【発明の詳細な説明】[Detailed description of the invention]
本発明はヒト尿中酸性プロテアーゼを有効成分
とする免疫複合体病治療剤に関する。
慢性関節リウマチ、全身紅斑性狠瘡（SLE）あ
るいはルーブス腎炎に代表される免疫複合体病
（イミユーン コンプレツクス デイズイーズ、
immune complex disease）はその名の通り、
種々の抗原と抗体との複合体すなわち免疫複合体
により惹き起こされる疾患である。免疫複合体病
の発症機序は複雑であり、不明な点も多いが、お
およそ次のような経過をたどるものと考えられて
いる。すなわち、細菌やウイルス感染などによつ
て組織に障害が起こると、新たに出現した自己抗
原やウイルス感染細胞などに対する抗体が産生さ
れ、これらの抗体は対応する抗原と反応して免疫
複合体をを形成する。免疫複合体は補体系、血小
板などを活性化し、ヒスタミン、セロトニンなど
の血管作働物質を遊離するため血管透過性が亢進
する。次いで、流血中の免疫複合体が透過性の亢
進した血管壁に入り込み、基底膜に沿つて沈着す
る。沈着した免疫複合体に補体が作用して生成さ
れる白血球遊走因子によつて免疫複合体の沈着部
位に多核白血球が集簇する。多核白血球は免疫複
合体と反応すると、種々の組織障害物質、例えば
カテプシンＤ，Ｅ、コラゲナーゼ、エラスター
ゼ、血管透過性因子（パーミアビリテイーフアク
ター、permeability factor）などを放出し、これ
らの物質によつて遂に組織障害が惹き起こされ
る。SLEなどの免疫複合体病患者の血中補体価は
一般に低く、病状の悪化と補体価の低下は密接に
相関し、この補体価の低下は抗原−抗体反応部
位、例えば腎、血管などで多量の補体が消費され
るためであるとされている。また、免疫複合体は
血液凝固系とも関連し、障害組織へのフイブリノ
イド沈着を促進するなど、その多様な障害機構に
よつて重篤な病変へと進展させるものと考えられ
ている。
現在、これら免疫複合体病の治療には、亢進し
た免疫系を抑制し、局所の炎症、疼痛を鎮めるた
めのステロイド剤をはじめとする免疫抑制剤や抗
炎症剤、あるいは血管内で生じた凝固線溶系の異
常を改善するための抗凝固剤や抗血小板剤などが
使用されている。しかしながら、これらの薬剤は
作用が弱く、副作用が強いため必ずしも満足でき
る治療効果が得られていないことから、安全且つ
治療効果の高い薬剤の開発が切望されている。
このような背景に鑑み、本発明者らは免疫複合
体病のより有効な治療剤を開発すべく、長年にわ
たり研究を重ねた結果、ヒト尿中酸性プロテアー
ゼが免疫複合体を特異的に分解することを見出
し、さらに、この酸性プロテアーゼが各種免疫複
合体病を著明に抑制することを確認し、本発明を
完成するに至つた。
本発明の免疫複合体病治療剤の有効成分である
酸性プロテアーゼは公知の酵素であるが〔ミルス
キーら（Mirsky et al.），ジヤーナル オブ ク
リニカル インベステイゲーシヨン（J.Clin.
Invest.）27巻、818頁、1948年〕、従来、免疫複
合体病に対する治療剤としては用いられたことが
なかつた。この酸性プロテアーゼは蛋白質を精製
する場合に用いる一般的方法、例えば塩析法、無
機吸着体による吸着クロマトグラフイー、イオン
交換樹脂によるイオン交換クロマトグラフイー、
分子ふるい効果を有するゲルクロマトグラフイー
などを適宜組み合わせることによりヒト尿から採
取することができる。
例えば、ヒト尿をセイフアーら（Seijffers）の
方法〔アメリカン ジヤーナル オブ フイジオ
ロジー（Amer.J.Physiol.）206巻、1106頁、1964
年〕に準じ、0.1M酢酸緩衝液（PH5.3）にて平衡
化したDEAE−セルロースカラムを通過させるこ
とにより、酸性プロテアーゼを吸着させたのち、
0.3Mの塩化ナトリウムを含む同緩衝液にて溶出
する。溶出液を濃縮後、0.9％の生理食塩水に膨
潤せしめたセフアデツクスＧ−100によるゲルク
ロマトグラフイーにてさらに精製し、酸処理を行
うことにより本発明の酸性プロテアーゼを得るこ
とができる。
本法により得た酸性プロテアーゼは、セフアデ
ツクスＧ−100ゲルクロマトグラフイーによる分
析の結果、分子量32000−38000であり、アンフオ
ライン等電点電気泳動法による等電点は１〜３で
あり極大吸収278nm、ニンヒドリン反応陽性、水
に易溶、エーテル、クロロホルムに不溶である。
また、この酸性プロテアーゼは、PH7.0以下の酸
性領域にて、ヘモグロビンに対して高い水解活性
を示すが、ペプスタチンによつて著明に抑制され
る性質を有する。また、この酸性プロテアーゼは
PH7.0以下の酸性領域にて安定、PH8.0以上のアル
カリ性にて不安定である。以下、この酸性プロテ
アーゼの薬理作用および毒性を試験例にて説明す
る。
試験例１ 免疫複合体水解作用
可溶性免疫複合体〔ヒトIgG−抗ヒトIgG抗体
（家兎）〕15mgと酸性プロテアーゼ、トリプシン、
α−キモトリプシンあるいはプラスミン各３mgを
１mlのリン酸緩衝液（0.06M，PH6.0）に溶解
し、37℃で60分間インキユベーシヨンした。20％
過塩素酸溶液１mlを加え反応を停止せしめ、上清
の280nmの吸光度を測定した。また、免疫複合体
の代りに、ヒトIgGを用い、同様の操作を行い、
両者の水解比を比較した。なお、水解活性はヒト
IgGを酸性プロテアーゼで処理したときの値を
100として相対値で表わした。結果を第１表に示
す。
酸性プロテアーゼは他のプロテアーゼに比し、
正常ヒトIgGよりも可溶性免疫複合体を選択的に
水解した。
The present invention relates to a therapeutic agent for immune complex diseases containing human urinary acid protease as an active ingredient. Rheumatoid arthritis, systemic erythematosus erythematosus (SLE), and immune complex diseases represented by rubus nephritis.
As the name suggests, immune complex disease)
It is a disease caused by complexes of various antigens and antibodies, that is, immune complexes. Although the onset mechanism of immune complex diseases is complex and there are many unknown points, it is thought that the disease progresses roughly as follows. In other words, when tissue damage occurs due to bacterial or viral infection, antibodies against newly appeared self-antigens or virus-infected cells are produced, and these antibodies react with the corresponding antigens to form immune complexes. Form. Immune complexes activate the complement system, platelets, etc., and release vasoactive substances such as histamine and serotonin, leading to increased vascular permeability. Immune complexes in the bloodstream then enter the hyperpermeable vessel walls and are deposited along the basement membrane. Multinucleated leukocytes gather at the site of immune complex deposition by leukocyte migration factors produced by the action of complement on the deposited immune complexes. When polynuclear leukocytes react with immune complexes, they release various tissue-damaging substances, such as cathepsin D and E, collagenase, elastase, and vascular permeability factor. Eventually, tissue damage is caused. Blood complement levels in patients with immune complex diseases such as SLE are generally low, and the worsening of the condition is closely correlated with the decrease in complement levels. This is thought to be due to the consumption of large amounts of complement. Immune complexes are also associated with the blood coagulation system, and are thought to lead to the development of serious lesions through various damage mechanisms, such as promoting fibrinoid deposition in damaged tissues. Currently, treatments for these immune complex diseases include immunosuppressants and anti-inflammatory drugs such as steroids to suppress the overactive immune system and calm local inflammation and pain, as well as anti-inflammatory drugs that suppress the overactive immune system and suppress local inflammation and pain. Anticoagulants and antiplatelet agents are used to improve fibrinolytic abnormalities. However, these drugs have weak effects and strong side effects, and therefore do not necessarily provide satisfactory therapeutic effects.Therefore, there is a strong desire for the development of safe and highly therapeutic drugs. In view of this background, the present inventors have conducted research over many years to develop more effective therapeutic agents for immune complex diseases, and as a result, they have discovered that human urinary acid protease specifically degrades immune complexes. They discovered that this acidic protease significantly suppresses various immune complex diseases, and completed the present invention. Acidic protease, which is the active ingredient of the therapeutic agent for immune complex diseases of the present invention, is a known enzyme [Mirsky et al., Journal of Clinical Investigation (J.Clin.
Invest.) Vol. 27, p. 818, 1948], and had never been used as a therapeutic agent for immune complex diseases. This acidic protease can be purified using general methods used to purify proteins, such as salting-out method, adsorption chromatography using an inorganic adsorbent, ion-exchange chromatography using an ion-exchange resin,
It can be collected from human urine by appropriately combining gel chromatography, etc., which has a molecular sieving effect. For example, the method of Seijffers et al. [American Journal of Physiol., Vol. 206, p. 1106, 1964]
After adsorbing acidic protease by passing it through a DEAE-cellulose column equilibrated with 0.1M acetate buffer (PH5.3),
Elute with the same buffer containing 0.3M sodium chloride. After concentrating the eluate, it is further purified by gel chromatography using Sephadex G-100 swollen in 0.9% physiological saline, followed by acid treatment to obtain the acidic protease of the present invention. The acidic protease obtained by this method has a molecular weight of 32,000-38,000 as a result of analysis using Sephadex G-100 gel chromatography, an isoelectric point of 1 to 3 using ampholine isoelectric focusing, and a maximum absorption of 278 nm. Positive reaction, easily soluble in water, insoluble in ether and chloroform.
Furthermore, this acidic protease exhibits high hydrolysis activity for hemoglobin in an acidic region of pH 7.0 or lower, but has the property of being significantly inhibited by pepstatin. In addition, this acidic protease
Stable in acidic areas below PH7.0, unstable in alkaline areas above PH8.0. The pharmacological action and toxicity of this acidic protease will be explained below using test examples. Test Example 1 Immune complex hydrolysis 15 mg of soluble immune complex [human IgG - anti-human IgG antibody (rabbit)], acidic protease, trypsin,
3 mg each of α-chymotrypsin or plasmin was dissolved in 1 ml of phosphate buffer (0.06M, PH6.0) and incubated at 37°C for 60 minutes. 20%
The reaction was stopped by adding 1 ml of perchloric acid solution, and the absorbance of the supernatant at 280 nm was measured. Also, instead of the immune complex, human IgG was used and the same procedure was performed.
The water splitting ratios of both were compared. In addition, the hydrolytic activity is
The value when IgG is treated with acidic protease is
Expressed as a relative value as 100. The results are shown in Table 1. Compared to other proteases, acidic proteases
Soluble immune complexes were selectively hydrolyzed over normal human IgG.
【表】
試験例２ 免疫複合体水解作用
可溶性免疫複合体〔ヒトIgG−抗ヒトIgG抗体
（家兎）〕15mgと酸性プロテアーゼあるいはトリプ
シン0.3mgを１mlのリン酸緩衝液（0.06M、PH
6.0）に溶解し、ついで、ラツト血清あるいは同
緩衝液250μを添加し、37℃で60分間インキユ
ベーシヨンした。反応終了後、残存するヒトIgG
を抗ヒトIgG家兎血清を用い一次元免疫拡散法に
より測定し、水解されたヒトIgGの百分率を算出
した。結果を第２表に示す。
酸性プロテアーゼの免疫複合体水解活性は血清
添加によつて影響されなかつた。一方、トリプシ
ンの水解活性は血清添加により、著しく低下し
た。[Table] Test Example 2 Immune complex hydrolysis 15 mg of soluble immune complex [human IgG - anti-human IgG antibody (rabbit)] and 0.3 mg of acidic protease or trypsin were mixed in 1 ml of phosphate buffer (0.06M, PH
6.0), then 250μ of rat serum or the same buffer was added and incubated at 37°C for 60 minutes. Human IgG remaining after the reaction
was measured by one-dimensional immunodiffusion method using anti-human IgG rabbit serum, and the percentage of hydrolyzed human IgG was calculated. The results are shown in Table 2. The immune complex hydrolysis activity of acidic protease was not affected by serum addition. On the other hand, the hydrolysis activity of trypsin was significantly decreased by the addition of serum.
【表】
試験例３ 甲状腺炎抑制作用
小谷ら（臨床免疫 ９巻、８号、635頁、1977
年）の方法に準じて行なつた。すなわち、１群
100匹のBUF／HDK雄性ラツト（６週令）の胸腺
を摘除し、２週間毎に１回、200radのＸ線照射を
４回くり返し、胸腺摘除14週後に、全屠殺した。
甲状腺を摘出してパラフイン包埋後、ヘマトキシ
リン−エオジン染色およびアザン染色を施し、そ
の単核球浸潤、小胞破壊、線維化の程度を指標に
して甲状腺炎の重症度を０から＋４に分類した。
なお、酸性プロテアーゼは１日１回静脈内に投与
し、対照には、プロテアーゼ活性を失活させた標
品を同様に投与した。結果を第３表に示す。
対照群に比し、酸性プロテアーゼ投与群におい
ては、用量依存的に、甲状腺炎の発症率が減少
し、重症度も軽減された。[Table] Test Example 3 Thyroiditis suppression effect Kotani et al. (Clinical Immunology Vol. 9, No. 8, p. 635, 1977)
It was carried out according to the method of 2010). That is, group 1
The thymuses of 100 BUF/HDK male rats (6 weeks old) were removed, X-ray irradiation at 200 rad was repeated 4 times once every 2 weeks, and all rats were sacrificed 14 weeks after thymectomy.
After removing the thyroid gland and embedding it in paraffin, it was stained with hematoxylin-eosin and Azan staining, and the severity of thyroiditis was classified from 0 to +4 based on the degree of mononuclear cell infiltration, vesicular destruction, and fibrosis. .
Note that acidic protease was administered intravenously once a day, and as a control, a preparation in which protease activity had been inactivated was administered in the same manner. The results are shown in Table 3. Compared to the control group, the incidence and severity of thyroiditis was reduced in a dose-dependent manner in the acid protease administration group.
【表】
試験例４ 免疫複合体腎炎抑制作用
１群10匹のC57BL系雄性マウスに、ヒトIgG−
抗ヒトIgG抗体（家兎）複合体200mg／Kgを１日
３回８時間毎に３日間静注した。４日目に屠殺し
て、腎を摘出し、糸球体への免疫複合体（I.C.）
の沈着をフルオレツセン イソチオシアネート
（FITC）標識した抗家兎IgG抗体（ヤギ）を用い
た螢光抗体法により観察した。さらに血清中の免
疫複合体をClqバインデイングアツセイ法（Clq
binding assay法）を用い測定した。屠殺前に尿
を採取できた34例については、尿蛋白測定試験紙
を用い、尿蛋白量を測定した。なお酸性プロテア
ーゼは１日３回、免疫複合体注入直後に静注し、
対照には失活させた酸性プロテアーゼを同様に静
注した。結果を第４表に示す。
血中免疫複合体、蛋白尿、糸球体へのI.C.沈着
いずれもが酸性プロテアーゼ投与により抑制され
た。[Table] Test Example 4 Immune complex nephritis suppressive effect Human IgG-
Anti-human IgG antibody (rabbit) complex 200 mg/Kg was intravenously injected every 8 hours three times a day for 3 days. On the 4th day, sacrifice the kidney, remove the kidney, and transfer immune complexes (IC) to the glomerulus.
The deposition was observed by fluorescent antibody method using anti-rabbit IgG antibody (goat) labeled with fluorescein isothiocyanate (FITC). Furthermore, immune complexes in serum were analyzed using Clq binding assay (Clq
binding assay method). For the 34 animals for which urine could be collected before slaughter, the amount of urinary protein was measured using urine protein measurement test strips. Acid protease was injected intravenously three times a day immediately after injection of the immune complex.
As a control, inactivated acidic protease was similarly injected intravenously. The results are shown in Table 4. Blood immune complexes, proteinuria, and IC deposition in glomeruli were all suppressed by acid protease administration.
【表】
テアーゼ
0.3mg〓Kg 128±9 5〓7 8〓10
1.0mg〓Kg 88±12＊＊ 4〓10 5〓10＊
3.0mg〓Kg 53±7＊＊ 3〓9＊ 2〓10＊
＊
[Table] Tease
0.3mg〓Kg 128±9 5〓7 8〓10
1.0mg〓Kg 88±12 ＊＊ 4〓10 5〓10 ＊
3.0mg〓Kg 53±7 ＊＊ 3〓9 ＊ 2〓10 ＊
*