【発明の詳細な説明】
本発明は、下記構造
を有する化合物即ち９α−ヒドロキシ−３−オキ
ソプレグナ−４，17（20）−ジエン−20−カルボ
ン酸メチルエステル（以下９α−OH−PCMと略
すことがある）に関するものである。
９α−OH−PCMは、コルチコイド製造の為の
極めて重要な前駆体である。コルチコイド活性発
現の為に11β位に水酸基、17α位に水酸基がある
のが望ましいが、先ず本物質は９α位に水酸基を
有するので、C9−11位間二重結合導入を経由し
て、容易に11β位に合成法で水酸基が誘導され
る。
もしＢ環のC9位に水酸基がなければ、11β位
に水酸基が導入するには低濃度でしか進行しない
と云われる醗酵法に頼らざるを得なくなり、効率
が悪い。さらに９α位にフツ素原子などを含む高
活性コルチコイドの合成にも、９αに水酸基を有
するステロイドは有用な原料物質である。一方本
物質は、C17〜20位間に二重結合を有するので通
常は導入しにくい17α水酸基が有機合成法で容易
に導入されうる。
さらに本物質は、Ａ環C4〜５位間に二重結合
が存在する。通常コルチコイドはC4〜５位間に
二重結合を有するので、この点でも都合がよい。
コルチコイドの中にはＡ環にC4〜５位間のみ
ならずC1〜２位間に二重結合を有するジエン化
合物が多いが、前駆体の段階でジエン構造を有す
ると、11β位、17α位に水酸基を導入する時など
にC1〜２位間の二重結合の存在が邪魔になる事
があるので、本物質の如く中間体の段階ではＡ環
はモノエン構造の方がのぞましい。
さらに本物質は炭素数22のステロイドのエステ
ルであるが、この事により脱炭酸などの工程を経
て炭素数21を基本骨格とするコルチコイドに容易
に変換しうる。このように本物質はコルチコイド
製造の前駆体として理想的な化合物である。
本物質から典型的コルチコイドの１つであるハ
イドロコーチゾン・アセテートへの有機化学合成
のルートは種々あるが例えば次の如き方法があげ
られる。
図中で、「NBr」はＮ−プロモサクシイミド、
また「Ac」はアセチル基を表わす。
最終のハイドロコーチゾン・アセテートからさ
らにプレドニソロンにしたいなら、アースロバク
ター・シンプレツクスなどの微生物を用い脱水素
してC1〜２位間に二重結合を導入すればよい。
９α−OH−PCMは、例えば以下に述べる様に
して製造できる。
すなわち、下記構造
を有する３−オキソプレグナー４，17（20）−ジ
エン−20−カルボン酸メチルエステル（以下
PCMと略す）を基質とし、９α位に水酸基を導
入できる微生物を醗酵させることにより９α−
OH−PCMが製造できる。
このような９α位に水酸基を導入できる微生物
としては、ロドコツカス（以下「Ｒ」と略す）属
に属するものが好適である。
さらに詳しくはR.エクイ（equi）に属する微生
物が用いられる。R.エクイに属する菌としては
ATCC6939，7698，7699，10146，21107，
21280，21329，21521および21690号各菌ならびに
IAM1038号菌が知られている。
そのなかでもATCC21329号菌および
ATCC21521号菌が特にすぐれている。ここでこ
れらR.エクイなる種は従来コリネバクテリウ
ム・エクイ（以下「C.エクイ」と略す）と称さ
れてきたものである。
このC.エクイがR.エクイに変更された経緯は
次の如くである。
先ず、ツカムラ・ミチオ（M.Tsukamura）が
ジヤーナル・オブ・ジエネラル・マイクロバイオ
ロジー（J.Gen・Microbiol.）68巻、15〜26頁
（1971年）において抗酸性わずかで、アリルスル
フアターゼ（２週間）活性なく、シヨ糖を唯一炭
素源として利用出来、かつトリメチレンジアミン
を炭素・窒素源としては同時には利用出来ない一
群の微生物は、ミコバクテリウム（以下「M.」
と略す）属およびノカルデイア（以下「N.」と
略す）属とは明確に区別出来るとし、M.属、N.
属の中間でやゝＮ属よりの新たな属を創設し、そ
の中に入れるのが妥当であるとした。そして、こ
れら一群の微生物をゴルドナ（以下「G.」と略
す）属と呼ぶ事を提唱した。この際G.属中にツ
カムラ＃3410（＝ATCC，25592，NCTC
10667）を基準菌株（type strain）とするG.ブロ
ンチアリス（bronchialis）、ツカムラ＃3605（＝
ATCC 25593，NCTC 10668）を基準菌株とする
G.ルブラ（rubra）、ツカムラ＃3612（＝ATCC
25594，NCTC 10669）を基準菌株とするG.テラ
エ（terrae）の三種をおき、基準種（type
species）をG.ブロンチアリスとした。のちにG.
ルブラは、ジヤパニーズ・ジヤーナル・オブ・マ
イクロバイオロジー（Japan.J.Microbiol.）17
巻、３号、189〜197頁（1973年）において、ツカ
ムラ・ミチオによりG.ルブロパーテインクタ
（rubropertincta）と変名されている。翌年ツカ
ムラ・ミチオは同誌、18巻、１号、37〜44頁
（1974年）において、従来M.ロドクロウス
（rhodochrous）等として名付けられていたロド
クロウス群（“Rhodochrous”group）の分類学
的位置のみなおしを行ない、その中にはG.属に
属させるべきものが多いとした。そして既述の３
種のG.属に入らぬものを新たなる群にわけ、そ
れらに基づきG.オーランテイアカ
（aurantiaca）、G.ロドクロア（rhodochroa）およ
びG.ロゼア（rosea）なる三種を追加した。しか
しこの際G.属に属すべきと考えられるM.ロドク
ロウスATCC 13808号菌が既に古くゾプフ
（zopf）によりBer.Dtsch.Botan.Gas.9巻、22〜28
頁（1891年）においてロドコツカス・ロドクロウ
ス（Rhodococcus rhodochrous）と呼ばれていた
ものである事がわかり、合法的かつ最も古い属名
を優先させるべきとの命名規約に従つて、自ら名
付けたG.属なる名称はＲ属に変更すべきと主張
した。
一方グツトフエロー（Goodfellow）らはジヤ
ーナル・オブ・ジエネラル・マイクロバイオロジ
ー、100巻、99〜122頁（1977年）において、G.
属菌を含み所謂ロドクロウス混合群
（“rhodochrous”complex）およびその周辺菌の
分類再編成を行ない、ツカムラと同様従来のM.
属菌、N.属菌とは明確に異なる新属の存在を認
めツカムラ同様Ｒ属と呼ぶ事を確認した。そして
従来のM.属菌、N.属菌についても見なおしを行
ない、従来M.属菌またはN.属菌とされてきたも
のでR.属に編入させるべきものがかなりあると
して、これらに基づきＲ属をさらに修正
（emendation）し９種にわけた。それらは、R.ロ
ドクロウス（rhodochrous）、Ｒブロンチアリス
（bronchialis）、R.コラリナス（corallinus）、R.
エリスロポリス（erythropolis）R.エクイ
（equi）、R.ロードニー（rhodnii）、R.ルブラス
（rubrus）、R.ルブロパーテインクタス
（rubropertinctus）およびR.テラエ（terrae）で
ある。
ここでR.エクイを創設した際に、従来C.エク
イと称されてきた一群の微生物を基準菌株に
ATCC 25729号菌を指定して、その正名にR.エク
イ〔マグナツソン（Magnusson）〕グツドフエロ
ー・エ・アンダーソン（Goodfellow et
Anderson）を採用した。このATCC 25729号菌
はNCTC 1621号菌に由来し、バージーズ・マニ
ユアル・オブ・デターミナテイブ・バクテリオロ
ジー第８版におけるC.エタイの記載の中で参考
菌株（Reference strain）として（基準菌株は何
も指定されていない）記載されているものであ
る。
一方M.属およびN.属にも属さない新しい属
（Ｒ属）の創設の必要性について1974年にすでに
ジヤーナル・オブ・ジエネラル・マイクロバイオ
ロジー、85巻、291〜302頁（1974年）においてグ
ツドフエローとツカムラばかりでなくこの方向の
最も権威のある３つの分類研究グループであるリ
ンド（Lind）、モルダルスカ（Mordarska）およ
びパチン（Pattyn）も認めている。
さらには現在最も信頼のおける論文は詳細な菌
学的性質を記載したグツドフエロー（1977年、前
出）らのものであるから、C.エクイはグツドフ
エローらの分類に従つて、R.エクイと考えるの
が現在のところ最も妥当である。 これらの細菌
学的性質は、ツカムラ（前出、1971年）、ツカム
ラ（ジヤーナル・オブ・システマテイツク・バク
テリオロジー、25巻、377〜382頁（1975年））お
よびグツドフエローら（前出、1977年）に詳述さ
れている。
これらＲ属による９α位水酸化反応は、増殖菌
体（growing cells）の状態でも休止菌体
（resting cells）の状態でもどちらでもよい。
休止菌体の場合は、不溶物を含まぬ培地で培養
し、遠心分離などにより菌を集菌し、基質を含む
緩衝液、生理的食塩水、水などに再び懸濁して転
換反応を行なう。反応中の通気撹拌が必要であ
る。
次に増殖菌体を用いる場合について詳述する
と、炭素源、窒素源、無機塩類および必要に応じ
てビタミン等の栄養素を含む培地を殺菌し、これ
にＲ属菌を接種して振盪培養ないしは通気撹拌培
養を行なう。用いられる培地は次のようなもので
ある。
炭素源としては、たとえば、ｎ−パラフイン、
α−オレフイン、キシレン等の炭化水素；メタノ
ール、エタノール、グリセリン、高級アルコール
等のアルコール類；コハク酸、酢酸、高級脂肪酸
等の有機酸およびその塩；澱粉、麦芽糖、シヨ
糖、ブドウ糖、ラムノース等の糖類；アマニ油、
大豆油、ゴマ油、トウモロコシ油、ナタネ油、パ
ーム油、魚油、牛脂、タロー油脂などの油脂類が
あげられる。炭素源、窒素源およびその他の栄養
物質を含む天然栄養源としては、たとえばアマニ
油脂粕、脱脂大豆粕、綿実油粕、ナタネ油粕など
の植物油脂粕類；ハイテスト糖蜜、精製糖蜜およ
びキシロース糖蜜を含む糖蜜類；バカス、コーン
コブ、アルフアルフア、コーンステイ−ブリカ
ー、デイステイラーズソルブル、味液、魚粉、フ
スマ、肉エキス、酵母、酵母エキス、ポテトエキ
ス、麦芽エキス、グルテン、ペプトン、グルタミ
ン酸塩、アスパラギン、グリシン、カゼイン、カ
ゼイン分解物、スキムミルクがあげられる。
また、培地に添加される無機物としては例えば
硫安、塩安などの窒素源；リン酸水素二カリウム
等のカリウムおよびリン源；鉄、銅、マグネシウ
ム、マンガン、コバルト、亜鉛、カルシウム等の
塩類；糖蜜等天然物の灰化物があげられる。その
他必要に応じてビタミン類を添加することもでき
る。
培地の組成を用いる菌糖の種類の応じて選ばれ
るが、炭素源、窒素源、カリウム、リンおよびマ
グネシウムは培地成分として不可決である。
消泡剤が必要な場合には周知のものを添加すれ
ばよい。具体的にはポリオキシアルキレングリコ
ールなどが挙げられるが必ずしも消泡剤を添加す
る必要はない。
界面活性剤は乳化剤として有効である場合が多
い。界面活性剤としては、非イオン系及び陰イオ
ン系のものが好ましい。具体的にはたとえば、ポ
リオキシエチレンソルビタンモノステアレート、
ソルビタンモノパルミテート、ポリエチレングリ
コールモノステアレートなどを挙げることができ
る。
増殖菌体、休止菌体を問わず反応温度は通常20
〜40℃であるが、28〜37℃付近が最適である。
反応液（緩衝液、培地など）のPHは通常５〜10
に調整されるが、６〜９が好ましい。
菌濃度が低いと、この転換反応は遅れるので、
R.属菌の濃度は１×109／ml以上、のぞましくは
１×1010／ml以上になるよう調整するか、培養す
る事がのぞましい。
原料であるPCMは培地と共に殺菌したり、ま
た培養開始後、培地に添加してもよい。また分割
添加も可能である。この場合、乾燥殺菌あるいは
湿熱殺菌後そのまま添加するか、あるいはジメチ
ルホルムアミド、メタノール等の溶媒に溶解して
溶液として添加するか、あるいは超音波処理によ
り微細に分散懸濁液として添加する。その際、界
面活性剤を同時に添加するとPCMの分散がより
促進される場合が多い。
転換に要する時間は、菌濃度、温度、PHなどに
より一律には云いがたいが、通常７日以内、早い
ときは１〜２日で反応停止した方がよい場合が多
い。通常生成した９α−OH−PCMは時間が経過
しすぎるとさらに分解を受けて減少するので、そ
の生成量を時間と共に定量し、減少しはじめたら
熱殺菌、酸・アルカリ添加、有機溶媒添加などに
より停止する必要がある。
９α位水酸化酵素は、一般に誘導酵素と考えら
れるから、Ｒ属菌の種培養の段階で少量のPCM
を添加し、酵素を誘導しておいた方がのぞましい
ことがある。
転換反応終了後、培養液中等に生成した９α−
OH−PCMは既知の方法で採取、分離精製されう
る。例えば、培養液から９α−OH−PCMを等量
ないしは数倍量のクロロホルム、酢酸エチルなど
の水と混和しにくい有機溶媒で抽出し、抽出液か
ら溶媒を留去させたのち、得られた粗９α−OH
−PCMは多孔性樹脂、シリカゲル、アルミナ等
を吸着剤とし、石油エーテル、ベンゼン、クロロ
ホルム、エーテル、アセトン、エタノール、メタ
ノール、酢酸エチル等を溶離剤とするカラムクロ
マトグラフイーにより、残存基質、副生物等から
分離されうる。
しかし、通常９α−OH−PCMが主体となす場
合は、クロマト操作する事なく、メタノール、酢
酸エチル、アセトンなどに溶解させて再結晶を繰
り返せば９α−OH−PCMの純結晶を得る事がで
きる。
基質として用いられるPCM微生物反応で別の
原料から転換して製造する場合には、その醗酵液
にR.属菌を接種する事によりPCMを培養液から
単離する事なく所謂二段醗酵ないしは混合培養に
より目的の９α−OH−PCMを製造する事が可能
である。そのような例として例えばステロール類
よりＭスピーシーズNRRL Ｂ−8054号菌とＲ属
菌との二段培養による９α−OH−PCMの製造が
あげられる。このNRRL Ｂ−8054号菌はPCMだ
けでなくメチルエステルではないfreeのカルボン
酸である３−オキソプレグナ−４，17（20）ジエ
ン−20−カルボン酸も生成するが、通常ははるか
にPCMの方を多く生産する。従つてR.エクイと
の２段培養では９α−OH−PCMの方が９α−ヒ
ドロキシ−３−オキソプレグナ−４，17（20）−
ジエン−20−カルボン酸よりはるかに多く培養液
中に生産される。
ここでステロール類とは各種ステロールまたは
それらの酸化中間体を総合してステロール類と称
す。各種ステロールとはペルヒドロシクロペンタ
ノフエナントレン核のＣ−３位にヒドロキシル基
を、通常Ｃ−５位に二重結合を、Ｃ−17位に炭素
数８ないし10個の鎖式の側鎖を有し、場合によつ
てはＣ−７，Ｃ−８，Ｃ−９（11）等に二重結合
を有してもよい。
このような各種ステロールとしては、コレステ
ロール、スチグマステロール、カンペステロー
ル、β−シトステロール、エルゴステロール、ブ
ラツシカステロール、フコステロール、ラノステ
ロール、アグノステロール、ジヒドロラノステロ
ール、ジヒドロアグノステロール、α−シトステ
ロール等が挙げられる。好ましいステロールはコ
レステロール、カンペステロール、スチグマステ
ロールおよびβ−シトステロールである。
魚油やいか油からのアルカリ洗浄ダーク油、さ
らに植物油の脱臭スカム、脱臭スラツジ、トール
油などのステロール含有天然物および加工物も同
様に原料として使用される。
さらに各種ステロールの酸化中間体も基質とし
て使用される。このような酸化中間体の中には各
種ステロールの４−エン−３−オン誘導体等が挙
げられるが、具体的には、たとえば、コレスト−
４−エン−３−オン、ステイグマスタ．４，22−
ジエン−３−オン、コレスタ−４，22−ジエン−
３−オン等である。
この二段醗酵の培養方法は第１段の醗酵が進行
中はその最適の条件で培養し、R.属菌を接種し
た後は、R.属菌の最適条件で培養した方がのぞ
ましい。従つてPCM醗酵中にPHが極端にかたよ
つた場合などにはR.属菌の接種時に、酸・アル
カリを添加する事によりPHを７付近に調整しなお
してもよいし、その方が良い場合が多い。
R.属菌を接種する時期は、第１段の醗酵が始
まつたばかりの時に行なうより、むしろ終了に近
くなつてから行なつた方が結局９α−OH−PCM
生産量が多くなる事が多い。
R.属菌の接種の際、第１段に醗酵を熱処理な
どで必ずしも停止する必要はない。第１段醗酵が
未だ進んでいるところへR.属菌を接種し、その
まま両菌が混合培養されている状態でも９α−
OH−PCMが多量生産される。
このように二段培養ないしは混合培養が可能で
あるが、培地に関しては第１段醗酵にとつて最適
な培地でPCM生産醗酵を行ない、それに通常は
新成分を加える必要なく、R.属菌を接種して９
α−OH−PCMを生成させて何らさしつかえな
い。栄養不十分と思われる時には、R.属菌接種
の前後に殺菌した肉エキス、脱脂大豆、硝酸アン
モニウムなどの新成分を培養液に添加してもよ
い。
R.属菌の培養液の接種量は第１段培養液あた
り通常0.1〜30％位でのぞましくは１〜15％であ
る。
本発明によれば９α−OH−PCMを培地中に高
濃度で生成させる事ができる。またステロールか
らPCM，PCMから９α−OH−PCMの二段の反
応を醗酵法で有利に行うことにより、安価なステ
ロール類より９α−OH−PCMを安価に生成する
ことを可能にした。
以下の実施例で本発明をさらに詳細に説明する
が、本発明はその要旨を超えない限り、以下の実
施例に限定されない。なお、以下の実施例におい
て、ステロイドの定量は、必要あらばシリル化後
ガスクロマトグラフイーおよび液体クロマトグラ
フイーにより行なつた。また以下の実施例におい
て、パーセントは重量による。
実施例 １
グルコース1.0％、肉エキス0.3％、ペプトン1.0
％、食塩0.5％および水よりなる種培地（PH7.0）
を、500ml肩付コルベンに100ml分注し、120℃、
20分間蒸気殺菌する。これにR.エクイ（equi）
ATCC 21329号菌を１自金耳接種し、30℃で120
往復／分、振幅７cmの往復振盪機で52時間種培養
する。この種培養液４mlを、綿実粕4.0％、酵母
1.5％、大豆油1.5％、NaNO30.2％、K2HPO40.1
％、MgSO4・7H2O0.1ｇおよび水よりなる本培養
培地50ml（PH7.0，120℃で20分間蒸気殺菌）を含
む500ml肩付きフラスコ１本に接種する。本培養
は30℃で120往復／分振幅７cmの往復振盪条件で
行い、培養開始後30時間目に殺菌したPCM（粉
末）1.0ｇを無菌的に添加する。その後さらに培
養を続け、PCM添加後48時間で培養を停止し、
培養液を150mlの酢酸エチルで抽出する。この抽
出液をガスクロマトグラフイーで分析した結果、
0.50ｇの９α−OH−PCMの存在が確認された。
この物質を同定する為に抽出液を濃縮し、シリカ
ゲルの薄層クロマトグラフイーで展開し、該当部
分をかき取り溶媒（酢酸エチル）で溶出し、さら
に酢酸エチル、エチルエーテルより再結晶を繰り
返した結果、約300mgの純結晶を得ることができ
た。
この物質は融点202〜204℃を示す無色柱状晶
（エチルエーテル）であつた。その赤外線吸収ス
ペクトラム（KBr Disc）は3520cm-1（OH由
来）、1690cm-1、1660cm-1に極大吸収を持つてい
た。質量分析の結果、Ｍ／ｅ＝372にM+分子イオンピ
ークさらに340にＭ−CH3OHに由来ると思われる
baseピークを持つていた。NMR分析の結果は次
の通りである。
NMR（CDCl3中）
0.97（3H，ｓ，18−CH3）
1.33（3H，ｓ，19−CH3）
1.95（3H，ｔ，Ｊ＝〜２Hz，21−CH3）
3.68（3H，ｓ，COOCH3）
5.86（1H，br−ｓ，４−Ｈ）
（C5D5N中）
0.93（3H，ｓ，18−CH3）
1.26（3H，ｓ，19−CH3）
2.02（3H，ｔ，Ｊ＝〜２Hz，21−CH3）
3.67（3H，ｓ，COOCH3）
6.02（1H，br−ｓ，４−Ｈ）
この物質は次の構造を有する９α−OH−PCM
と考えられる。
一方、前述と同じ組成でただ最初から1.0ｇの
PCMを含有した本培養培地50mlを500ml肩付フラ
スコ中で調製する。これを蒸気殺菌後、前述の種
培養を同量同時に接種する。これを途中にPCM
の添加をすることなく同一条件で培養した後、48
時間で培養を停止する。この培養液を150mlの酢
酸エチルで抽出し、その中の９α−OH−PCM含
量を測定した結果、0.47ｇの９α−OH−PCMの
存在する事が確認された。
実施例 ２
グルコース1.0％、肉エキス0.3％、ペプトン1.0
％、酵母エキス0.5％、PCM0.02％および水より
なる種培地（PH7.0）を500ml肩付コルベンに100
ml分注し、120℃、20分間蒸気殺菌する。これに
R.エクイATCC 21329号菌を１白金耳接種し、30
℃で120往復／分、振幅７cmの往復振盪機で48時
間培養する。この種培養をすべてあわせ、冷却遠
心分離にて菌を沈降させ集菌する。生理的食塩水
にて２回洗浄後、1.0％のPCMを含有する燐酸緩
衝液（PH7.5，1/20Ｍ）25mlに菌体を懸濁する。
この懸濁液30mlを500ml肩付フラスコに入れ、種
培養と同一条件にて振盪する。反応液を12時間振
とう後、150mlの酢酸エチルで抽出し、抽出液中
の９α−OH−PCM含量を測定した結果12時間目
に約50mgの９α−OH−PCMの存在を確認した。
実施例 ３
実施例１と同様にしてR.エクイATCC 21521号
菌を種培養した。この種培養液２mlを、脱脂大豆
粉4.0％、酵母2.0％、K2HPO4 0.25％、MgSO4・
7H2O0.1％、NH4NO50.2％、大豆油1.0％、
PCM1.5％および水よりなる本培養培地50mlを含
む500ml肩付フラスコ（PH7.0，120℃，20分間蒸
気殺菌）１本に接種する。30℃、120往復／分、
７cm振幅の条件で培養し59時間で培養を停止す
る。その後酢酸エチル150mlを用いて培養液を抽
出したところ、抽出液中に0.35ｇの９α−OH−
PCMの存在が確認された。
実施例 ４
グルコース1.0％、肉エキス1.0％、ペプトン1.0
％および水よりなる種培地（PH7.2）100mlを500
ml肩付きフラスコに分注し、120℃で15分間蒸気
殺菌後、ミコバクテリウム スピーシーズ
NRRL Ｂ−8054号菌を１白金耳接種し、30℃で
120往復／分、振幅７cmの往復振盪条件で72時間
種培養する。この種培養液２mlを丸大豆麿砕物
4.0％、酵母1.0％、NaNO30.2％、K2HPO40.2
％、MgSO4・7H2O0.1％、コレステロール1.5％
および水からなる本培養培地100mlを含む500ml肩
付きフラスコ（PH7.0、120℃で20分間蒸気殺菌）
５本に接種する。本培養は30℃で、120往復／
分、振幅７cmの往復振盪条件で行う。培養開始後
220時間目にPHを無菌的に７付近に調整し、さら
にここに実施例１と同様にして種培養したR.equi
ATCC 21329号菌８mlを夫々のフラスコに接種す
る。接種後、同一振盪条件で30℃で48時間培養を
継続する。培養停止後培養液を全て併せ、１回に
1.5の酢酸エチルで２回抽出し、併せた抽出液
中のステロイド含量を測定した結果９α−OH−
PCM0.96ｇの存在が確認された。
実施例 ５
グルコース1.0％、肉エキス1.0％、ペプトン1.0
％および水よりなる種培地（PH7.2）100mlを500
ml肩付きフラスコに分注し、120℃で15分間蒸気
殺菌後、ミコバクテリウム スピーシーズ
NRRL Ｂ−8054号菌を１白金耳接種し30℃で120
往復／分、振幅７cmの往復振盪条件で56時間種培
養する。この種培養液20mlを綿実粕4.0％、酵母
1.5％、大豆油1.0％、NaNO30.2％、K2HPO40.1
％、MgSO4・7H2O0.01％、コレステロール2.0％
および水よりなる本培養培地800ml（PH7.0、120
℃で20分間蒸気殺菌）を含む６容肩付きフラス
コ２本に接種する。本培養は30℃で100往復／
分、振幅７cmの往復振盪条件で行い、培養開始後
240時間目に１本は熱殺菌せずにPHを７付近に調
整し、それと同時に実施例３と同様にして種培養
したR.エクイ ATCC 21521号菌を50ml接種す
る。もう１本は120℃、30分の蒸気殺菌を施し、
冷却後、直ちにPHを７付近に調整後、同じR.エ
クイATCC 21521号菌の種培養を50ml接種する。
接種後同時に２本のフラスコの培養を再開する。
再開後48時間で培養を中止し、各々のフラスコの
培養液を1.6の酢酸エチルで抽出した結果、R.
エクイ接種前熱殺菌した方は1.67ｇ、熱殺菌しな
い方は1.60ｇの９α−OH−PCMが生成してい
た。
実施例 ６
グリセロール2.0％、丸大豆麿砕物2.0％、酵母
エキス1.0％、NaNO30.2％、K2HPO40.1％および
水よりなる種培地（PH7.2に調整）100mlを含む
500ml肩付きコルベンを120℃、20分間蒸気殺菌す
る。これにミコバクテリウム スピーシーズ
NRRL Ｂ−8054号菌を１白金耳接種する。接種
後、30℃で120往復／分、振幅７cmの往復振盪条
件で68時間種培養する。この種培養20mlを脱脂大
豆麿砕物4.0％、酵母1.5％、綿実油粕1.0％、
NH4NO30.1％、MgSO4・7H2O0.1％、K2HPO40.1
％、花王アトラス社製ノニオン界面活性商標
“Tween−60”0.05％、表２の各種のステロール
類2.0％および水よりなる本培養培地50mlを含む
500ml肩付フラスコ（合計５本）に接種する。接
種後30℃で120往復／分、７cm振幅の条件で培養
する。192時間培養後、実施例２と同様にして培
養したR.エクイ（equi）ATCC 21329号菌の種培
養液４mlを接種する。同時にNH4NO350mg、酵母
エキス200mgを含んだ殺菌水５mlを添加する。そ
してPHを７付近に調整する。このあとさらに48時
間培養を継続し48時間目に培養を停止し、各フラ
スコを150mlの酢酸エチルを用いて、培養液から
ステロイドを抽出する。この抽出液中の９α−
OH−PCMの量を表１にかかげる。
【表】[Detailed Description of the Invention] The present invention provides the following structure 9α-hydroxy-3-oxopregna-4,17(20)-diene-20-carboxylic acid methyl ester (hereinafter sometimes abbreviated as 9α-OH-PCM). 9α-OH-PCM is a very important precursor for corticoid production. In order to express corticoid activity, it is desirable to have a hydroxyl group at the 11β-position and a hydroxyl group at the 17α-position, but first of all, since this substance has a hydroxyl group at the 9α-position, it can be easily absorbed through the introduction of a double bond between the C9 and 11 positions. A hydroxyl group is induced at the 11β position by a synthetic method. If there is no hydroxyl group at the C9 position of the B ring, the introduction of a hydroxyl group at the 11β position would have to rely on a fermentation method that is said to proceed only at low concentrations, which would be inefficient. Furthermore, steroids having a hydroxyl group at the 9α position are useful raw materials for the synthesis of highly active corticoids containing a fluorine atom or the like at the 9α position. On the other hand, since this substance has a double bond between the C17 and C20 positions, the 17α hydroxyl group, which is normally difficult to introduce, can be easily introduced by organic synthesis. Furthermore, this substance has a double bond between the C4 and C5 positions of the A ring. Since corticoids usually have a double bond between the C4 and C5 positions, they are advantageous in this respect as well. Among corticoids, there are many diene compounds that have a double bond not only between the C4 and C5 positions but also between the C1 and C2 positions in the A ring, but if they have a diene structure in the precursor stage, they have double bonds at the 11β and 17α positions. When introducing a hydroxyl group, the presence of a double bond between the C1 and C2 positions may become an obstacle, so it is preferable for the A ring to have a monoene structure in the intermediate stage, such as in this substance. Furthermore, this substance is an ester of a steroid with 22 carbon atoms, which allows it to be easily converted into a corticoid with a basic skeleton of 21 carbon atoms through processes such as decarboxylation. Thus, this substance is an ideal compound as a precursor for the production of corticoids. There are various routes for organic chemical synthesis from this substance to hydrocortisone acetate, which is one of the typical corticoids, and examples include the following methods. In the figure, "NBr" is N-promosuccinimide,
Moreover, "Ac" represents an acetyl group. If you want to make prednisolone from the final hydrocortisone acetate, you can dehydrogenate it using a microorganism such as Arthrobacter simplex to introduce a double bond between the C1 and C2 positions. 9α-OH-PCM can be produced, for example, as described below. That is, the following structure 3-oxopregner 4,17(20)-diene-20-carboxylic acid methyl ester (hereinafter referred to as
PCM) is used as a substrate and 9α-
OH-PCM can be manufactured. As such microorganisms capable of introducing a hydroxyl group into the 9α position, those belonging to the genus Rhodocotcus (hereinafter abbreviated as "R") are suitable. More specifically, microorganisms belonging to R. equi are used. As a bacterium belonging to R. equi
ATCC6939, 7698, 7699, 10146, 21107,
21280, 21329, 21521 and 21690 bacteria and
Bacterium IAM1038 is known. Among them, ATCC21329 bacteria and
ATCC21521 bacteria is particularly good. Here, these R. equi species have been conventionally referred to as Corynebacterium equi (hereinafter abbreviated as "C. equi"). The reason why C. equi was changed to R. equi is as follows. First, M.Tsukamura (J.Gen.Microbiol.) Vol. 68, pp. 15-26 (1971) found that arylsulfatase ( Mycobacterium (hereinafter referred to as "M."
The genus M. and the genus Nocardia (hereinafter abbreviated as "N.") can be clearly distinguished, and the genus M. and N.
They decided that it would be appropriate to create a new genus from genus N in the middle of the genus and include it within that genus. He proposed that this group of microorganisms be called the genus Gordna (hereinafter abbreviated as "G."). At this time, Tsukamura #3410 (=ATCC, 25592, NCTC
G. bronchialis with type strain 10667), Tsukamura #3605 (=
ATCC 25593, NCTC 10668) as the reference strain
G. rubra, Tsukamura #3612 (=ATCC
25594, NCTC 10669) as the reference strain, and three types of G. terrae were established.
species) was designated as G. bronchialis. Later G.
Lubra is a member of the Japanese Journal of Microbiology (Japan.J.Microbiol.) 17
Volume, No. 3, pp. 189-197 (1973), it was renamed G. rubropertincta by Michio Tsukamura. The following year, Michio Tsukamura published the same magazine, Volume 18, No. 1, pp. 37-44 (1974), explaining the taxonomic position of the "Rhodochrous" group, which was previously named as M. rhodochrous, etc. He conducted a review and found that many of them should belong to the genus G. And the 3 mentioned above
Species that do not belong to the genus G. were divided into new groups, and based on these, three species were added: G. aurantiaca, G. rhodochroa, and G. rosea. However, in this case, M. rhodochrous ATCC No. 13808, which should belong to the genus G., was already old and was reported by Zopf in Ber.Dtsch.Botan.Gas.9, 22-28.
(1891), it was found that it was called Rhodococcus rhodochrous, and in accordance with the nomenclature convention that gives priority to the legal and oldest genus name, he named the genus G. They argued that the name should be changed to Genus R. On the other hand, in Journal of General Microbiology, Vol. 100, pp. 99-122 (1977), Goodfellow et al.
We reorganized the classification of the so-called "rhodochrous" complex and its surrounding bacteria, including the genus M.
We recognized the existence of a new genus that is clearly different from the genus N. and confirmed that it will be called the genus R, just like Tsukamura. We also reconsidered the conventional M. genus bacteria and N. genus bacteria, and found that there are quite a number of bacteria that were previously classified as M. genus or N. genus bacteria that should be added to the R. genus. Based on this, the genus R was further revised and divided into nine species. They are R. rhodochrous, R. bronchialis, R. corallinus, R.
erythropolis R. equi, R. rhodnii, R. rubrus, R. rubropertinctus and R. terrae. When we established R. equi, we used a group of microorganisms that had traditionally been called C. equi as the reference strain.
We designated ATCC bacterium 25729 and gave its full name as R. equi [Magnusson] Goodfellow et anderson.
Anderson) was adopted. ATCC No. 25729 is derived from NCTC No. 1621, and is listed as a reference strain in the description of C. etai in Virgie's Manual of Determinative Bacteriology, 8th edition (no reference strain is specified). (not listed). On the other hand, the need to create a new genus (R. It recognizes not only Gutdfellow and Tsukamura but also the three most authoritative taxonomic research groups in this direction: Lind, Mordarska and Pattyn. Furthermore, the most reliable paper at present is that of Gutsudferou et al. (1977, supra), which describes detailed mycological properties, so C. equi is considered to be R. equi, according to the classification of Gutudferau et al. is currently the most appropriate. These bacteriological properties have been described by Tsukamura (supra, 1971), Tsukamura (Journal of Systematic Bacteriology, Vol. 25, pp. 377-382 (1975)), and Gutsudfero et al. (supra, 1977). (2013). The 9α-position hydroxylation reaction by these genus R may be carried out either in the state of growing cells or in the state of resting cells. In the case of resting bacterial cells, they are cultured in a medium containing no insoluble matter, collected by centrifugation, etc., and resuspended in a buffer containing a substrate, physiological saline, water, etc. to perform a conversion reaction. Aeration and stirring are required during the reaction. Next, to explain in detail the case of using propagated bacterial cells, a medium containing a carbon source, a nitrogen source, inorganic salts, and nutrients such as vitamins if necessary is sterilized, R bacteria are inoculated into the medium, and cultured with shaking or aeration. Perform agitation culture. The medium used is as follows. Examples of carbon sources include n-paraffin,
Hydrocarbons such as α-olefin and xylene; Alcohols such as methanol, ethanol, glycerin, and higher alcohols; Organic acids and their salts such as succinic acid, acetic acid, and higher fatty acids; Starch, maltose, sucrose, glucose, and rhamnose, etc. Sugar; linseed oil,
Fats and oils such as soybean oil, sesame oil, corn oil, rapeseed oil, palm oil, fish oil, beef tallow, and tallow oil are listed. Natural nutritional sources including carbon sources, nitrogen sources and other nutritional substances include, for example, vegetable oil meal such as linseed oil meal, defatted soybean meal, cottonseed oil meal, rapeseed oil meal; high test molasses, refined molasses and xylose molasses. Molasses: Bacchus, corn cob, alpha alpha, corn staple brewer, daytailer's soluble, flavoring liquid, fishmeal, bran, meat extract, yeast, yeast extract, potato extract, malt extract, gluten, peptone, glutamate, asparagine, Examples include glycine, casein, casein decomposition products, and skim milk. Examples of inorganic substances added to the culture medium include nitrogen sources such as ammonium sulfate and ammonium chloride; potassium and phosphorus sources such as dipotassium hydrogen phosphate; salts such as iron, copper, magnesium, manganese, cobalt, zinc, and calcium; and molasses. Examples include ashes of natural products. Other vitamins can also be added if necessary. The composition of the medium is selected depending on the type of fungal sugar used, but carbon sources, nitrogen sources, potassium, phosphorus and magnesium are indispensable as medium components. If an antifoaming agent is required, a known antifoaming agent may be added. Specific examples include polyoxyalkylene glycol, but it is not always necessary to add an antifoaming agent. Surfactants are often effective as emulsifiers. As the surfactant, nonionic and anionic surfactants are preferred. Specifically, for example, polyoxyethylene sorbitan monostearate,
Examples include sorbitan monopalmitate and polyethylene glycol monostearate. The reaction temperature is usually 20°C for both growing and dormant bacteria.
~40°C, but around 28-37°C is optimal. The pH of the reaction solution (buffer, culture medium, etc.) is usually 5 to 10.
It is preferably adjusted to 6 to 9. If the bacterial concentration is low, this conversion reaction will be delayed.
It is desirable to adjust or culture the R. genus bacteria to a concentration of 1 x 10 9 /ml or more, preferably 1 x 10 10 /ml or more. The raw material PCM may be sterilized together with the medium, or may be added to the medium after the start of culture. It is also possible to add in portions. In this case, it is added as it is after dry sterilization or moist heat sterilization, or it is added as a solution after being dissolved in a solvent such as dimethylformamide or methanol, or it is added as a finely dispersed suspension by ultrasonication. At that time, dispersion of PCM is often further promoted if a surfactant is added at the same time. The time required for conversion cannot be determined uniformly depending on the bacterial concentration, temperature, pH, etc., but it is usually better to stop the reaction within 7 days, and in many cases it is better to stop the reaction within 1 to 2 days. Normally, the generated 9α-OH-PCM undergoes further decomposition and decreases as time passes, so quantify the amount generated over time, and if it starts to decrease, heat sterilization, acid/alkali addition, organic solvent addition, etc. Need to stop. Since 9α-hydroxylase is generally considered to be an inducible enzyme, a small amount of PCM is added during the seed culture stage of R bacteria.
It may be desirable to induce the enzyme by adding After the conversion reaction, 9α- produced in the culture solution etc.
OH-PCM can be collected, separated and purified by known methods. For example, 9α-OH-PCM is extracted from a culture solution with an equal or several times the amount of an organic solvent that is difficult to miscible with water, such as chloroform or ethyl acetate, and the solvent is distilled off from the extract. 9α-OH
- PCM is extracted by column chromatography using porous resin, silica gel, alumina, etc. as an adsorbent and petroleum ether, benzene, chloroform, ether, acetone, ethanol, methanol, ethyl acetate, etc. as an eluent. etc. can be separated from However, if 9α-OH-PCM is the main component, pure crystals of 9α-OH-PCM can be obtained by dissolving it in methanol, ethyl acetate, acetone, etc. and repeating recrystallization without using chromatography. . When producing PCM used as a substrate by converting it from another raw material in a microbial reaction, by inoculating the fermentation solution with R. spp. bacteria, so-called two-stage fermentation or mixing can be performed without isolating the PCM from the culture solution. It is possible to produce the desired 9α-OH-PCM by culturing. An example of this is the production of 9α-OH-PCM by two-stage culture of M species NRRL B-8054 bacteria and R genus bacteria from sterols. This NRRL B-8054 bacterium produces not only PCM but also 3-oxopregna-4,17(20) diene-20-carboxylic acid, which is a free carboxylic acid that is not a methyl ester, but it is usually far more likely to produce PCM. produce a lot of. Therefore, in two-stage culture with R. equi, 9α-OH-PCM is more 9α-hydroxy-3-oxopregna-4,17(20)-
It is produced in much larger quantities in the culture solution than diene-20-carboxylic acid. Here, sterols refer to various sterols or their oxidized intermediates collectively. Various sterols have a hydroxyl group at the C-3 position of the perhydrocyclopentanophenanthrene nucleus, a double bond at the C-5 position, and a side chain with 8 to 10 carbon atoms at the C-17 position. and may have a double bond at C-7, C-8, C-9 (11), etc. in some cases. Examples of such various sterols include cholesterol, stigmasterol, campesterol, β-sitosterol, ergosterol, brassicasterol, fucosterol, lanosterol, agnosterol, dihydrolanosterol, dihydroagnosterol, α-sitosterol, and the like. It will be done. Preferred sterols are cholesterol, campesterol, stigmasterol and β-sitosterol. Sterol-containing natural and processed products, such as alkaline-washed dark oils from fish and squid oils, as well as deodorized scums of vegetable oils, deodorized sludge, and tall oil, are likewise used as raw materials. Furthermore, oxidized intermediates of various sterols are also used as substrates. Such oxidation intermediates include 4-en-3-one derivatives of various sterols, and specifically, for example, cholest-3-one derivatives, etc.
4-en-3-one, stigma master. 4,22−
diene-3-one, cholesta-4,22-diene-
3-on etc. In this two-stage fermentation culture method, it is preferable to culture under the optimum conditions while the first stage fermentation is in progress, and after inoculating the R. genus bacteria, to culture under the optimum conditions for the R. genus bacteria. Therefore, if the pH becomes extremely unstable during PCM fermentation, it is possible to readjust the pH to around 7 by adding acid or alkali when inoculating R. spp., and it is better to do so. There are many cases. In the end, it is better to inoculate R. spp. near the end of the first stage fermentation than when it has just begun.
Production volume is often high. When inoculating R. genus bacteria, it is not necessarily necessary to stop the fermentation in the first stage by heat treatment or the like. 9α-
OH-PCM is produced in large quantities. In this way, two-stage culture or mixed culture is possible, but PCM production fermentation is carried out using the optimal medium for the first stage fermentation, and normally R. spp. After vaccination9
There is nothing wrong with generating α-OH-PCM. When it seems that nutrients are insufficient, new ingredients such as sterilized meat extract, defatted soybeans, ammonium nitrate, etc. may be added to the culture solution before or after inoculating R. spp. The amount of inoculation of the culture solution of R. genus bacteria is usually about 0.1 to 30%, preferably 1 to 15%, per the first stage culture solution. According to the present invention, 9α-OH-PCM can be produced in a medium at a high concentration. In addition, by advantageously carrying out the two-stage reaction of PCM from sterol and 9α-OH-PCM from PCM using a fermentation method, it has become possible to produce 9α-OH-PCM at a low cost from inexpensive sterols. The present invention will be explained in more detail in the following examples, but the present invention is not limited to the following examples unless it exceeds the gist thereof. In the following Examples, the steroid was quantified by gas chromatography and liquid chromatography after silylation, if necessary. Also, in the examples below, percentages are by weight. Example 1 Glucose 1.0%, meat extract 0.3%, peptone 1.0
%, salt 0.5% and water (PH7.0)
Dispense 100ml of into a 500ml kolben with a shoulder, and heat at 120℃.
Steam sterilize for 20 minutes. In this R. equi (equi)
Inoculate one loopful of ATCC No. 21329 and incubate at 30℃ for 120 minutes.
Seed culture is carried out for 52 hours using a reciprocating shaker with a reciprocating motion per minute and an amplitude of 7 cm. Add 4 ml of this seed culture solution, 4.0% cottonseed meal, and yeast.
1.5%, soybean oil 1.5%, NaNO3 0.2%, K2HPO4 0.1
%, MgSO 4 .7H 2 O, and 50 ml of main culture medium (PH 7.0, steam sterilized at 120° C. for 20 minutes). The main culture is performed at 30°C under reciprocating shaking conditions of 120 cycles/min with an amplitude of 7 cm, and 1.0 g of sterilized PCM (powder) is added aseptically 30 hours after the start of culture. After that, the culture was continued, and the culture was stopped 48 hours after adding PCM.
Extract the culture with 150 ml of ethyl acetate. As a result of analyzing this extract by gas chromatography,
The presence of 0.50 g of 9α-OH-PCM was confirmed.
In order to identify this substance, the extract was concentrated, developed using silica gel thin layer chromatography, the relevant portion was scraped off and eluted with a solvent (ethyl acetate), and recrystallization was repeated from ethyl acetate and ethyl ether. As a result, we were able to obtain approximately 300 mg of pure crystals. This material was colorless columnar crystals (ethyl ether) with a melting point of 202-204°C. Its infrared absorption spectrum (KBr Disc) had maximum absorption at 3520 cm -1 (derived from OH), 1690 cm -1 and 1660 cm -1 . As a result of mass spectrometry, there is an M + molecular ion peak at M/e = 372, and a peak at 340 that seems to originate from M-CH 3 OH.
It had a base peak. The results of the NMR analysis are as follows. NMR (in CDCl 3 ) 0.97 (3H, s, 18-CH 3 ) 1.33 (3H, s, 19-CH 3 ) 1.95 (3H, t, J=~2Hz, 21-CH 3 ) 3.68 (3H, s, COOCH 3 ) 5.86 (1H, br-s, 4-H) (in C 5 D 5 N) 0.93 (3H, s, 18-CH 3 ) 1.26 (3H, s, 19-CH 3 ) 2.02 (3H, t , J = ~2Hz, 21-CH 3 ) 3.67 (3H, s, COOCH 3 ) 6.02 (1H, br-s, 4-H) This substance is 9α-OH-PCM with the following structure.
it is conceivable that. On the other hand, with the same composition as above, only 1.0g from the beginning.
Prepare 50 ml of main culture medium containing PCM in a 500 ml shoulder flask. After steam sterilizing this, the same amount of the aforementioned seed culture is simultaneously inoculated. PCM this on the way
After culturing under the same conditions without the addition of 48
Stop the culture at an hour. This culture solution was extracted with 150 ml of ethyl acetate, and the 9α-OH-PCM content therein was measured. As a result, it was confirmed that 0.47 g of 9α-OH-PCM was present. Example 2 Glucose 1.0%, meat extract 0.3%, peptone 1.0
%, yeast extract 0.5%, PCM 0.02%, and water (PH 7.0) in a 500 ml shoulder cup.
Dispense in ml and steam sterilize at 120℃ for 20 minutes. to this
One platinum loop of R. equi ATCC No. 21329 was inoculated, and 30
Incubate for 48 hours at 120 °C on a reciprocating shaker with an amplitude of 7 cm and 120 reciprocations/min. Combine all of these seed cultures and collect the bacteria by sedimenting them using refrigerated centrifugation. After washing twice with physiological saline, the cells are suspended in 25 ml of phosphate buffer (PH7.5, 1/20M) containing 1.0% PCM.
Pour 30 ml of this suspension into a 500 ml shoulder flask and shake under the same conditions as for seed culture. After shaking the reaction solution for 12 hours, it was extracted with 150 ml of ethyl acetate, and the content of 9α-OH-PCM in the extract was measured. As a result, the presence of about 50 mg of 9α-OH-PCM was confirmed after 12 hours. Example 3 In the same manner as in Example 1, R. equi ATCC No. 21521 was seed cultured. 2 ml of this seed culture was mixed with 4.0% defatted soybean flour, 2.0% yeast, 0.25 % K2HPO4 , MgSO4 .
7H 2 O 0.1%, NH 4 NO 5 0.2%, soybean oil 1.0%,
Inoculate one 500 ml shoulder flask (PH 7.0, 120°C, steam sterilized for 20 minutes) containing 50 ml of main culture medium consisting of 1.5% PCM and water. 30℃, 120 round trips/min,
Culture is performed under conditions of 7 cm amplitude, and culture is stopped after 59 hours. After that, when the culture solution was extracted using 150 ml of ethyl acetate, 0.35 g of 9α-OH-
The existence of PCM was confirmed. Example 4 Glucose 1.0%, meat extract 1.0%, peptone 1.0
% and 500 ml of seed medium (PH7.2) consisting of water
Dispense into ml shoulder flasks, steam sterilize at 120℃ for 15 minutes, and remove Mycobacterium sp.
One platinum loop of NRRL B-8054 was inoculated, and the temperature was kept at 30℃.
Seed culture is carried out for 72 hours under conditions of reciprocating shaking at 120 reciprocations/min and an amplitude of 7 cm. Add 2 ml of this seed culture solution to crushed whole soybeans.
4.0%, yeast 1.0%, NaNO3 0.2%, K2HPO4 0.2
%, MgSO 4 7H 2 O 0.1%, cholesterol 1.5%
500ml shoulder flask containing 100ml of main culture medium consisting of water and water (PH7.0, steam sterilized at 120°C for 20 minutes)
Inoculate 5 plants. Main culture was performed at 30℃, 120 cycles/
The test was performed under conditions of reciprocating shaking with an amplitude of 7 cm for 30 minutes. After starting culture
At 220 hours, the pH was aseptically adjusted to around 7, and R. equi was seeded and cultured in the same manner as in Example 1.
Inoculate each flask with 8 ml of ATCC No. 21329 bacteria. After inoculation, continue culturing at 30°C for 48 hours under the same shaking conditions. After stopping the culture, combine all the culture solutions and add at once.
Extracted twice with 1.5% ethyl acetate and measured the steroid content in the combined extracts.9α-OH-
The presence of 0.96g of PCM was confirmed. Example 5 Glucose 1.0%, meat extract 1.0%, peptone 1.0
% and 500 ml of seed medium (PH7.2) consisting of water
Dispense into ml shoulder flasks, steam sterilize at 120℃ for 15 minutes, and remove Mycobacterium sp.
One platinum loop of NRRL B-8054 was inoculated and the temperature was 120°C at 30°C.
Seed culture is carried out for 56 hours under reciprocating shaking conditions of reciprocating motion/min and amplitude of 7 cm. Add 20ml of this seed culture solution to 4.0% cottonseed meal and yeast.
1.5%, soybean oil 1.0%, NaNO3 0.2%, K2HPO4 0.1
%, MgSO 4 7H 2 O 0.01%, cholesterol 2.0%
800 ml of main culture medium (PH7.0, 120
Inoculate two 6-volume shoulder flasks containing sterilized by steam for 20 minutes at The main culture was performed at 30℃ for 100 cycles/
After the start of culture,
At 240 hours, the pH of one tube was adjusted to around 7 without heat sterilization, and at the same time, 50 ml of R. equi ATCC No. 21521, which had been seed cultured in the same manner as in Example 3, was inoculated. The other one was steam sterilized at 120℃ for 30 minutes.
After cooling, immediately adjust the pH to around 7, and then inoculate 50 ml of the same seed culture of R. equi ATCC No. 21521.
After inoculation, the cultivation of the two flasks is resumed at the same time.
Culture was stopped 48 hours after restarting, and the culture solution in each flask was extracted with 1.6 ml of ethyl acetate. As a result, R.
1.67 g of 9α-OH-PCM was produced in the case of heat sterilization before inoculation with Equi, and 1.60 g of 9α-OH-PCM in the case of non-heat sterilization. Example 6 Contains 100 ml of seed medium (adjusted to pH 7.2) consisting of 2.0% glycerol, 2.0% crushed whole soybeans, 1.0% yeast extract, 0.2% NaNO 3 , 0.1% K 2 HPO 4 and water.
Steam sterilize a 500ml shoulder bag at 120℃ for 20 minutes. This includes Mycobacterium sp.
Inoculate one platinum loop of NRRL B-8054. After inoculation, the seeds are cultured for 68 hours at 30°C under reciprocating shaking conditions of 120 reciprocations/min and an amplitude of 7 cm. Add 20ml of this seed culture to 4.0% defatted soybean malt, 1.5% yeast, 1.0% cottonseed oil cake,
NH 4 NO 3 0.1%, MgSO 4・7H 2 O 0.1%, K 2 HPO 4 0.1
%, nonionic surfactant trademark "Tween-60" manufactured by Kao Atlas Co., Ltd. 0.05%, 2.0% of various sterols listed in Table 2, and 50 ml of main culture medium consisting of water.
Inoculate 500ml shoulder flasks (total of 5 flasks). After inoculation, culture at 30°C at 120 cycles/min and 7cm amplitude. After culturing for 192 hours, 4 ml of a seed culture of R. equi ATCC No. 21329 cultured in the same manner as in Example 2 was inoculated. At the same time, 5 ml of sterilized water containing 50 mg of NH 4 NO 3 and 200 mg of yeast extract is added. Then adjust the pH to around 7. After this, the culture was continued for another 48 hours, and the culture was stopped at the 48th hour, and steroids were extracted from the culture solution using 150 ml of ethyl acetate in each flask. 9α- in this extract
The amount of OH-PCM is listed in Table 1. 【table】