JPS6235757B2 - - Google Patents
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- JPS6235757B2 JPS6235757B2 JP54113754A JP11375479A JPS6235757B2 JP S6235757 B2 JPS6235757 B2 JP S6235757B2 JP 54113754 A JP54113754 A JP 54113754A JP 11375479 A JP11375479 A JP 11375479A JP S6235757 B2 JPS6235757 B2 JP S6235757B2
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
- C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
- C12N15/815—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts for yeasts other than Saccharomyces
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- Saccharide Compounds (AREA)
Description
本発明はプラスミツドに関する。さらに詳しく
は、クリフアロマイセス・ラクチスから得られる
新規なプラスミツドに関する。 染色体外遺伝子であるプラスミドは、インビト
ロ（in vitro）遺伝子組換えにおけるベクトル
（Vector）として、昨今の遺伝子工学において広
く用いられている。インビトロ遺伝子組換技術
は、有用な、微生物の育種をはじめとしてその用
途は広い。 現在、遺伝子工学における宿主としては、大腸
菌のような原核生物が主として用いられている
が、高等生物の作る有用物質（生長ホルモンな
ど）の微生物による生産を目標として高等生物由
来の遺伝子をクローニングするとすれば、大腸菌
よりも、酵母のような真核生物を宿主として使用
するのが有利と思われる。また酵母は人体に無害
であることから、安全度の高い遺伝子操作系とし
ての利点を有する。 本発明者等は、酵母による遺伝子操作系の開発
を目標として、サツカロマイセス・セレビジエを
用い、プロトプラスト・ポリエチレングリコール
法による細胞融合、ミトコンドリア融合、プラス
ミツドの分離等を従来より検討してきたが、今回
クリフアロマイセス・ラクチスより新らしい酵母
プラスミツドを分離することに成功した。 すなわち、本発明の要旨は、クリフアロマイセ
ス・ラクチス（ATCC8585）から得られ制限酵素
に対し下記の分解特性を有する、分子量5.3±0.1
×106ダルトンの線状プラスミツド(A)および分子
量8.3±0.1×106ダルトンの線状プラスミツド(B)
からなる群から選ばれたプラスミツドに存する。 (イ) 線状プラスミツド(A) EcoRで3.0×106ダルトンおよび2.3×106ダル
トンの２個の断片に分解され、BamHで2.8×
106ダルトンおよび2.6×106ダルトンの２個の断
片に分解され、Hindで3.4×106ダルトン、1.5
×106ダルトンおよび0.5106ダルトンの３個の断
片に分解され、Pstで3.9×106ダルトン、1.0×
106ダルトンおよび0.5×106ダルトンの３個の断
片に分解され、Hpaで分解されない。 (ロ) 線状プラスミツド(B) BamHで4.8×106ダルトンおよび3.6×106ダ
ルトンの２個の断片に分解され、Hind、Pst
およびHpaでそれぞれ分解されない。 本発明を詳細に説明するに、クリフアロマイセ
ス・ラクチス（Kluyveromyces lactis―
ATCC8585、またはIFO1267−）かプラスミツド
供試菌として用いられる。 プラスミツド分離は下記の方法(A)、(B)による。 (A) 密度勾配遠心―アガローズ・ゲル電気泳動
法。 (B) アルコール沈澱―アガローズ・ゲル電気泳動
法。 (A)法の概略：クリフアロマイセス・ラクチス菌
体を保存斜面倍地より液体完全培地に接種し、振
盪培養后、集菌する。 EDTA（エチレン・ジアミン四酢酸）を含むPH
7.0緩衝液で充分洗滌后、細胞壁溶解酵素（例え
ばチモリアーゼまたはヘリヤーゼ）を用いてプロ
トプラスト化し、SDS（ドデシル硫酸ソーダ）を
加えて溶菌し、1M NaClを加えて一夜放置（４
℃）する。遠心后、上清を塩化セシウム―エチジ
ウム・プロマイド密度勾配遠心にかけ、DNA
（デオキシリボ核酸）をバンド化し、分離する。
密度勾配遠心の条件は、上清にエチジウムプロマ
イド（２〜４mg／ml）と塩化セシウムを添加・溶
解して最終密度を1.57〜1.58g／mlとし、
38000rpm、16℃で48〜72時間遠心すればよい。
なお通常バクテリアで見出されている環状DNA
プラスミツドは、塩化セシウム―エチジウム・プ
ロマイド密度勾配遠心法で染色体DNAから分離
することができる。しかし、線状DNAであるク
リフアロマイセス・ラクチスのプラスミツドは上
記遠心法で染色体DNAから分離することができ
ないので、以下の電気泳動法を用いて、プラスミ
ツドと染色体DNAを分別する。 密度勾配遠心で分離濃縮したDNAは適当な方
法で採取し（例えば注射針で沈降管の側壁から抜
きとる。またはペリスタ・ポンプで沈降管の底部
から少量ずつ、サンプルを分画採取し、DNA区
分を集める）、エチジウム色素をブタノールで除
去し、透析・精製して、0.7〜1.5％アガローズ・
ゲル電気泳動分析にかける。 分子量を異にする２種のクリフアロマイセス・
ラクチスのプラスミツドは、染色体（核およびミ
トコンドリア）DNAより早い速度で電気泳動
し、それぞれの移動位置はUV照射で螢光（黄紅
色）を発することから容易に認知することが出来
る。 Ｂ法の概略：Ａ法に準じて、菌体からプロトプ
ラストを調製し、SDSで溶菌する。溶菌液に最終
濃度1MのNaClを加え、４℃で一夜放置后、遠沈
して上清に約２倍容量の冷アルコールを加えて核
酸を沈澱させる。沈澱をトリス塩酸緩衡液（PH
7.5）で溶解し、リボヌクレアーゼで処理后アガ
ローズゲル電気泳動にかけ移動度の差を利用して
プラスミツドを染色体DNAから分離する。 Ａ法、Ｂ法いずれを用いた場合にも、アガロー
ズ・ゲル電気泳動分析の結果、分子量（泳動移動
距離）を異にする２種のプラスミツドがクリフア
ロマイセス・ラクチス（ATCC8585または
IFO1267）に含まれていることが判明したが、そ
れぞれをアガローズゲルより分別抽出し精製后、
電子顕微鏡（Model JEOL―1OOB）で解析して
みた処、2.6〜2.7μｍ（以下、これをプラスミツ
ド(A)という）の、および4.1〜4.2μｍ（以下、こ
れをプラスミツド(B)という）の均一なサイズを持
つ線状DNA2種であることが観察された。 （ラムダ）λDNAを制限酵素（エコーアール
ワン）（EcoR、または（ヒンドスリーHind
）で分解して得られた分子量既知のDNA断片
をインターナル・マーカーとして、アガローズゲ
ル電気泳動による移動度の比較から求めたプラス
ミツドの分子量は、それぞれプラスミツド(A)＝
5.3±0.1×106ダルトン、塩基数8.9Kb、プラスミ
ツド(B)＝8.3±0.1×106ダルトン、塩基数13.4Kb
であり、電子顕微鏡観察で得られた分子サイズと
それぞれ一致した（１μｍサイズDNAの分子量
は約２×106ダルトンである）。 また、上記プラスミツドの各種制限酵素（エコ
ーアールワン（EcoR）、ヒンデイスリー
（Hind）、バムエツチワン（BamH）、プスト
ワン（Pst）、エツチパワン（Hpa）、による
分解特性を調べた結果は、次の通りである。すな
わちプラスミツド(A)（分子量5.3±0.1×106ダル
トン、塩基数8.9Kbは（エコアールワン（EcoR
）、バムエツチワン（BamH）、EcoR、
BamHで２ケの断片に、ヒンデイスリー（Hind
）、プストワン（Pst）、Hind、Pstで３
ケの断片に分解されエツチパワン（HpaI）、Hpa
で分解されない。またプラスミツド(B)（分子量
8.3±0.1×106ダルトン、塩基数13.4Kb）は、バ
ムエツチン（BamH）で２ケの断片に分解さ
れ、ヒンデイスリー（Hind）、プストワン
（Pst）、エツチヤパワン（Hpa）で分解され
ない。 また、制限酵素による分解断片の分子量は次の
通りである。 プラスミツド(A)について エコーアールワン（EcoR）：：2.3×106ダ
ルトン、3.0×106ダルトン ヒンデイスリー（Hind）：0.5×106ダルト
ン、1.5×106ダルトン、3.4×106ダルトン プストワン（Pst）：0.5×106ダルトン、1.0
×106ダルトン、3.9×106ダルトン バムエツチワン（BamH）：2.6×106ダルト
ン、2.8×106ダルトン プラスミツド(B)について バムエツチワン（BamH）：3.6×106ダルト
ン、4.8×106ダルトン 以下、本発明を実施例により説明する。 なお、以下の実施例において、プラスミツド(A)
をPGKl−１プラスミツド、プラスミツド(B)を
pGKl−２プラスミツドと称する。 実施例 １ (1) 分離・精製 （Ａ法） クリフアロマイセス・ラクチス
（Kluyveromyces lactis ATCC8585または
IFO1267）を完全培地で培養し、収得菌体1gをジ
ヤパン・ジヤーナル・オブ・ジエネテイクス
（Japan Ｊ・Genetics）53，41−49（1968）に記
載した方法に従いプロトプラスト化した。 すなわち、クリフアロマイセス・ラクチスを１
％酵母エキス―２％ペプトン―２％ブドウ糖を含
む培地（PH5.3）で培養後、水洗し、0.2％βメル
カプトエタノールおよび0.06MEDTA溶液中で30
℃、30分処理した。 次いで0.8Mソルビトール溶液で洗浄后、0.8M
ソルビトール、0.01MEDTA、0.1Mクエン酸塩―
リン酸塩緩衡液（PH6.1）で２×109／ml細胞濃度
となし、チモリアーゼ60000（キリンビール社製
細胞壁溶解酵素、アーカイブ・オブ・バイオケミ
ストリー・アンド・バイオフイジツクス（Arch.
Biochem.Biophys.）153，403−406に記載されて
いる）を最終酵素濃度１mg／mlとなるように加
え、30℃で30〜60分間反応させた。得られたプロ
トプラストを1000gで10分間遠心分離して集め、
0.8Mソルビトール中に懸濁し、再び遠心分離し
た。得られたプロトプラストに0.8Mソルビトー
ル0.1MEDTA溶液を2.5ml、また５mg／mlプロナ
ーゼＥ（TES緩衡液TrisHCl30mM、
NaCl50mM、EDTA5mM PH8.0中で37℃1.5時間
前処理したもの）を0.35ml加え、37℃で30分反応
させた。 次いで10％SDS水溶液を0.35ml加えて溶菌し、
5M塩化ナトリウム0.7mlを加えた。４℃で一夜放
置後17000rpmで60分遠沈しその上清（約６ml）
に20μｇ／mlリボヌクレアーゼを加え、37℃30分
処理した。処理液に塩化セシウム約5.7g、エチジ
ウム・ブロマイド３〜４mg（ジメチルスルフオキ
シド中に溶解したもの）を加え、最終密度を1.57
〜1.58g／mlとなるように調整し、38000rpm、16
℃48−70時間遠心分離した。生成したDNAバン
ドを350nmのUV光で照射検出し沈降管の底より
少量ずつ、ペリスターポンプを用いてサンプルを
取出しDNA区分を集めた。DNA区分を採取した
ら、ブタノール処理してエチジウム・ブロマイド
を除去し、1mMEDTAを含む0.1×SSC緩衡液
（SSC：0.15M、NaCl、0.015Mクエン酸ソーダ）
で透析后、アガローズ・ゲル電気泳動にかけ
pGKl−１プラスミツドとpGKl−２プラスミツド
を分離し、350nmUV光で検出した。 アガローズ・ゲル（数十本）からpGKl−１プ
ラスミツドとpGKl−２プラスミツドのDNA区分
を殺菌したかみそり刃で切出し、約３倍量の緩衡
液（10mMTris HCl−PH8.0、0.3M、NaCl、
0.01MEDTA）を加え、注射器に入れて射出し
た。射出液を冷所（４℃）で撹拌しながら一夜お
き、−20℃に３時間凍結した。室温で融解后、
17000rpmで30分遠心分離し、上清液をミリボア
ーフイルターでロ過し、残存するエチジウム・ブ
ロマイドをブタノール処理で除去し、1mM
EDTAを含む0.1×SSCで透析した。 透析・精製したpGKl−１プラスミツドと、
pGKl−２プラスミツドは分子量測定制限酵素分
解、電子顕微鏡分析にかけた。 （Ｂ法）Ａ法と同様にして得られたプロトプラ
スト溶菌液に最終濃度1M NaClを加え、一夜放
置し、17000rpmで60分遠心分離した。上清に２
倍量の冷エチルアルコールを加え、−20℃で30分
放置し、15000rpmで15分遠沈した。沈澱を0.4％
ザルコシルを含むTES2mlでゆつくり溶解した。 7000rpmで５分間遠沈し上清を採取した。沈澱
を0.4％ザルコシル含有TES溶液２mlに溶解し、
再び7000rpm5分間遠沈して、その上清を先に採
取した上清と合わせ、２倍容量の冷アルコールを
加えて、−20℃で30分間放置した。 次いで15000rpmで15分間遠沈し、得られた沈
澱を1mM EDTAを含む0.01MTris−HCl（PH
7.6）緩衝液300〜500μｌに溶かし、7000rpmで
５分間遠沈した。上清部を採取し、リボヌクレア
ーゼ（20μｇ／ml）で37℃、60分間処理后、アガ
ローズ・ゲル電気泳動にかけ、プラスミツド
DNAを染色体DNAから分離し、検出した。 以下、pGKl−１プラスミラツ、pGKl−２プラ
スミツドの分別抽出は、Ａ法に記した場合と同様
である。 (2) プラスミツドであることの確認 (A) 電子顕微鏡解析により、分子の長さが均一、
一定の線状DNA（pGKl−１プラスミツドの場
合2.6〜2.7μｍ、pGKl−２プラスミツドの場
合4.1〜4.2μｍ）が観察された。 (B) アガローズ・ゲル電気泳動分析で、上記線状
DNAに対応する均一分子量のDNA（pGKl−１
＝5.3±0.1×106ダルトン、pGKl−２＝8.3±
0.1×106ダルトン）が検出された。 (C) ２重鎖DNAの特定塩基配列を認識する制限
酵素によつて、pGKl−１プラスミツドと、
pGKl−２プラスミツドは特定サイズに切断さ
れる事が判つた。切断されたDNA断片の分子
量合計は切断前の各プラスミツド分子量サイズ
と一致した。 (3) 分子量測定 塩化セシウム―エチジウムブロマイド遠心法で
分離精製したpGKlプラスミツドDNAの分子量を
アガローズ・ゲル電気泳動分析により測定した結
果、pGKl−１プラスミツド＝5.3±0.1×106ダル
トン、pGKl−２プラスミツド＝8.3±0.1×106ダ
ルトンであることが判明した。分子量測定のイン
ターナル・マーカーには（ラムダ）λDNAを
（ヒンデイ）Hindで分解して得られた分子量既
知のDNA断片を用いた。 使用したアガローズ・ゲル電気泳動および
DNAの検出条件は下記の通りである。電気泳動
装置：ミツミのデイスク電気泳動装置（標準型）
を使用した。内径0.5cm、長さ９cmのガラス管中
に0.7または1.5％アガローズ・ゲルを注入し、泳
動装置の上部および下部緩衝液槽間に設置し、ア
ガローズ・ゲル上端にDNAサンプルを置く。 電気泳動：0.5μｇ／mlエチジウム・ブロマイド
を含む緩衝液（0.04M Tris、0.02M酢酸ソ
ーダ、1mMEDTA、酢酸でPH0.8に調節）
中で50V、３〜４時間行う。 泳動后、ガラス管からゲルを取出し、
350nmUV光で照射してDNAの移動位置を検出
し、R1フイルターを通してポラロイド・フイル
ム105で撮影する。 (4) 制限酵素による分解 (1)に記載の方法で分離・精製したpGKl−１プ
ラスミツドとpGKl−２プラスミツドを制限酵素
（EcoR、Hind、BamH、Pst、Hpa）
と共に表１の緩衝液中で37℃、１〜２時間反応さ
せた。65℃で５分間加熱して反応停止させ、アガ
ローズ・ゲル電気泳動法によりDNA断片の分子
量を測定した。インターナル・マーカーとしては
λDNAをEcoRで分解したDNA断片を使用し
た。 pGKl−１プラスミツドおよびpGKl−２プラス
ミツドを制限酵素で分解して得られた断片の分子
量を表２に示す。
は、クリフアロマイセス・ラクチスから得られる
新規なプラスミツドに関する。 染色体外遺伝子であるプラスミドは、インビト
ロ（in vitro）遺伝子組換えにおけるベクトル
（Vector）として、昨今の遺伝子工学において広
く用いられている。インビトロ遺伝子組換技術
は、有用な、微生物の育種をはじめとしてその用
途は広い。 現在、遺伝子工学における宿主としては、大腸
菌のような原核生物が主として用いられている
が、高等生物の作る有用物質（生長ホルモンな
ど）の微生物による生産を目標として高等生物由
来の遺伝子をクローニングするとすれば、大腸菌
よりも、酵母のような真核生物を宿主として使用
するのが有利と思われる。また酵母は人体に無害
であることから、安全度の高い遺伝子操作系とし
ての利点を有する。 本発明者等は、酵母による遺伝子操作系の開発
を目標として、サツカロマイセス・セレビジエを
用い、プロトプラスト・ポリエチレングリコール
法による細胞融合、ミトコンドリア融合、プラス
ミツドの分離等を従来より検討してきたが、今回
クリフアロマイセス・ラクチスより新らしい酵母
プラスミツドを分離することに成功した。 すなわち、本発明の要旨は、クリフアロマイセ
ス・ラクチス（ATCC8585）から得られ制限酵素
に対し下記の分解特性を有する、分子量5.3±0.1
×106ダルトンの線状プラスミツド(A)および分子
量8.3±0.1×106ダルトンの線状プラスミツド(B)
からなる群から選ばれたプラスミツドに存する。 (イ) 線状プラスミツド(A) EcoRで3.0×106ダルトンおよび2.3×106ダル
トンの２個の断片に分解され、BamHで2.8×
106ダルトンおよび2.6×106ダルトンの２個の断
片に分解され、Hindで3.4×106ダルトン、1.5
×106ダルトンおよび0.5106ダルトンの３個の断
片に分解され、Pstで3.9×106ダルトン、1.0×
106ダルトンおよび0.5×106ダルトンの３個の断
片に分解され、Hpaで分解されない。 (ロ) 線状プラスミツド(B) BamHで4.8×106ダルトンおよび3.6×106ダ
ルトンの２個の断片に分解され、Hind、Pst
およびHpaでそれぞれ分解されない。 本発明を詳細に説明するに、クリフアロマイセ
ス・ラクチス（Kluyveromyces lactis―
ATCC8585、またはIFO1267−）かプラスミツド
供試菌として用いられる。 プラスミツド分離は下記の方法(A)、(B)による。 (A) 密度勾配遠心―アガローズ・ゲル電気泳動
法。 (B) アルコール沈澱―アガローズ・ゲル電気泳動
法。 (A)法の概略：クリフアロマイセス・ラクチス菌
体を保存斜面倍地より液体完全培地に接種し、振
盪培養后、集菌する。 EDTA（エチレン・ジアミン四酢酸）を含むPH
7.0緩衝液で充分洗滌后、細胞壁溶解酵素（例え
ばチモリアーゼまたはヘリヤーゼ）を用いてプロ
トプラスト化し、SDS（ドデシル硫酸ソーダ）を
加えて溶菌し、1M NaClを加えて一夜放置（４
℃）する。遠心后、上清を塩化セシウム―エチジ
ウム・プロマイド密度勾配遠心にかけ、DNA
（デオキシリボ核酸）をバンド化し、分離する。
密度勾配遠心の条件は、上清にエチジウムプロマ
イド（２〜４mg／ml）と塩化セシウムを添加・溶
解して最終密度を1.57〜1.58g／mlとし、
38000rpm、16℃で48〜72時間遠心すればよい。
なお通常バクテリアで見出されている環状DNA
プラスミツドは、塩化セシウム―エチジウム・プ
ロマイド密度勾配遠心法で染色体DNAから分離
することができる。しかし、線状DNAであるク
リフアロマイセス・ラクチスのプラスミツドは上
記遠心法で染色体DNAから分離することができ
ないので、以下の電気泳動法を用いて、プラスミ
ツドと染色体DNAを分別する。 密度勾配遠心で分離濃縮したDNAは適当な方
法で採取し（例えば注射針で沈降管の側壁から抜
きとる。またはペリスタ・ポンプで沈降管の底部
から少量ずつ、サンプルを分画採取し、DNA区
分を集める）、エチジウム色素をブタノールで除
去し、透析・精製して、0.7〜1.5％アガローズ・
ゲル電気泳動分析にかける。 分子量を異にする２種のクリフアロマイセス・
ラクチスのプラスミツドは、染色体（核およびミ
トコンドリア）DNAより早い速度で電気泳動
し、それぞれの移動位置はUV照射で螢光（黄紅
色）を発することから容易に認知することが出来
る。 Ｂ法の概略：Ａ法に準じて、菌体からプロトプ
ラストを調製し、SDSで溶菌する。溶菌液に最終
濃度1MのNaClを加え、４℃で一夜放置后、遠沈
して上清に約２倍容量の冷アルコールを加えて核
酸を沈澱させる。沈澱をトリス塩酸緩衡液（PH
7.5）で溶解し、リボヌクレアーゼで処理后アガ
ローズゲル電気泳動にかけ移動度の差を利用して
プラスミツドを染色体DNAから分離する。 Ａ法、Ｂ法いずれを用いた場合にも、アガロー
ズ・ゲル電気泳動分析の結果、分子量（泳動移動
距離）を異にする２種のプラスミツドがクリフア
ロマイセス・ラクチス（ATCC8585または
IFO1267）に含まれていることが判明したが、そ
れぞれをアガローズゲルより分別抽出し精製后、
電子顕微鏡（Model JEOL―1OOB）で解析して
みた処、2.6〜2.7μｍ（以下、これをプラスミツ
ド(A)という）の、および4.1〜4.2μｍ（以下、こ
れをプラスミツド(B)という）の均一なサイズを持
つ線状DNA2種であることが観察された。 （ラムダ）λDNAを制限酵素（エコーアール
ワン）（EcoR、または（ヒンドスリーHind
）で分解して得られた分子量既知のDNA断片
をインターナル・マーカーとして、アガローズゲ
ル電気泳動による移動度の比較から求めたプラス
ミツドの分子量は、それぞれプラスミツド(A)＝
5.3±0.1×106ダルトン、塩基数8.9Kb、プラスミ
ツド(B)＝8.3±0.1×106ダルトン、塩基数13.4Kb
であり、電子顕微鏡観察で得られた分子サイズと
それぞれ一致した（１μｍサイズDNAの分子量
は約２×106ダルトンである）。 また、上記プラスミツドの各種制限酵素（エコ
ーアールワン（EcoR）、ヒンデイスリー
（Hind）、バムエツチワン（BamH）、プスト
ワン（Pst）、エツチパワン（Hpa）、による
分解特性を調べた結果は、次の通りである。すな
わちプラスミツド(A)（分子量5.3±0.1×106ダル
トン、塩基数8.9Kbは（エコアールワン（EcoR
）、バムエツチワン（BamH）、EcoR、
BamHで２ケの断片に、ヒンデイスリー（Hind
）、プストワン（Pst）、Hind、Pstで３
ケの断片に分解されエツチパワン（HpaI）、Hpa
で分解されない。またプラスミツド(B)（分子量
8.3±0.1×106ダルトン、塩基数13.4Kb）は、バ
ムエツチン（BamH）で２ケの断片に分解さ
れ、ヒンデイスリー（Hind）、プストワン
（Pst）、エツチヤパワン（Hpa）で分解され
ない。 また、制限酵素による分解断片の分子量は次の
通りである。 プラスミツド(A)について エコーアールワン（EcoR）：：2.3×106ダ
ルトン、3.0×106ダルトン ヒンデイスリー（Hind）：0.5×106ダルト
ン、1.5×106ダルトン、3.4×106ダルトン プストワン（Pst）：0.5×106ダルトン、1.0
×106ダルトン、3.9×106ダルトン バムエツチワン（BamH）：2.6×106ダルト
ン、2.8×106ダルトン プラスミツド(B)について バムエツチワン（BamH）：3.6×106ダルト
ン、4.8×106ダルトン 以下、本発明を実施例により説明する。 なお、以下の実施例において、プラスミツド(A)
をPGKl−１プラスミツド、プラスミツド(B)を
pGKl−２プラスミツドと称する。 実施例 １ (1) 分離・精製 （Ａ法） クリフアロマイセス・ラクチス
（Kluyveromyces lactis ATCC8585または
IFO1267）を完全培地で培養し、収得菌体1gをジ
ヤパン・ジヤーナル・オブ・ジエネテイクス
（Japan Ｊ・Genetics）53，41−49（1968）に記
載した方法に従いプロトプラスト化した。 すなわち、クリフアロマイセス・ラクチスを１
％酵母エキス―２％ペプトン―２％ブドウ糖を含
む培地（PH5.3）で培養後、水洗し、0.2％βメル
カプトエタノールおよび0.06MEDTA溶液中で30
℃、30分処理した。 次いで0.8Mソルビトール溶液で洗浄后、0.8M
ソルビトール、0.01MEDTA、0.1Mクエン酸塩―
リン酸塩緩衡液（PH6.1）で２×109／ml細胞濃度
となし、チモリアーゼ60000（キリンビール社製
細胞壁溶解酵素、アーカイブ・オブ・バイオケミ
ストリー・アンド・バイオフイジツクス（Arch.
Biochem.Biophys.）153，403−406に記載されて
いる）を最終酵素濃度１mg／mlとなるように加
え、30℃で30〜60分間反応させた。得られたプロ
トプラストを1000gで10分間遠心分離して集め、
0.8Mソルビトール中に懸濁し、再び遠心分離し
た。得られたプロトプラストに0.8Mソルビトー
ル0.1MEDTA溶液を2.5ml、また５mg／mlプロナ
ーゼＥ（TES緩衡液TrisHCl30mM、
NaCl50mM、EDTA5mM PH8.0中で37℃1.5時間
前処理したもの）を0.35ml加え、37℃で30分反応
させた。 次いで10％SDS水溶液を0.35ml加えて溶菌し、
5M塩化ナトリウム0.7mlを加えた。４℃で一夜放
置後17000rpmで60分遠沈しその上清（約６ml）
に20μｇ／mlリボヌクレアーゼを加え、37℃30分
処理した。処理液に塩化セシウム約5.7g、エチジ
ウム・ブロマイド３〜４mg（ジメチルスルフオキ
シド中に溶解したもの）を加え、最終密度を1.57
〜1.58g／mlとなるように調整し、38000rpm、16
℃48−70時間遠心分離した。生成したDNAバン
ドを350nmのUV光で照射検出し沈降管の底より
少量ずつ、ペリスターポンプを用いてサンプルを
取出しDNA区分を集めた。DNA区分を採取した
ら、ブタノール処理してエチジウム・ブロマイド
を除去し、1mMEDTAを含む0.1×SSC緩衡液
（SSC：0.15M、NaCl、0.015Mクエン酸ソーダ）
で透析后、アガローズ・ゲル電気泳動にかけ
pGKl−１プラスミツドとpGKl−２プラスミツド
を分離し、350nmUV光で検出した。 アガローズ・ゲル（数十本）からpGKl−１プ
ラスミツドとpGKl−２プラスミツドのDNA区分
を殺菌したかみそり刃で切出し、約３倍量の緩衡
液（10mMTris HCl−PH8.0、0.3M、NaCl、
0.01MEDTA）を加え、注射器に入れて射出し
た。射出液を冷所（４℃）で撹拌しながら一夜お
き、−20℃に３時間凍結した。室温で融解后、
17000rpmで30分遠心分離し、上清液をミリボア
ーフイルターでロ過し、残存するエチジウム・ブ
ロマイドをブタノール処理で除去し、1mM
EDTAを含む0.1×SSCで透析した。 透析・精製したpGKl−１プラスミツドと、
pGKl−２プラスミツドは分子量測定制限酵素分
解、電子顕微鏡分析にかけた。 （Ｂ法）Ａ法と同様にして得られたプロトプラ
スト溶菌液に最終濃度1M NaClを加え、一夜放
置し、17000rpmで60分遠心分離した。上清に２
倍量の冷エチルアルコールを加え、−20℃で30分
放置し、15000rpmで15分遠沈した。沈澱を0.4％
ザルコシルを含むTES2mlでゆつくり溶解した。 7000rpmで５分間遠沈し上清を採取した。沈澱
を0.4％ザルコシル含有TES溶液２mlに溶解し、
再び7000rpm5分間遠沈して、その上清を先に採
取した上清と合わせ、２倍容量の冷アルコールを
加えて、−20℃で30分間放置した。 次いで15000rpmで15分間遠沈し、得られた沈
澱を1mM EDTAを含む0.01MTris−HCl（PH
7.6）緩衝液300〜500μｌに溶かし、7000rpmで
５分間遠沈した。上清部を採取し、リボヌクレア
ーゼ（20μｇ／ml）で37℃、60分間処理后、アガ
ローズ・ゲル電気泳動にかけ、プラスミツド
DNAを染色体DNAから分離し、検出した。 以下、pGKl−１プラスミラツ、pGKl−２プラ
スミツドの分別抽出は、Ａ法に記した場合と同様
である。 (2) プラスミツドであることの確認 (A) 電子顕微鏡解析により、分子の長さが均一、
一定の線状DNA（pGKl−１プラスミツドの場
合2.6〜2.7μｍ、pGKl−２プラスミツドの場
合4.1〜4.2μｍ）が観察された。 (B) アガローズ・ゲル電気泳動分析で、上記線状
DNAに対応する均一分子量のDNA（pGKl−１
＝5.3±0.1×106ダルトン、pGKl−２＝8.3±
0.1×106ダルトン）が検出された。 (C) ２重鎖DNAの特定塩基配列を認識する制限
酵素によつて、pGKl−１プラスミツドと、
pGKl−２プラスミツドは特定サイズに切断さ
れる事が判つた。切断されたDNA断片の分子
量合計は切断前の各プラスミツド分子量サイズ
と一致した。 (3) 分子量測定 塩化セシウム―エチジウムブロマイド遠心法で
分離精製したpGKlプラスミツドDNAの分子量を
アガローズ・ゲル電気泳動分析により測定した結
果、pGKl−１プラスミツド＝5.3±0.1×106ダル
トン、pGKl−２プラスミツド＝8.3±0.1×106ダ
ルトンであることが判明した。分子量測定のイン
ターナル・マーカーには（ラムダ）λDNAを
（ヒンデイ）Hindで分解して得られた分子量既
知のDNA断片を用いた。 使用したアガローズ・ゲル電気泳動および
DNAの検出条件は下記の通りである。電気泳動
装置：ミツミのデイスク電気泳動装置（標準型）
を使用した。内径0.5cm、長さ９cmのガラス管中
に0.7または1.5％アガローズ・ゲルを注入し、泳
動装置の上部および下部緩衝液槽間に設置し、ア
ガローズ・ゲル上端にDNAサンプルを置く。 電気泳動：0.5μｇ／mlエチジウム・ブロマイド
を含む緩衝液（0.04M Tris、0.02M酢酸ソ
ーダ、1mMEDTA、酢酸でPH0.8に調節）
中で50V、３〜４時間行う。 泳動后、ガラス管からゲルを取出し、
350nmUV光で照射してDNAの移動位置を検出
し、R1フイルターを通してポラロイド・フイル
ム105で撮影する。 (4) 制限酵素による分解 (1)に記載の方法で分離・精製したpGKl−１プ
ラスミツドとpGKl−２プラスミツドを制限酵素
（EcoR、Hind、BamH、Pst、Hpa）
と共に表１の緩衝液中で37℃、１〜２時間反応さ
せた。65℃で５分間加熱して反応停止させ、アガ
ローズ・ゲル電気泳動法によりDNA断片の分子
量を測定した。インターナル・マーカーとしては
λDNAをEcoRで分解したDNA断片を使用し
た。 pGKl−１プラスミツドおよびpGKl−２プラス
ミツドを制限酵素で分解して得られた断片の分子
量を表２に示す。
【表】
【表】
【表】
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ クリフアロマイセス・ラクチス
（ATCC8585）から得られ制限酵素に対し下記の
分解特性を有する分子量5.3±0.1×106ダルトン
の線状プラスミツド(A)および分子量8.3±0.1×
106ダルトンの線状プラスミツド(B)からなる群か
ら選ばれたプラスミツド。 (イ) 線状プラスミツド(A) EcoRIで3.0×106ダルトンおよび2.3×106ダル
トンの２個の断片に分解され、BamHで2.8×
106ダルトンおよび2.6×106ダルトンの２個の断
片に分解され、Hindで3.4×106ダルトン、1.5
×106ダルトンおよび0.5×106ダルトンの３個の
断片に分解され、Pstで3.9×106ダルトン、1.0
×106ダルトンおよび0.5×106ダルトンの３個の
断片に分解され、Hpaで分解されない。 (ロ) 線状プラスミツド(B) BamHで4.8×106ダルトンおよび3.6×106ダ
ルトンの２個の断片に分解され、Hind、Pst
およびHpaでそれぞれ分解されない。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP11375479A JPS5639099A (en) | 1979-09-05 | 1979-09-05 | Plasmid |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP11375479A JPS5639099A (en) | 1979-09-05 | 1979-09-05 | Plasmid |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS5639099A JPS5639099A (en) | 1981-04-14 |
| JPS6235757B2 true JPS6235757B2 (ja) | 1987-08-04 |
Family
ID=14620275
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP11375479A Granted JPS5639099A (en) | 1979-09-05 | 1979-09-05 | Plasmid |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS5639099A (ja) |
Families Citing this family (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS57146571A (en) * | 1981-03-09 | 1982-09-10 | Mitsubishi Chem Ind Ltd | Killer yeast |
| JPS57179196A (en) * | 1981-04-28 | 1982-11-04 | Takeda Chem Ind Ltd | Plasmid and its preparation |
| FR2532656B2 (fr) * | 1982-06-02 | 1985-10-18 | Elf Bio Rech | Nouveau vecteur de clonage et d'expression, levure et bacterie transformees par ce vecteur |
| FR2528069B1 (fr) * | 1982-06-02 | 1985-07-12 | Elf Bio Rech | Nouveau vecteur de clonage et d'expression, levure transformee par ce vecteur |
-
1979
- 1979-09-05 JP JP11375479A patent/JPS5639099A/ja active Granted
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS5639099A (en) | 1981-04-14 |
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