【発明の詳細な説明】
本発明は一般式
（式中Ｒは免疫原性担体物質残基を、ｎは１〜
30整数を意味する。）
で表わされる新規オキソバルビツール酸誘導体抗
原及びその製造法に関する。
バルビツール酸系薬物は催眠薬として不眠症患
者に投与する他、鎮静薬及び抗けいれん薬とし
て、てんかんの治療に用いられる繁用薬剤である
が、その薬理効果の発現する量と、中毒症状の如
き副作用の発現する量の範囲が個体によつて大き
く差があるため、薬剤投与に際し患者の体液中
（例えば血液、唾液など）の薬剤濃度を知ること
が治療上極めて重要なことである。
オキソバルビツール酸誘導体の体液中の濃度を
知る方法としては、従来、薄層クロマトグラフイ
ー、ガスクロマトグラフイーなどによる方法が行
なわれているが、操作が繁雑なため、近年試料か
ら直接測定できるラジオ・イムノ・アツセイ法
（以下RIA法と略す）やエンザイム・イムノ・ア
ツセイ法（以下EIA法と略す）の如き免疫化学的
反応を応用した方法が実施されるようになつてき
た。
しかしながら、これら免疫化学的測定に用いる
特異抗体として、充分なものを安定的に得ること
は因難であつた。
本発明者らは鋭意検討を重ねた結果、免疫原性
担体物質と一般式
で表わされるアミノフエノバルビタールとをグル
タールアルデヒドとともに反応させ、次いで反応
生成物を還元して得た化合物が抗原性が高く、か
つオキソバルビツール酸誘導体に特異的な抗体を
安定的に産生するという知見を得、本発明を完成
した。
本発明の新規オキソバルビツール酸誘導体抗原
は、一般式
（式中Ｒ及びｎは前記に同じ）
で表わされ、このものは免疫原性担体物質と一般
式
で表わされるアミノフエノバルビタールとを、グ
ルタールアルデヒドとともに反応させ、次いで反
応生成物を還元することにより製せられる。
本発明による免疫原性担体物質、アミノフエノ
バルビタールおよびグルタールアルデヒドの反応
は緩衝液例えばリン酸緩衝液中で行なわれ、その
際のPHは５〜８が好ましい。反応温度は４℃〜30
℃の範囲内であればよい。アミノフエノバルビタ
ールの量は免疫原性担体物質１モルにつき50乃至
200モル程度、グルタールアルデヒドは免疫原性
担体物質１モルに対し７〜50モル使用するのが好
ましい。アミノフエノバルビタールはジメチルホ
ルムアミド、ジメチルスルホキサイド、アルコー
ル等の有機溶媒に溶解した状態で用いる。
ここで生成する反応生成物は常法により、例え
ばPHを中性にした生理食塩水を用いて透析後、ク
ロマトグラフイー等の手段に付すことにより行な
うこともできるが、特に単離することなく、次の
還元反応に付してもよい。
還元は常法により例えば水素化金属類を用いて
行なわれる。好ましい還元剤は水素化硼素ナトリ
ウム（NaBH4）である。
反応溶液中から本発明の化合物の単離は常法に
より行われる。例えばPHを中性にした生理食塩水
を用いて透析し、次いでクロマトグラフイー、特
に好ましくはセフアデツクス（フアルマシア社
製）を用いたクロマトグラフイーによつて行なう
ことができる。
本発明における免疫原性担体物質としては、牛
血清アルブミン（以下BSAと略す）、牛ガンマグ
ロブリン、ポリリジン、ヘモシアニンなどの異種
蛋白が良好な結果を得る。また、アミノフエノバ
ルビタールとしては０―アミノフエノバルビター
ル、ｍ―アミノフエノバルビタール及びｐ―アミ
ノフエノバルビタールである。
このようにして得られた本発明のオキソバルビ
ツール酸誘導体抗原はRIA法によつて測定するこ
とにより免疫原性担体物質１モルに対し１〜30モ
ルのフエノバルビタールの結合が確認された。
本発明の抗原はEIA法やRIA法などの免疫化学
的反応を応用した方法によつてオキソバルビツー
ル酸誘導体を定量する際に用いる抗体の産生に好
適かつ有用なものである。このことは該抗原がオ
キソバルビツール酸誘導体に特異的かつ抗体価の
高い抗体を産生することにより特徴づけられる。
例えば本発明のオキソバルビツール酸誘導体抗
原のうち、免疫原性担体物質が牛血清アルブミン
（BSA）であり、アミノフエノバルビタールがｐ
―アミノフエノバルビタールである場合の抗原を
用いて常法により得た抗体と、公知の方法、例え
ばBSAとｐ―アミノフエノバルビタールとをジ
アゾカツプリング法によりBSA―Ｎ＝Ｎ―フエ
ノバルビタールとし、これを抗原として常法によ
り得た抗体の抗体価を比較した結果、本発明の抗
原を用いて得た抗体が公知のそれに比べて100倍
以上の値を示す。
尚、抗体価の測定は以下の参考例に示す。
〔参考例〕
抗体の産生
本発明の抗原を含む溶液（BSA1モルに対
し、フエノバルビタール21モルが結合）を蛋白
濃度として２mg／mlになるように生理食塩水で
希釈する。これを３倍量の完全フロインド補助
液（Freund′s Complete Adjuvant）に乳化さ
せて抗原溶液を作り、これをウサギ１羽当りに
蛋白量として0.5mgを、そのフツト・パツズ
（Foot pads）と背の皮肉及び足筋肉に免疫
し、６週間後より２週間毎に該抗原を蛋白量と
して0.25mg追加免疫し、最終免疫後13日目に採
血、常法により抗体を得た。
一方、公知のBSA―Ｎ＝Ｎ―フエノバルビ
タールを抗原としたもの（BSA1モルに対し、
フエノバルビタール20モルが結合）についても
上述と全く同じ方法によつて抗体を得た。
抗体価の測定
抗体価の測定はRIA法により14C―フエノバル
ビタール（2000cpm／350pmol／0.1ml）の33％
と結合する抗体の希釈倍数よりABC―33
（Antigen Binding Capacity―33％）値を計算し
た。
計算式は以下の如くである。
ABC―33
＝（33％結合する希釈倍数）×10×0.33
×350(注)×１／蛋白量（mg）
＝（pmol／mg−蛋白）
(注) 14C―フエノバルビタールの放射能より100
％結合したときのフエノバルビタールの
pmol数。
計算の結果、BSA―Ｎ＝Ｎ―フエノバルビタ
ールを抗原として得た抗体のABC―33値は
20pmol／mg―蛋白であつたが、本発明の抗原よ
り得た抗体のABC―33値は2000〜4000pmol／mg
―蛋白であつた。
以下実施例を示し、本発明を詳細に説明する。
実施例 １
オキソバルビツール酸誘導体抗原の製造
ジメチルホルムアミド0.2mlに15mgのｐ―アミ
ノフエノバルビタールを溶解、次いで0.1モルリ
ン酸緩衝液（PH7.0）６mlを加え牛血清アルブミ
ン（平均分子量69000）45mgを溶解する。ゆるや
かに撹拌しつつ、１％グルタールアルデヒド溶液
0.5mlを加え、室温で２時間放置した後、0.1モル
リン酸緩衝液（PH8.0）中で８時間、４℃で透析
した。
反応溶液のPHが8.0であるのを確めてから水素
化硼素ナトリウム２mgを加え、４℃で一夜撹拌し
た。炭酸水素ナトリウムでPH7.0にした生理食塩
水溶液中で透析し、セフアデツクスＧ―25カラム
（2.5×4.5cm）（フアルマシア社製）にかけ、同じ
生理食塩水で溶出、牛血清アルブミン―フエノバ
ルビタール抱合体を得た。結合の度合をRIA法に
より測定した結果、牛血清アルブミン１モルに対
し、21モルのフエノバルビタールが結合している
と推定された。
実施例 ２
(A) 抗体の産生
実施例１の如くして得たオキソバルビツール
酸誘導体抗原溶液を、蛋白濃度が２mg／mlにな
るように生理食塩水で希釈し、次いで３倍量の
完全フロインド補助液（Freund′s Complete
Adjuvant）と乳化させ、これをウサギ１羽当
りに１ml（蛋白量として0.5mg）を、そのフツ
ト―パツズ（Foot pads）、背の皮肉及び足筋
肉に免疫した。更に６週間後より２週間毎に、
蛋白量として0.25mgの同抗原を、同様にして追
加免疫し、最終免疫後13日目に採血、常法によ
り抗血清を得た。
尚、用いた抗原は、牛血清アルブミン１モル
当り21モルのフエノバルビタールが結合したも
のである。
(B) 不溶性抗体の製造
上記(A)の如くして得た抗血清を、蛋白当りの
抗体価を上げる為、塩析とDEAE―セルロース
で精製してIgG画分を得、これをCNBr―セフ
アロース4B（フアルマシア社製）と常法によ
り結合させた。
(C) 血清中のフエノバルビタールの定量
実施例２―(B)の如くして得た不溶性抗体を用
いEIA法によつてフエノバルビタールを定量し
た。
(i) 酵素標識フエノバルビタールの製造
アルカリホスフアターゼ（仔牛腸
GradeI、ベーリンガーマンハイム社製、
400U／mg―蛋白）を標識酵素とし、これと
ｐ―アミノフエノバルビタールとをカルボジ
イミド法で結合させ、セフアデツクスＧ―
200で精製し酵素活性のピーク部を集め全量
を10mlとし、４℃で保存した。（保存液の酵
素活性：234.2U／mg―蛋白、蛋白量：76μ
ｇ／ml、フエノバルビタール量：4.3mol／
molアルカリホスフアターゼ）
(ii) 血清中のフエノバルビタールの定量
上記(i)の如くして得たアルカリホスフアタ
ーゼ標識フエノバルビタール0.1ml（200倍希
釈）と実施例２―(B)の如くして製造したセフ
アロース―IgG（上記アルカリホスフアター
ゼ標識フエノバルビタールが50％結合する希
釈率）0.5ml及び希釈血清0.1mlを室温で１時
間反応させた。次いで３mlの0.1Mグリシン
緩衝液PH10.5（1mM MgCl2，0.1mMZnCl2）
を加え3000r.p.m.で３分間遠心し、上清を除
き、洗浄操作をくり返した後、同緩衝液2.7
ml，0.6Mパラニトロフエニルホスフエート
30μを加え、室温で30分間反応させ、その後
0.5mlのINNaOH溶液を加えて反応を止め、
遠心後405nmの吸光度を測定する。標準検量
線を基に検体中のフエノバルビタール量を求
めた。
実施例 ３
各種薬剤に対する相対親和性
実施例２―(B)の不溶性抗体を用い、実施例３と
同様の方法で各種薬剤に対する相対親和性を検討
し、次表の如き結果を得た。尚、相対親和性の値
は各阻害曲線（検量線）から薬剤の抗体への結合
を50％阻害する濃度（モル数）を求め、その逆数
をフエノバルビタールを100とした相対値で示し
た。
【表】[Detailed Description of the Invention] The present invention relates to the general formula (In the formula, R is an immunogenic carrier substance residue, and n is 1 to
means 30 integers. ) and a method for producing the same. Barbiturates are commonly used as hypnotics to patients with insomnia, as well as sedatives and anticonvulsants to treat epilepsy. Since the range of the amount at which such side effects occur varies greatly depending on the individual, it is extremely important for treatment to know the concentration of the drug in the patient's body fluids (eg, blood, saliva, etc.) when administering the drug. Conventionally, methods such as thin layer chromatography and gas chromatography have been used to determine the concentration of oxobarbituric acid derivatives in body fluids.・Methods that apply immunochemical reactions, such as the immunoassay method (hereinafter abbreviated as RIA method) and the enzyme immunoassay method (hereinafter abbreviated as EIA method), have come to be implemented. However, it has been difficult to stably obtain sufficient specific antibodies for use in these immunochemical measurements. As a result of extensive studies, the present inventors found that immunogenic carrier substances and general formula A compound obtained by reacting aminophenobarbital represented by with glutaraldehyde and then reducing the reaction product has high antigenicity and stably produces antibodies specific to oxobarbituric acid derivatives. Based on this knowledge, the present invention was completed. The novel oxobarbituric acid derivative antigen of the present invention has the general formula (wherein R and n are the same as above), and this substance is combined with an immunogenic carrier substance of the general formula It is produced by reacting aminophenobarbital represented by the formula with glutaraldehyde and then reducing the reaction product. The reaction of the immunogenic carrier substance according to the invention, aminophenobarbital and glutaraldehyde is carried out in a buffer, for example a phosphate buffer, preferably at a pH of 5 to 8. Reaction temperature is 4℃~30℃
It may be within the range of °C. The amount of aminophenobarbital is between 50 and 50 per mole of immunogenic carrier material.
It is preferable to use about 200 moles of glutaraldehyde, and 7 to 50 moles of glutaraldehyde per mole of the immunogenic carrier substance. Aminophenobarbital is used in a state dissolved in an organic solvent such as dimethylformamide, dimethyl sulfoxide, or alcohol. The reaction product produced here can be analyzed by a conventional method, for example, by dialysis using physiological saline with a neutral pH, and then subjecting it to a means such as chromatography, but it is not necessary to isolate it. , may be subjected to the following reduction reaction. The reduction is carried out in a conventional manner using, for example, metal hydrides. A preferred reducing agent is sodium borohydride (NaBH 4 ). The compound of the present invention is isolated from the reaction solution by a conventional method. For example, it can be carried out by dialysis using physiological saline with neutral pH, followed by chromatography, particularly preferably chromatography using Sephadex (manufactured by Pharmacia). As the immunogenic carrier material in the present invention, good results have been obtained using heterologous proteins such as bovine serum albumin (hereinafter abbreviated as BSA), bovine gamma globulin, polylysine, and hemocyanin. Furthermore, examples of aminophenobarbital include 0-aminophenobarbital, m-aminophenobarbital, and p-aminophenobarbital. The thus obtained oxobarbituric acid derivative antigen of the present invention was measured by the RIA method, and it was confirmed that 1 to 30 moles of phenobarbital bound to 1 mole of the immunogenic carrier substance. The antigen of the present invention is suitable and useful for producing antibodies used in quantifying oxobarbituric acid derivatives by methods applying immunochemical reactions such as EIA and RIA. This is characterized by the fact that the antigen produces antibodies that are specific to the oxobarbituric acid derivative and have a high antibody titer. For example, among the oxobarbituric acid derivative antigens of the present invention, the immunogenic carrier substance is bovine serum albumin (BSA), and aminophenobarbital is
- An antibody obtained by a conventional method using an antigen in the case of aminophenobarbital, and a known method such as BSA-N=N-phenobarbital by a diazo coupling method of BSA and p-aminophenobarbital. As a result of comparing the antibody titers of antibodies obtained by conventional methods using this as an antigen, the antibody obtained using the antigen of the present invention shows a value 100 times higher than that of known antibodies. In addition, the measurement of antibody titer is shown in the following reference example. [Reference Example] Production of Antibody A solution containing the antigen of the present invention (21 moles of phenobarbital bound to 1 mole of BSA) is diluted with physiological saline to a protein concentration of 2 mg/ml. This was emulsified in 3 times the amount of Freund's Complete Adjuvant to make an antigen solution, and 0.5 mg of protein was added to each rabbit in its foot pads and back. After 6 weeks, additional immunizations of 0.25 mg of the antigen as a protein amount were given every two weeks, and on the 13th day after the final immunization, blood was collected and antibodies were obtained by a conventional method. On the other hand, one using the known BSA-N=N-phenobarbital as an antigen (for 1 mole of BSA,
An antibody was also obtained for (20 moles of phenobarbital bound) in exactly the same manner as described above. Measurement of antibody titer The antibody titer was measured using the RIA method at 33% of 14 C-phenobarbital (2000cpm/350pmol/0.1ml).
ABC-33 from the dilution factor of the antibody that binds to
(Antigen Binding Capacity - 33%) value was calculated. The calculation formula is as follows. ABC-33 = (33% binding dilution factor) x 10 x 0.33 x 350 (Note) x 1/Protein amount (mg) = (pmol/mg - protein) (Note) 14 C - From the radioactivity of phenobarbital 100
% of phenobarbital when combined
pmol number. As a result of calculation, the ABC-33 value of the antibody obtained using BSA-N=N-phenobarbital as an antigen is
The ABC-33 value of the antibody obtained from the antigen of the present invention was 2000 to 4000 pmol/mg.
-It was protein. EXAMPLES The present invention will be explained in detail below with reference to Examples. Example 1 Production of oxobarbituric acid derivative antigen Dissolve 15 mg of p-aminophenobarbital in 0.2 ml of dimethylformamide, then add 6 ml of 0.1 molar phosphate buffer (PH7.0) and add 45 mg of bovine serum albumin (average molecular weight 69000). dissolve. While stirring gently, add 1% glutaraldehyde solution.
After adding 0.5 ml and leaving it at room temperature for 2 hours, it was dialyzed in 0.1 molar phosphate buffer (PH8.0) for 8 hours at 4°C. After confirming that the pH of the reaction solution was 8.0, 2 mg of sodium borohydride was added, and the mixture was stirred at 4°C overnight. Dialyzed in a physiological saline solution adjusted to pH 7.0 with sodium bicarbonate, applied to a Cephadex G-25 column (2.5 x 4.5 cm) (manufactured by Pharmacia), and eluted with the same physiological saline to obtain bovine serum albumin-phenobarbital conjugate. Obtained union. As a result of measuring the degree of binding by RIA method, it was estimated that 21 moles of phenobarbital were bound to 1 mole of bovine serum albumin. Example 2 (A) Production of antibodies The oxobarbituric acid derivative antigen solution obtained as in Example 1 was diluted with physiological saline to a protein concentration of 2 mg/ml, and then diluted with 3 times the volume of complete Freund's Complete
Adjuvant) was emulsified and 1 ml (0.5 mg of protein) per rabbit was immunized with this to its foot pads, back skin, and leg muscles. After another 6 weeks, every 2 weeks,
A booster immunization of 0.25 mg of the same antigen was carried out in the same manner, and blood was collected on the 13th day after the final immunization to obtain antiserum by a conventional method. The antigen used was one to which 21 moles of phenobarbital was bound per mole of bovine serum albumin. (B) Production of insoluble antibodies In order to increase the antibody titer per protein, the antiserum obtained as in (A) above was purified with salting out and DEAE-cellulose to obtain an IgG fraction, which was then purified with CNBr-cellulose. It was combined with Sepharose 4B (manufactured by Pharmacia) by a conventional method. (C) Quantification of phenobarbital in serum Phenobarbital was quantified by EIA method using the insoluble antibody obtained as in Example 2-(B). (i) Production of enzyme-labeled phenobarbital Alkaline phosphatase (calf intestine)
Grade I, manufactured by Boehringer Mannheim,
400U/mg protein) was used as a labeling enzyme, and this and p-aminophenobarbital were combined using the carbodiimide method to produce Cephadex G-
200, the peak of enzyme activity was collected, the total volume was made up to 10 ml, and it was stored at 4°C. (Enzyme activity of preservation solution: 234.2U/mg - protein, protein amount: 76μ
g/ml, amount of phenobarbital: 4.3mol/
mol alkaline phosphatase) (ii) Quantification of phenobarbital in serum 0.1 ml of alkaline phosphatase-labeled phenobarbital obtained as in (i) above (200-fold dilution) and Example 2-(B) 0.5 ml of Sepharose-IgG prepared as above (at a dilution rate at which 50% of the above alkaline phosphatase-labeled phenobarbital binds) and 0.1 ml of the diluted serum were reacted at room temperature for 1 hour. Then 3 ml of 0.1M glycine buffer PH10.5 (1mM MgCl 2 , 0.1mM ZnCl 2 )
was added, centrifuged at 3000 rpm for 3 minutes, the supernatant was removed, the washing procedure was repeated, and the same buffer solution 2.7
ml, 0.6M paranitrophenyl phosphate
Add 30μ and incubate for 30 minutes at room temperature, then
Stop the reaction by adding 0.5 ml of INNaOH solution,
After centrifugation, measure the absorbance at 405 nm. The amount of phenobarbital in the sample was determined based on the standard calibration curve. Example 3 Relative affinity for various drugs Using the insoluble antibody of Example 2-(B), the relative affinity for various drugs was examined in the same manner as in Example 3, and the results shown in the following table were obtained. In addition, the value of relative affinity was determined from each inhibition curve (calibration curve) by determining the concentration (in moles) that inhibits the binding of the drug to the antibody by 50%, and the reciprocal thereof was expressed as a relative value with phenobarbital as 100. . 【table】