JPS6236487B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は、ヒト血液凝固第因子（以下第
因子という）の精製法に関する。 近年止血血栓機構との関連における創傷治癒機
転の一端として、フイブリノーゲン−フイブリン
系の不溶性フイブリン形成に関与している第
因子の作用が注目されてきた。 先天性血液凝固第因子欠損症で観察される
出血と創傷治癒遅延という異常症状は、第因
子の基質となるフイブリンのγ（ガンマー）錯間
の架橋形成（cross−linking クロスリンキン
グ）不全により起こることが知られている。そし
てまた、フイブリンのγ（ガンマー）鎖間の架橋
形成（cross−linking）のみならず、α（アルフ
ア）鎖間のクロスリンキングの有する生物学的意
義についても関心が向けられるようになつた。す
なわち、前者は、γ（ガンマー）鎖が化学的安定
性を通して尿素に不溶性にするのに対して、後者
はフイブリンの物理的・機械的強固さを規制する
のではないかと考えられるようになつた。さらに
また、フイブリノーゲン精製時ならびに抗血友病
因子精製時などに終始つきまとう夾雑物としてし
か、これまでに把握されていなかつたコールド
インソリユブル グロブリン（cold insoluble
globulin）がフイブリン以外に第因子の基質
となり得て、生物学的にきわめて重要な役割を演
じているらしいことがわかつてきた。創傷治癒の
初期には、フイブリンのα（アルフア）鎖間のク
ロスリンキングが、単にフイブリン間のみなら
ず、コールド イソリユブル グロブリンとの間
においても進行する、という形で、創傷治癒初期
相が第因子に依存しているのではないかと考
えられている。 文献： ピサノ J.J（Pisano、J.J）、アナルズオブ
ザ ニユーヨーク アカデミー オブ サイ
エンス（Ann.N.Y.Acad.Sci.）、202、98
（1972） マクドナハ R.P.（McDonagh、R.P.）、ザ
シツクステイーンス インターナシヨナルコ
ングレンス オブ ヘマトロジイ（The 16th
International Congr.Hematol.）、Kyoto、1976 モツシヤー D.F.（Mosher、D.F.）、ジヤ
ーナル オブ バイオロジカル ケミストリー
（J.Biol.Chem.）、250、6614（1975） 以上のことから、第因子製剤は臨床適用に
おいて、先天性ないし後天性血液凝固第因子
欠損症及び減少症はもちろんのこと、広く一般外
科手術後の創傷治癒促進に対して効を奏すること
は明らかである。 第因子の製造原料としては、価格、収量、
既製品の製造との関連性などから、人胎盤を用い
ることが優れており、第因子の製造法として
は、胎盤から硫安分画法を主体にした方法（特開
昭53−59018号）、胎盤由来の粗グロブリン画分か
らポリアルキレングリコール分画法による方法
（特開昭53−136996号）、胎盤抽出物からのリバノ
ール、硫安分画法による方法（特開昭47−13446
号、特開昭47−13447号）などの方法がある。 本発明の目的は硫安分画法による第因子の
精製において、夾雑物をより選択的に除去し、第
因子の効率的な純度の上昇と回収をはかるた
めの方法を提供し、この方法を従来法の硫安分画
工程にかえて、また従来の硫安分画工程、ポリエ
チレングリコール分画工程、その他の分画工程の
付加的工程として利用せしめようとするものであ
り、これによつてより高度に精製された第因
子を得んとするものである。 本発明は、第因子及び夾雑物として他の血
液成分を含有する水溶液を硫安分画法によつて精
製するに際して、該水溶液の処理温度を１゜〜15
℃とすること、該水溶液のPHを6.0〜6.6とするこ
と、該水溶液に添加する硫酸アンモニウムの飽和
度を30〜35％とすること、かかる条件下で処理後
沈澱する画分を回収することによる第因子の
精製方法に関する。 本発明を以下において説明する。 本発明において精製の対象とされるのは第
因子を含有する水溶液であり、たとえばヒト胎
盤、血液その他第因子含有物からの水（たと
えば生理的食塩水、リン酸緩衝液など）抽出物な
どが対象とされる。 本発明においては、かかる抽出物をそのまま、
あるいは従来提案されている分画法（硫安、アク
リノール、ポリアルキレングリコール等による分
画法）を漸次組み合せて適用し、予備的に精製し
たものを用いてもよい。 本発明の硫安分画精製処理がなされる前に第
因子含有水溶液は、蛋白濃度（夾雑蛋白をも含
む）が、１〜３％の水溶液に調整されていること
が好ましく、またその比活性は0.1〜１単位／ml
〔新鮮な正常人血漿１ml中に含まれる第因子
活性量を１単位〔スロンボシス ダイアセシス
ヘモラジカ（Thrombosis et Diathesis
Haemorrhagica）23、455（1970）〕であることが
好ましい。水溶液は、PH6.0〜6.6、好ましくは6.2
〜6.4に調整されていることが必要である。水溶
液の蛋白濃度およびPHの調整には緩衝液たとえば
0.01〜0.1Mのリン酸緩衝液等が使える。 精製処理中の当該水溶液の温度は、通常１゜〜
15℃、好ましくは１゜〜10℃である。添加する硫
酸アンモニウムの飽和度は、30〜35％である。 本発明による硫安分画処理は、前述の条件下で
通常約0.5〜２時間の撹拌後３〜10時間静置する
ことによつて行われる。処理後、第因子は、
たとえば5000〜10000rpmの遠心分離によつて沈
澱として回収される。かくして得られた第因
子画分は、すでに他の方法で十分精製されている
場合は、これを公知の方法に従い透析、除菌ろ
過、凍結乾燥することにより医療用に用いうる第
因子製剤をうる。また、本発明の処理後、第
因子の結晶化あるいは試薬として用いうる程
度に高度精製された第因子を得るためには、
例えば、等電点分画法、特定蛋白の抗体を使つた
アフイニテイークロマトグラフイー等の技術を応
用してもよい。 本発明の精製法によれば、約70〜90％の回収率
が得られ、その比活性の上昇は、前記特定した比
活性の水溶液を用いた場合、精製前にくらべて約
３〜６倍である。また、各種血漿蛋白のウサギ抗
血清を用いた免疫電気泳動法による夾雑蛋白質の
分析によると実施例１で用いた原材料において確
認された夾雑蛋白質が、本発明処理工程をへるこ
とによつて完全に免疫学的に消失している。（表
１）。 次に実施例を挙げて本発明を具体的に説明す
る。 実施例 １ ヒトの胎盤を生理的食塩水をもつて抽出した抽
出液800（胎盤約840個、約510Kg）を遠心分離
し、PHを5.0に調整し生ずる沈澱を遠心分離し、
上清をPH６としてこれに硫酸アンモニウムを25％
飽和になるまで加え、生ずる沈澱を遠心分離によ
り除去、上清に更に硫安をPH７において50％飽和
させることにより粗グロブリン画分を沈澱させて
遠心分離により集めた。この画分を出発原料とし
て本発明の処理をおこなつた。即ち、この出発原
料を0.05Mリン酸緩衝液（PH6.3）に溶解し、蛋
白濃度を２％第因子の比活性を0.7単位／ml
に調整し、その後硫酸アンモニウムを30％飽和に
まで添加し、10℃で約１時間撹拌した。約５時間
静置後、遠心によつて沈澱を回収した。この沈澱
を透析、除菌ろ過、分注を経て凍結乾燥した。総
活性230万単位、蛋白として200ｇを得た。 実施例 ２ 実施例１の粗グロブリン画分3.5Kgを、0.005M
のEDTAを含むPH7.5の0.05Mリン酸緩衝液100
に溶解させた。この溶液にプルロニツク（ポリオ
キシエチレンとポリオキシプロピレンの共重合
体：平均分子量15000）7.0Kgを加え溶解させる。
一夜静置して生じた沈澱（グロブリンの精製に供
用できる）を遠心分離して除く。得られた上清に
再びプルロニツクを添加して終濃度25％（Ｗ／
Ｖ）とする。 一夜静置後沈澱を分離し、再び前記緩衝液に溶
かし、蛋白濃度を３％、第因子の比活性を１
単位／mlに調整し、その後硫酸アンモニウムを33
％飽和にまで添加し、５℃で約30分撹拌した。約
２時間静置後、遠心によつて沈澱を回収した。こ
の沈澱を透析、除菌ろ過、分注を経て凍結乾燥し
た。総活性200万単位、蛋白てして180ｇを得た。

【表】

【表】

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ ヒト血液凝固第因子及び夾雑物として他
   の血液成分を含有する水溶液を硫安分画法によつ
   て精製する方法において、水溶液の温度１゜〜15
   ℃、PH6.0〜6.6、添加する硫酸アンモニウムの飽
   和度30〜35％とし、沈澱する画分を回収すること
   を特徴とするヒト血液凝固第因子の精製方
   法。