量線である。
FIG. 1 is a calibration curve showing the relationship between the concentration of L-selenocysteine expressed in nmol and the absorbance A400 at 400 nm.