【発明の詳細な説明】[Detailed description of the invention]
この発明は新規な薬理活性物質、フオリアスポ
ンジンに関するものである。
この発明者等は海産物から新しい薬理活性物質
の探索研究中、沖縄産海綿から肉芽組織増殖抑制
作用を有する新規な物質を単離することに成功
し、さらに研究を進めた結果この発明を完成し
た。
この発明のフオリアスポンジンは次のような平
面化学構造を有する。
この発明のフオリアスポンジンは例えば沖縄産
海綿〔phyllospongia foliascence（pallas）〕か
ら抽出により製造することができる。沖縄産海綿
からのフオリアスポンジンの製造は、例えば沖縄
産海綿を有機溶媒例えば、メタノール、エタノー
ル、ｎ−プロパノール、ｎ−ブタノール等のアル
コール、アセトン、ピリジン、酢酸エチルまたは
これらの混液またはこれらの有機溶媒と水との混
合溶媒で抽出し、得られた抽出液から単離、採取
することにより得ることができる。
抽出液からフオリアスポンジンを単離するため
には、一般に天然物の単離に用いられる公知の手
段が適用される。すなわち、まず、抽出液を濃縮
し、得られた濃縮液を用いて、２種液相間におけ
る分配の差、種々の吸着剤に対する吸着親和力の
差および適当な溶媒に対する溶解性および析出速
度の差等を利用して、目的とする有効成分フオリ
アスポンジンを単離し、精製し、さらに適当な溶
媒を用いて結晶化することによりフオリアスポン
ジンの結晶が得られる。
このようにして得られたフオリアスポンジンの
理化学的性質は次の通りである。
(1) 元素分析（％）
Ｃ：69.94、Ｈ：9.65
(2) 分子式
C32H52O6
(3) 融点
186−189℃
(4) 比旋光度
〔α〕１５ Ｄ＋44゜（クロロホルム、Ｃ＝0.17）
(5) 紫外線吸収スペクトル
210nｍより長波長には吸収を示さない。
(6) 赤外線吸収スペクトル
νＫＢｒ ｎａｘ（cm-1）：3430、2940（肩）、2910、
2860
（肩）、1710、1455、1385、1275、1245、
1180、1100、1058、970
(7) 溶剤に対する溶解性
クロロホルム、アセトン、ピリジンに溶け
る。
メタノール、エタノールに溶けにくい。
水に溶けない。
(8) 塩基性、酸性、中性の区別
中性
(9) 円偏光二色性（メタノール、Ｃ＝0.264）
〔θ〕3300、〔θ〕286＋19000（極大）、
〔θ〕232＋500（極少）、
〔θ〕206＋7000（末端）
(10) 1H−核磁気共鳴吸収スペクトル
溶媒：CDCl3・δ（ppm）：0.83（ブロード
ｓ）、2.18（3H、ｓ）、2.40（2H、ｄ、Ｊ＝
６Hz）、2.93（1H、ｄ、Ｊ＝12Hz）、3.27
（1H、ｄ、ｄ、Ｊ＝3.12Hz）、3.79（2H、
ｍ）、5.63（1H、ｍ）、9.90（1H、ブロード
ｓ）
(11) 13C−核磁気共鳴吸収スペクトル
溶媒：CDCl3・δ（ppm）：8.6、9.9、10.1、
17.0、17.1、18.0、18.3、24.5、25.4、27.5、
28.5、28.9、29.7、36.1、36.6、36.9、37.5、
40.2、41.7、45.5、50.0、50.5、51.5、58.2、
58.5、58.7、68.9、69.7、79.7、171.9、
204.1、208.6
(12) 質量分析ｍ／ｚ（％）
533（0.8） M+＋１
514(5) M+−H2O
503（1.2） M+−CHO
485(3) 503−H2O
289（100）
上記理化学的性質および下記フオリアスポンジ
ンのアセチル化物、熱分解物、水素化アルミニウ
ムリチウム処理物等の理化学的性質から、フオリ
アスポンジンの平面化学構造式は次のように同定
された。
次に、フオリアスポンジンのアセチル化物、熱
分解物および水素化アルミニウムリチウム処理物
についてそれらの製造法を示す。
製造例 １
フオリアスポンジンのアセチル化物
フオリアスポンジン（50mg）のピリジン（１
ml）溶液に無水酢酸（１ml）を加え、室温（20
℃）で２日間放置する。反応液を氷水中（20ml）
にあけ、酢酸エチル（15ml）で３回抽出する。酢
酸エチル層を希塩酸、飽和炭酸水素ナトリウム液
および飽和塩化ナトリウム水溶液でそれぞれ洗浄
した後、硫酸マグネシウムで乾燥する。酢酸エチ
ルを減圧下に留去して残渣60mgを得る。シリカゲ
ルカラムクロマトで精製してフオリアスポンジン
のアセチル化物（30mg）を得る。
(1) 元素分析（％）
Ｃ：69.69、Ｈ：9.39
(2) 分子式
C36H56O8
(3) 融点
175−176℃
(4) 比旋光度
〔α〕１５ Ｄ＋45゜（クロロホルム、Ｃ＝0.16）
(5) 赤外線吸収スペクトル
νＣＣｌ４ ｎａｘ（cm-1）：2940（肩）、2910、2830
（肩）、
1740、1720、1450、1360、1235、1040、1010
(6) 溶剤に対する溶解性
クロロホルム、アセトン、ピリジンに溶け
る、メタノール、エタノールに溶けにくい、
水に溶けない。
(7) 1H−核磁気共鳴吸収スペクトル
溶媒｛CDCl3、δ（ppm）：0.82（ｓ）、0.90
（3H、ｓ）、0.96（3H、ｓ）、1.98および2.01
（3H、ｓ）、2.08（3H、ｓ）、2.49（2H、ｄ、
Ｊ＝６Hz）、2.95（1H、ｄ、Ｊ＝12Hz）、3.24
（1H、ｄ、ｄ、Ｊ＝3.12Hz）、4.89（1H、
ｄ、ｄ、Ｊ＝4.11Hz）、5.10（1H、ｑ、Ｊ＝
６Hz）、5.65（1H、ｍ）、9.63（1H、ブロー
ド ｓ）
(8) 13C−核磁気共鳴吸収スペクトル
溶媒：CDCl3、δ（ppm）：8.7、9.4、10.9、
17.1、18.2、21.1、21.5、23.3、24.5、25.1、
27.0、28.1、28.5、36.2、36.6、37.0、37.6、
38.7、40.1、41.7、43.8、50.7、52.5、57.0、
58.3、58.6、69.0、71.4、82.1、169.7、
170.2、202.1、206.1
(9) 質量分析ｍ／ｚ（％）
617（0.2） M+＋１
587（0.3） M+−CHO
556（0.9） M+−CH3COOH
527（1.2） 587−CH3COOH
496（1.6） 556−CH3COOH
326（100）
製造例 ２
フオリアスポンジンの熱分解物
フオリアスポンジン（10mg）を窒素圧下、240
℃で２分間加熱する。反応生成物をシリカゲルカ
ラムクロマトにかけ、ベンゼン：アセトン（50：
１）に溶出して、フオリアスポンジンの熱分解物
（２mg）を得る。
(1) 分子量
396.302（ハイマス）
(2) 融点
157−159℃
(3) 比旋光度
〔α〕１８ Ｄ−120゜（メタノール、Ｃ＝0.1）
(4) 紫外線吸収スペクトル
λＭｅＯＨ ＭａＸ：223nｍ（ε＝8500）、230nｍ（ε
＝
9900）、240nｍ（ε＝11000）
(5) 質量分析ｍ／ｚ（％）
396（57） M+
378（21） M+−H2O
205（21）
159（38）
148（43）
147（100）
146（50）
製造例 ３
水素化リチウムアルミニウム処理物
フオリアスポンジン（３mg）のドライエーテル
（４ml）溶液に水素化リチウムアルミニウム（25
mg）を加え、５時間撹拌しながら加熱還流する。
反応液に水飽和酢酸エチル（５ml）を加え、上澄
液を取る。溶液を濃縮し、薄層クロマトグラフイ
ー、ガスクロマトグラフイーおよびガスクロマト
ー質量分析を行つた。
(1) 薄層クロマトグラフイー
担体：キーゼルゲル60F254 展 開 溶 媒
Rf値
クロロホルム：酢酸エチル（１：２） 0.25
ベンゼン：アセトン（２：１） 0.25
(2) ガスクロマトグラフイー
(i) 担体：15％ポリエチレングリコール サク
シネート クロモソーブＷ（AW）
カラム：３mm×２ｍ
カラム温度：160℃、挿入温度：190℃
窒素ガス：30ml／分
保持時間：４分12秒
(ii) 担体：15％ネオペンチルグリコール サク
シネート クロモソブＷ（AW）
カラム：３mm×２ｍ
カラム温度：150℃、挿入温度：190℃
窒素ガス：30ml／分
保持時間：７分24秒
(3) ガスクロマトー質量分析ｍ／ｚ（％）
105(2) M+＋１
86（45） M+−H2O
75（98） M+−C2H5
59（58）
58（88）
57（100）75−H2O
45（71）
次にこの発明のフオリアスポンジンの薬理試験
結果を示す。
肉芽組織増殖抑制作用
方法：ダブコツク種の受精卵を38℃で９日間孵
卵し、10日目にダルシー（Ｄ’arcy）らの方法
〔Ｄ’arcy、P.E.et al、British Journal of
Pharmaceutical Chemotherapy 29、378
（1967）〕に準じ、卵殻および卵殻膜を切除し、漿
尿膜上に直径９mmの紙デイスクを静置した。次
いで開殻部分をセロテープで閉じ、さらに４日間
孵卵した後、紙デイスクに沿つて漿尿膜を切り
取り、60℃で12時間乾燥した。これを精秤し、
紙デイスク重量を差引いて肉芽重量とし、対照群
に対する薬剤投与群の抑制率および統計的有意性
をもつてその効果を判定した。液体は有機溶媒に
溶解し、紙デイスク１枚当り20μ含浸させ、
さらにその溶媒を減圧除去して用いる。
This invention relates to a novel pharmacologically active substance, fluoriaspondin. During their search for new pharmacologically active substances from marine products, the inventors succeeded in isolating a new substance from Okinawan sponges that has an inhibitory effect on granulation tissue proliferation, and as a result of further research, they completed this invention. . The fluoriaspondin of this invention has the following planar chemical structure. The phyllospondin of the present invention can be produced, for example, by extraction from Okinawan sponges [phyllospongia foliascence (pallas)]. For the production of fluoriaspondin from Okinawan sponges, for example, Okinawan sponges are mixed with organic solvents such as alcohols such as methanol, ethanol, n-propanol, and n-butanol, acetone, pyridine, ethyl acetate, or mixtures thereof. It can be obtained by extraction with a mixed solvent of an organic solvent and water, and isolation and collection from the resulting extract. In order to isolate fluoriaspondin from the extract, known means generally used for isolating natural products are applied. That is, first, the extract is concentrated, and the resulting concentrated liquid is used to determine the difference in distribution between the two liquid phases, the difference in adsorption affinity to various adsorbents, and the difference in solubility and precipitation rate in appropriate solvents. The desired active ingredient, fluoriaspondin, is isolated using a method such as the following, purified, and further crystallized using a suitable solvent to obtain crystals of fluoriaspondin. The physicochemical properties of the thus obtained fluoriaspondin are as follows. (1) Elemental analysis (%) C: 69.94, H: 9.65 (2) Molecular formula C 32 H 52 O 6 (3) Melting point 186-189℃ (4) Specific optical rotation [α] 15 D +44° (chloroform, C =0.17) (5) Ultraviolet absorption spectrum It shows no absorption at wavelengths longer than 210nm. (6) Infrared absorption spectrum ν KBr nax (cm -1 ): 3430, 2940 (shoulder), 2910,
2860
(shoulder), 1710, 1455, 1385, 1275, 1245,
1180, 1100, 1058, 970 (7) Solubility in solvents Soluble in chloroform, acetone, and pyridine. Hardly soluble in methanol and ethanol. Not soluble in water. (8) Distinction between basic, acidic, and neutral Neutral (9) Circular dichroism (methanol, C=0.264) [θ] 330 0, [θ] 286 +19000 (maximum), [θ] 232 +500 ( (minimal), [θ] 206 +7000 (terminal) (10) 1 H-nuclear magnetic resonance absorption spectrum Solvent: CDCl 3・δ (ppm): 0.83 (broad)
s), 2.18 (3H, s), 2.40 (2H, d, J=
6Hz), 2.93 (1H, d, J=12Hz), 3.27
(1H, d, d, J = 3.12Hz), 3.79 (2H,
m), 5.63 (1H, m), 9.90 (1H, broad s) (11) 13 C-nuclear magnetic resonance absorption spectrum Solvent: CDCl 3・δ (ppm): 8.6, 9.9, 10.1,
17.0, 17.1, 18.0, 18.3, 24.5, 25.4, 27.5,
28.5, 28.9, 29.7, 36.1, 36.6, 36.9, 37.5,
40.2, 41.7, 45.5, 50.0, 50.5, 51.5, 58.2,
58.5, 58.7, 68.9, 69.7, 79.7, 171.9,
204.1, 208.6 (12) Mass spectrometry m/z (%) 533 (0.8) M + +1 514(5) M + −H 2 O 503 (1.2) M + −CHO 485(3) 503−H 2 O 289 ( 100) From the above physical and chemical properties and the physical and chemical properties of the acetylated product, thermal decomposition product, and lithium aluminum hydride treated product of fluoria spondin, the planar chemical structural formula of fluoria spondin was identified as follows. . Next, a method for producing an acetylated product, a thermally decomposed product, and a lithium aluminum hydride treated product of fluoriaspondin will be described. Production example 1 Acetylated product of fluoriaspondin Pyridine (1
Add acetic anhydride (1 ml) to the solution (1 ml) and cool at room temperature (20
℃) for 2 days. Place the reaction solution in ice water (20ml)
Pour into a bowl and extract three times with ethyl acetate (15 ml). The ethyl acetate layer is washed with dilute hydrochloric acid, saturated sodium bicarbonate solution and saturated sodium chloride aqueous solution, respectively, and then dried over magnesium sulfate. Ethyl acetate is distilled off under reduced pressure to obtain 60 mg of residue. Purify with silica gel column chromatography to obtain acetylated product of fluoriaspondin (30 mg). (1) Elemental analysis (%) C: 69.69, H: 9.39 (2) Molecular formula C 36 H 56 O 8 (3) Melting point 175-176℃ (4) Specific optical rotation [α] 15 D +45° (chloroform, C =0.16) (5) Infrared absorption spectrum ν CCl4 nax (cm -1 ): 2940 (shoulder), 2910, 2830
(shoulder),
1740, 1720, 1450, 1360, 1235, 1040, 1010 (6) Solubility in solvents Soluble in chloroform, acetone, and pyridine, poorly soluble in methanol and ethanol, insoluble in water. (7) 1 H-nuclear magnetic resonance absorption spectrum Solvent {CDCl 3 , δ (ppm): 0.82 (s), 0.90
(3H, s), 0.96 (3H, s), 1.98 and 2.01
(3H, s), 2.08 (3H, s), 2.49 (2H, d,
J=6Hz), 2.95 (1H, d, J=12Hz), 3.24
(1H, d, d, J = 3.12Hz), 4.89 (1H,
d, d, J = 4.11Hz), 5.10 (1H, q, J =
6Hz), 5.65 (1H, m), 9.63 (1H, broad s) (8) 13 C-nuclear magnetic resonance absorption spectrum Solvent: CDCl 3 , δ (ppm): 8.7, 9.4, 10.9,
17.1, 18.2, 21.1, 21.5, 23.3, 24.5, 25.1,
27.0, 28.1, 28.5, 36.2, 36.6, 37.0, 37.6,
38.7, 40.1, 41.7, 43.8, 50.7, 52.5, 57.0,
58.3, 58.6, 69.0, 71.4, 82.1, 169.7,
170.2, 202.1, 206.1 (9) Mass spectrometry m/z (%) 617 (0.2) M + +1 587 (0.3) M + −CHO 556 (0.9) M + −CH 3 COOH 527 (1.2) 587−CH 3 COOH 496 (1.6) 556−CH 3 COOH 326 (100) Production example 2 Thermal decomposition product of fluoria spondin Fluoria spondin (10 mg) was dissolved under nitrogen pressure at 240
Heat at ℃ for 2 minutes. The reaction product was subjected to silica gel column chromatography and benzene:acetone (50:
1) to obtain a thermal decomposition product (2 mg) of fluoriaspondin. (1) Molecular weight 396.302 (high mass) (2) Melting point 157-159℃ (3) Specific rotation [α] 18 D -120゜ (methanol, C=0.1) (4) Ultraviolet absorption spectrum λ MeOH MaX : 223 nm (ε = 8500), 230nm (ε
=
9900), 240nm (ε=11000) (5) Mass spectrometry m/z (%) 396 (57) M + 378 (21) M + −H 2 O 205 (21) 159 (38) 148 (43) 147 ( 100) 146 (50) Production example 3 Lithium aluminum hydride treated product Lithium aluminum hydride (25
mg) and heated to reflux while stirring for 5 hours.
Add water-saturated ethyl acetate (5 ml) to the reaction solution and remove the supernatant. The solution was concentrated and subjected to thin layer chromatography, gas chromatography, and gas chromatography mass spectrometry. (1) Thin layer chromatography carrier: Kieselgel 60F 254 Development Solvent Rf value Chloroform: Ethyl acetate (1:2) 0.25 Benzene: Acetone (2:1) 0.25 (2) Gas chromatography (i) Carrier: 15 % polyethylene glycol succinate Cromosorb W (AW) Column: 3 mm x 2 m Column temperature: 160°C, insertion temperature: 190°C Nitrogen gas: 30 ml/min Retention time: 4 minutes 12 seconds (ii) Support: 15% neopentyl glycol succinate Cromosorb W (AW) column: 3mm x 2m Column temperature: 150℃, insertion temperature: 190℃ Nitrogen gas: 30ml/min Retention time: 7 minutes 24 seconds (3) Gas chromatograph mass spectrometry m/z (%) 105 (2) M + +1 86 (45) M + −H 2 O 75 (98) M + −C 2 H 5 59 (58) 58 (88) 57 (100) 75−H 2 O 45 (71) Next, the present invention The results of pharmacological tests on fluoriaspondin are shown. Inhibitory effect on granulation tissue proliferation Method: Fertilized eggs of the Dabkotsuku variety were incubated at 38°C for 9 days, and on the 10th day, the method of D'arcy et al. [D'arcy, PEet al, British Journal of
Pharmaceutical Chemotherapy 29, 378
(1967)], the eggshell and eggshell membrane were excised, and a paper disk with a diameter of 9 mm was placed on the chorioallantoic membrane. The open shell part was then closed with cellophane tape, and after incubation for an additional 4 days, the chorioallantoic membrane was cut out along the paper disk and dried at 60°C for 12 hours. Weigh this accurately,
The paper disk weight was subtracted to obtain the granulation weight, and the effect was determined based on the inhibition rate and statistical significance of the drug administration group relative to the control group. The liquid is dissolved in an organic solvent and impregnated with 20μ per paper disk.
Furthermore, the solvent is removed under reduced pressure before use.
【表】
次にこの発明の実施例を示す。
実施例
沖縄産海綿〔phyllospongia foliascens
（pallas）〕15Kgをメタノール（36）中で粉砕
し、一夜放置後過する。残渣をさらに熱メタノ
ール（20）で２回抽出し、前記液と合わせ50
℃以下濃縮する。得られた濃縮液（650ｇ）を水
（３）にけん濁させ、酢酸エチル（２）で２
回抽出する。酢酸エチル層を減圧下で濃縮して酢
酸エチル可溶部（73ｇ）を得る。酢酸エチル可溶
部（73ｇ）をシリカゲルのカラム（６×60cm）に
付し、ベンゼン：酢酸エチル（５：１）の混液で
溶出した後ベンゼン：酢酸エチル（４：１）で溶
出し、目的物質を含む画分を集め減圧濃縮する。
得られた濃縮液（2.4ｇ）をさらにシリカゲル
のカラムに付し、ベンゼン：酢酸エチル（５：
１）で溶出し、目的物質を含む画分を集める。溶
出液をさらにシリカゲルカラムに付しクロロホル
ム：メタノール（100：１）の混液で溶出し、目
的物質を含む画分を集める。溶出液をさらにシリ
カゲルカラムに付し、ベンゼン：酢酸エチル
（５：１）で溶出した後、目的物質を画分を集
め、さらにシリカゲルカラムに付しベンゼン：酢
酸エチル（３：１）で溶出し、目的物質を含む画
分を集め濃縮してフオリオスポンジンの粗結晶
100mgを得た。この粗結晶をメタノールから再結
晶すると無色羽毛状結晶60mgを得た。[Table] Next, examples of the present invention are shown. Example Okinawan sponge [phyllospongia foliascens]
(pallas)] 15Kg was ground in methanol (36), left overnight, and then filtered. The residue was further extracted twice with hot methanol (20) and combined with the above solution at 50
Concentrate below ℃. The obtained concentrate (650g) was suspended in water (3) and diluted with ethyl acetate (2).
Extract times. The ethyl acetate layer was concentrated under reduced pressure to obtain an ethyl acetate soluble portion (73 g). The ethyl acetate soluble portion (73 g) was applied to a silica gel column (6 x 60 cm) and eluted with a mixture of benzene: ethyl acetate (5:1) and then with benzene: ethyl acetate (4:1). Fractions containing the substance are collected and concentrated under reduced pressure. The obtained concentrate (2.4 g) was further applied to a silica gel column, and benzene:ethyl acetate (5:
Elute in step 1) and collect the fractions containing the target substance. The eluate is further applied to a silica gel column, eluted with a mixture of chloroform and methanol (100:1), and fractions containing the target substance are collected. The eluate was further applied to a silica gel column and eluted with benzene:ethyl acetate (5:1).The target substance was collected in fractions, and further applied to a silica gel column and eluted with benzene:ethyl acetate (3:1). , collect and concentrate fractions containing the target substance to obtain crude crystals of phooliospondin.
Got 100mg. The crude crystals were recrystallized from methanol to obtain 60 mg of colorless feather-like crystals.