JPS6232172B2

JPS6232172B2 -

Info

Publication number: JPS6232172B2
Application number: JP58176832A
Authority: JP
Inventors: Takashi Hirano; Shinichi Oohashi; Satoshi Morimoto; Masaru Shiraki; Keishiro Tsuda; Tomoo Kobayashi; Shigeru Tsukagoshi
Original assignee: Agency of Industrial Science and Technology
Current assignee: National Institute of Advanced Industrial Science and Technology AIST
Priority date: 1983-09-24
Filing date: 1983-09-24
Publication date: 1987-07-13
Also published as: JPS6067426A

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は新規な制ガン剤に関し、さらに詳しく
は特定の分子量を有するジビニルエーテル―無水
マレイン酸共重合体に、制ガン活性物質を結合さ
せたものを活性成分として成る、低毒性かつ制ガ
ン効果に優れた制ガン剤に関するものである。近年、優れた制ガン効果を有する物質として５
―フルオロウリジンや１―β―Ｄ―アラビノフラ
ノシルシトシンのような核酸誘導体、あるいはア
ドリアマイシンやダウノマイシンのようなアント
ラサイクリン系抗生物質などが見出されている。しかしながら、これらの制ガン活性物質は、優
れた制ガン効果を有すると同時に、正常細胞に対
しても強い毒性を示す欠点を有し、したがつてそ
の使用に際しては、副作用に対して十二分な注意
が必要であり、そのため少量づつ多数回投与する
など煩雑な方法がとられている。ところで、前記のような低分子化合物である制
ガン活性物質を高分子化合物に結合させた場合、
該制ガン活性物質は体内で徐々に放出されてその
濃度が一定に保たれ、またそのものの体内分布が
変り、毒性が軽減されて制ガン効果が高まること
が期待される。本発明者らは、このような事情に鑑み、活性水
素を有する制ガン活性物質を結合させる高分子化
合物について鋭意研究を重ねた結果、ある特定の
分子量を有するジビニルエーテル―無水マレイン
酸共重合体は、それ自体優れた制ガン効果を有
し、かつ毒性が極めて低く、また分子中に多数の
酸無水物構造を有しているため、活性水素をもつ
制ガン活性物質と容易に反応し、しかもこの反応
物は温和な条件下で前記制ガン活性物質を徐々に
放出するなど、該制ガン活性物質の担体として極
めて優れていることを見出し、この知見に基づい
て本発明を完成するに至つた。すなわち、本発明は、一般式（式中のＲは水酸基又はアミノ基を有する制ガ
ン活性物質の水酸基又はアミノ基から水素原子１
個を除いた残基、ｎはＲと結合するジビニルエー
テル―無水マレイン酸共重合体の分子量2000〜
15000に相当する値である）で示される高分子化合物及びその薬理的に許容し
うる塩類を活性成分として成る制ガン剤を提供す
るものである。本発明に用いるジビニルエーテル―無水マレイ
ン酸共重合体は、次の式（式中のｎは該共重合体の分子量2000〜15000
に相当する値である）で示される分子量が2000〜15000の範囲のもので
あつて、ジビニルエーテルと無水マレイン酸とを
公知の方法に従つて共重合させることにより得ら
れる。このジビニルエーテル―無水マレイン酸共重合
体は制ガン活性、抗菌性、インターフエロン誘発
能などの種々の活性を有しているが、その分子量
が2000未満のものは前記活性が低く、その上結合
した制ガン活性物質の徐放性に問題があり、一方
15000を超えると毒性が強くなつて好ましくな
い。また、前記共重合体は、その分子中に多数の酸
無水物構造を有しているため、水酸基、アミノ
基、メルカプト基などの活性水素を有する制ガン
活性物質と容易に反応して、それぞれエステル結
合、アミド結合、チオエステル結合を形成しう
る。本発明に用いられる制ガン活性物質としては、
例えば水酸基を含有するものとして、５―フルオ
ロウリジン、アミノ基を含有するものとして、１
―β―Ｄ―アラビノフラノシルシトシン、アドリ
アマイシンやダウノマイシンのようなアントラサ
イクリン系抗生物質などが挙げられる。前記一般
式（）におけるこれらの制ガン活性物質の残基
Ｒを次に示す。

【表】

【表】本発明の制ガン剤は、例えばＮ―メチルピロリ
ドンなどの有機溶媒、トリエチルアミンなどの触
媒の存在下、ジビニルエーテル―無水マレイン酸
共重合体と前記の制ガン活性物質とを反応させた
のち加水分解し、次いでイオン交換樹脂や限外ろ
過膜などを用いて目的物以外のものを取り除いた
のち、凍結乾燥などを行うことによつて得られ
る。また、所望に応じ、前記の加水分解後、薬理
的に許容しうる塩、例えばナトリウム塩、カリウ
ム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩などに変え
たのち、限外ろ過、凍結乾燥などを行い、塩とし
て取り出してもよい。このようにして得られた制ガン剤中の制ガン活
性物質の含有量は、好ましくは５〜40重量％の範
囲である。本発明の制ガン剤における制ガン活性物質の徐
放性については、例えばアドリアマイシンとジビ
ニルエーテル―無水マレイン酸共重合体との結合
物の場合、試験管内の0.1規定、PH7.2リン酸緩衝
液中におけるアドリアマイシンの放出速度は、２
週間で約20％であつた。また１―β―Ｄ―アラビ
ノフラノシルシトシンと該共重合体との結合物の
場合、試験管内の生理食塩水溶液中における制ガ
ン活性物質の放出速度は、１週間で50％程度であ
つた。さらに、p388白血病の雄のCDF₁マウスを用い
た制ガン効果については、例えばアドリアマイシ
ンと該共重合体との結合物では最高延命率570％
（60日生存3/6）、アドリアマイシン単独では同85
％（60日生存0/6）であり、１―β―Ｄ―アラビ
ノフラノシルシトシンと該共重合体との結合物で
は最高延命率125％、１―β―Ｄ―アラビノフラ
ノシルシトシン単独では同10％であつた。このように、本発明の制ガン剤は、制ガン活性
物質の徐放性に優れ低毒性である上に、それ自体
制ガン活性をもつ該共重合体との相乗効果によ
り、該制ガン活性物質を単独で用いる場合に比べ
て、優れた制ガン効果を有する。次に実施例及び参考例によつて本発明をさらに
詳細に説明する。なお、ジビニルエーテル―無水マレイン酸共重
合体をDIVEMAと略記する。実施例１５―フルオロウリジン―DIVEMA結合物 DIVEMA（分子量7000）500mgをＮ―メチルピ
ロリドン20mlに溶かし、５―フルオロウリジン
1.00ｇ及びトリエチルアミン0.10mlを加えて、室
温下40時間かきまぜ反応させた。この反応混合物
を500mlの水中に投入し、炭酸水素ナトリウムを
加えてPH８に調整したのち、２時間放置した。次
いで1N塩酸を加えてPH３に調整後、ダイアフロ
ーメンブレン（YM―５）を用い限外ろ過して未
反応物、有機溶媒、塩を除いたのち、凍結乾燥し
て目的物593mgを白色粉末として得た。このもの
のUV吸収量から求めた５―フルオロウリジン含
有量は36.1重量％であつた。実施例２５―フルオロウリジン―DIVEMA結合物 DIVEMA（分子量7000）500mgをＮ―メチルピ
ロリドン20mlに溶かし、５―フルオロウリジン75
mg及びトリエチルアミン0.10mlを加えて、室温下
40時間かきまぜ反応させた。反応混合物を実施例１と同様の方法で処理して
目的物490mgを得た。このものの５―フルオロウ
リジン含有量は16.1重量％であつた。実施例３１―β―Ｄ―アラビノフラノシルシトシン―
DIVEMA結合物 DIVEMA（分子量7000）500mgをＮ―メチルピ
ロリドン40mlに溶かし、１―β―Ｄ―アラビノフ
ラノシルシトシン1.00ｇ及びトリエチルアミン
0.25mlを加えて、室温下40時間かきまぜ反応させ
た。次いで反応混合物を500mlの水中に投入した
のち、炭酸水素ナトリウムを加えてPH８に調整
後、２時間放置した。次に1N塩酸を加えてPHを
いつたん３付近に下げたのち、1N水酸化ナトリ
ウム水溶液でPH５に戻し、ダイアフローメンブレ
ン（YM―５）を用い限外ろ過して未反応物、有
機溶媒、塩を除き、凍結乾燥して目的物930mgを
白色粉末として得た。このもののUV吸収量から求めた１―β―Ｄ―
アラビノフラノシルシトシン含有量は38.3重量％
であつた。実施例４１―β―Ｄ―アラビノフラノシルシトシン―
DIVEMA結合物 DIVEMA（分子量7000）500mg、Ｎ―メチルピ
ロリドン40ml、１―β―Ｄ―アラビノフラノシル
シトシン150mg、トリエチルアミン0.25mlを用
い、実施例３と同様の方法で反応及び後処理を行
つて、653mgの目的物を得た。このもののUV吸収量から求めた１―β―Ｄ―
アラビノフラノシルシトシン含有量は15.2重量％
であつた。実施例５アドリアマイシン―DIVEMA結合物 DIVEMA（分子量7000）100mgを１mlの無水Ｎ
―メチルピロリドンに溶解し、かきまぜながら８
mlのＮ―メチルピロリドンに溶解させたアドリア
マイシン塩酸塩100mgを滴下した。次いで触媒と
して50μの無水トリエチルアミンを５mlのＮ―
メチルピロリドンに溶解したものを10分間で滴下
した。反応は室温で12時間、光を遮断した状態で
行つた。反応後、無水のｎ―ヘキサン１中に激
しくかきまぜながら反応液を滴下し、沈殿した赤
い固体物を新しい１のｎ―ヘキサンで洗浄し
た。沈殿物を集めて再蒸留水50mlに浮遊させ、か
きまぜながら１重量％炭酸水素ナトリウム水溶液
でPH7.0に調整した。１時間後に固形物はすべて
溶解し、赤い溶液となつた。次いで未反応のアド
リアマイシン及び触媒のトリエチルアミンを除去
するため、２回強陽イオン交換樹脂（ダウエツク
ス）200mgを加えて10分間かきまぜたのちろ過
し、10mlの水で洗浄した。ろ液を分子量１万の分
別に相当する限外ろ過膜（アミコン社製、
PM10）を用いて再蒸留水によりろ過、洗浄し
た。ろ液の色が完全になくなつた時点でろ過を止
め、0.22μ孔径のミリポアフイルターに通したの
ち、凍結乾燥した。アドリアマイシンの分解によ
つて生じる水に不溶性のアドリアマイシンは存在
しなかつた。凍結乾燥によつて204mgの赤橙色の
綿状固体物が得られた。このものは490nmの可視部の吸収から求めたと
ころ、29.4重量％のアドリアマイシンを含んでい
た。また、このアドリアマイシン―DIVEMA結
合物は水には易溶（500mg／ml）であるが、生理
食塩水には難溶であつた。しかし、水に溶解させ
たのちでは、生理食塩水に均一に混合することが
できた。また、このものはDMSO、DMF、Ｎ―
メチルピロリドンのような極性溶媒に可溶であつ
たが、ジエチルエーテル、ｎ―ヘキサン、ベンゼ
ンなどには不溶であつた。さらに赤外吸収スペク
トルは3350、2940、1720、1660、1605、1580、
1520、1405、1390、1290、1240、1210、1120、
1090、1070、1020、950、800、770cm^-1に吸収を
もち、アドリアマイシン塩酸塩に相当する吸収の
他にアミド結合（1660cm^-1）の存在が示された。
また可視・紫外部の吸収スペクトルには485、
291、253、233nmに吸収があつた。得られたアドリアマイシン―DIVEMA結合物
の赤外吸収スペクトルを第１図Ａに、可視・紫外
吸収スペクトルを第１図Ｂに示す。実施例６アドリアマイシン―DIVEMA結合物（塩型）実施例５によつて得られたアドリアマイシン―
DIVEMA結合物の水溶液を凍結乾燥直前に、１
重量％炭酸水素ナトリウム水溶液でPH7.0に調整
したのち、ミリポアフイルターを通して凍結乾燥
した。その結果、暗赤色の綿状固体物が実施例５
に対して定量的に得られ、そのものは実施例５の
生成物より容易に水に溶けることを示した。その
赤外吸収スペクトルでは1580cm^-1に大きな吸収が
現われ、1720cm^-1における吸収が減少した。ま
た、可視・紫外吸収スペクトルは変化しなかつ
た。得られた生成物の赤外吸収スペクトルを第２図
に示す。実施例７アドリアマイシン―DIVEMA結合物実施例５と同様にして、40mgのDIVEMA（分
子量7000）と20mgのアドリアマイシン塩酸塩と
を、トリエチルアミン10μを触媒としてＮ―メ
チルピロリドン10ml中で反応させたのち、実施例
５と全く同じ処理方法により58mgの赤橙色の凍結
乾燥綿状固体物を得た。このものは、可視吸収ス
ペクトルにより22.4重量％のアドリアマイシンを
含むことが分つた。その赤外吸収スペクトル及び
可視・紫外吸収スペクトルの吸収位置は実施例５
の生成物と同様であつた。実施例８ダウノマイシン―DIVEMA結合物実施例５と同様にして、40mgのDIVEMA（分
子量7000）と40mgのダウノマイシン塩酸塩をトリ
エチルアミン20μを触媒としてＮ―メチルピロ
リドン12ml中で反応させたのち、実施例５と全く
同じ処理方法により87mgの赤橙色の綿状固体物を
得た。このものは、可視吸収スペクトルにより、
32.8重量％のダウノマイシンを含むことが分つ
た。また、赤外吸収スペクトルは3450、2930、
1705、1660、1605、1570、1405、1350、1290、
1230、1210、1120、1090、1070、1040、1020、
990cm^-1に吸収をもち、可視・紫外吸収スペクト
ルは488、288、251、233nmに吸収をもつてい
た。得られた生成物の赤外吸収スペクトルを第３図
Ａに、可視・紫外吸収スペクトルを第３図Ｂに示
す。実施例９ダウノマイシン―DIVEMA結合物（塩型）実施例８で得られたダウノマイシン―
DIVEMA結合物の水溶液を１重量％炭酸水素ナ
トリウム水溶液でPH7.0に調整し凍結乾燥したと
ころ、暗赤色の綿状固体物が実施例８に対して定
量的に得られ、そのものは実施例８の生成物より
水に対する溶解性が高いことを示した。その赤外
吸収スペクトルでは1580cm^-1に大きな吸収が現わ
れ、1720cm^-1における吸収は減少した。また可
視・紫外吸収スペクトルは変化しなかつた。得られた生成物の赤外吸収スペクトルを第４図
に示す。実施例 10 ダウノマイシン―DIVEMA結合物実施例５と同様にして、40mgのDIVEMA（分
子量7000）と20mgのダウノマイシン塩酸塩とを、
トリエチルアミン10μを触媒としてＮ―メチル
ピロリドン10ml中で反応させたのち、実施例５と
全く同じ処理方法により、63mgの赤橙色の凍結乾
燥綿状固体物を得た。このものは、可視吸収スペ
クトルから求めたところ、23.5重量％のダウノマ
イシンを含んでいた。また、可視・紫外吸収スペ
クトルの吸収位置は実施例８の生成物と全く同じ
であつた。参考例１ DIVEMAの酸無水物構造を加水分解したポリ
マーを生理食塩水に溶解し、８〜10週令の雄の
CDF₁マウスの腹腔内に１回投与して、30日間マ
ウスの生死を観察した。その結果を第１表に示
す。なお、マウスは１群５〜６匹で繰り返し実験
を行い、LD₁₀を算出した。

【表】この表から明らかなように、分子量1.2万の
DIVEMAでは著しく毒性が下ること、及び脾臓
肥大の影響が少ないことが分つた。参考例２ 0.1規定、PH7.2のリン酸緩衝生理食塩水
（PBS）中におけるアドリアマイシン（Ad）―
DIVEMA結合物からのAd放出を検討した。実施例５で得られたAd―DIVEMA結合物3.2mg
を含むPBS10mlを37℃に保ち、一定時間後0.1ml
をサンプリングし、0.1N塩酸0.4mlを加えて該結
合物を沈殿させ、遠心分離した上澄液の可視部
（490nm）の吸光度を測定し、Ad放出量を求め
た。その結果を第５図に示す。なお放出量は３つ
のサンプルの平均値である。この図から、２週間経過後、約20％のアドリア
マイシンが放出されたことが分る。参考例３１―β―Ｄ―アラビノフラノシルシトシン
（AraC）―DIVEMA結合物からのAraC放出速度
を調べるために、実施例３で得たAraC―
DIVEMA結合物１mgを生理食塩水１mlに溶解さ
せて37℃に保つた。一定時間後にサンプリング
し、高速液体クロマトグラフイーで遊離のAraC
量を測定した。その結果を第６図に示す。この図から明らかなように、該結合物からの
AraC放出は極めてゆつくりであり、１週間で約
50％のAraCが放出されていることが分る。参考例４制ガン活性物質―DIVEMA結合物の制ガン活
性評価をP388白血病マウスを用いて行つた。８〜10週令の雄のCDF₁マウスの腹腔内に１×
10⁶個のP388白血病細胞を移植し、24時間後に制
ガン活性物質―DIVEMA結合物の溶液を該腹腔
内に投与した。１群６匹のマウスを実験群として
用い、生存日数の中央値を対照群と比較し、次の
式により延命率を求めた。延命率 ILS＝Ｔ−Ｃ／Ｃ×100（％）ただし、Ｔ：治療群生存日数中央値Ｃ：対照群治療日数中央値また、60日の長期生存マウスが生存する場合、
その数を求めた。第２表にAraC―DIVEMA結合物の制ガン活性
を、第３表にAd―DIVEMA結合物（塩型）の制
ガン活性を示す。

【表】

【表】【図面の簡単な説明】

第１図Ａ及びＢはそれぞれ実施例５におけるア
ドリアマイシン―DIVEMA結合物の赤外吸収ス
ペクトル及び可視・紫外吸収スペクトル、第２図
は実施例６におけるアドリアマイシン―
DIVEMA結合物（塩型）の赤外吸収スペクト
ル、第３図Ａ及びＢはそれぞれ実施例８における
ダウノマイシン―DIVEMA結合物の赤外吸収ス
ペクトル及び可視・紫外吸収スペクトル、第４図
は実施例９におけるダウノマイシン―DIVEMA
結合物（塩型）の赤外吸収スペクトルである。また、第５図は0.1規定、PH7.2のリン酸緩衝生
理食塩水中におけるアドリアマイシン―
DIVEMA結合物からのアドリアマイシンの放出
量と経過日数との関係を示すグラフ、第６図は生
理食塩水中における１―β―Ｄ―アラビノフラノ
シルシトシン―DIVEMA結合物からの１―β―
Ｄ―アラビノフラノシルシトシンの放出量と経過
日数との関係を示すグラフである。

Claims

【特許請求の範囲】１（式中のＲは水酸基又はアミノ基を有する制ガ
ン活性物質の水酸基又はアミノ基から水素原子１
個を除いた残基、ｎはＲと結合するジビニルエー
テル―無水マレイン酸共重合体の分子量2000〜
15000に相当する整数である）で示される高分子化合物及びその薬理的に許容し
うる塩類を活性成分として成る低毒性制ガン剤。