【発明の詳細な説明】[Detailed description of the invention]
本発明は口臭検出剤に関し、詳しくは口臭の原
因たる唾液中の―SH基を含有する物質に作用し
て変色する物質を含有する口臭検出剤に関する。
一般に口臭は、内臓疾患による特殊なものを除
き、口腔内蛋白質の腐敗によつて産生される不快
臭を有する分子から構成されていると考えられて
いる。即ち口腔内には、食品蛋白質、剥離上皮、
滲出液中の血球成分、歯周組織の細胞等種々の蛋
白成分が存在する。これらの蛋白質は、口腔内細
菌に由来する蛋白分解酵素の作用により種々のア
ミノ酸に分解され、さらに脱炭酸酵素や脱アミノ
酵素の作用によりアミンやアンモニアに分解され
る。また含硫アミノ酸からは硫化水素やメチルメ
ルカプタンが産生される。
近年、特に口臭と硫化物との関係が注目されて
おり、硫黄化合物を選択的かつ高感度で検出する
炎光光度検出器（以下FPDと略称する）を用い
た口腔内揮発性硫化物（以下VSCと略称する）
の分析から、口臭とVSCとの間の密接な関係が
多数報告されている。即ち、官能評価により口臭
を有すると判定される被検者の口腔内気体から、
高濃度のVSCが検出され、その閾濃度や嫌悪性
などからメチルメルカプタンが口臭の強さと最も
密接な相関を示すことが確認されている。
またこれらVSCの発生機序についても検討が
加えられており、VSCの産生は、全唾液中の白
血球や剥離上皮細胞などの細胞成分の崩壊によつ
てジスルフイドが遊離し、さらにチオールに還元
され、しかる後、VSCが産生されると考えられ
ている。
一方、口臭の検出・評価法としては、人の嗅覚
による官能評価法やFPDによりVSC量を測定す
るガスクロマトグラフ法が従来から行なわれてい
る。臨床においては主に官能評価法が行なわれて
おり、事実、人の嗅覚は如何なる分析機器よりも
その検知能力においてすぐれていると言われ、に
おいの相乗・相殺作用や嫌悪性を加味した総合的
判断が可能である。
しかしながら嗅覚は疲労しやすい上に個人によ
りその鋭敏度に大きな差があること、また口腔以
外の因子（例えば食事等）により影響を受けやす
いなどの欠点が見られることから、嗅覚による方
法では、口臭の強さを客観的定量的に評価するこ
とは困難であり、また口臭を有するものはそれと
同じ口臭を評価できないという欠点がある。また
FPDによるガスクロマトグラフ法では客観的評
価が可能であるが、特殊な分析機器を必要とする
こと、唾液を用いる場合にはインキユベート（一
定期間保温すること）する必要があり時間がかか
ること、実験操作が煩雑である等の問題がある。
従つて現在のところは簡便でかつ客観的な口臭の
評価方法はないと言える。
本発明者らは、かかる現状において、簡便かつ
客観的に口臭を検出・評価できる方法を開発すべ
く鋭意研究を行つた結果、唾液中のVSCまた
は（および）その前駆体であるチオール類を測定
すると、その測定の結果は官能評価あるいはガス
クロマトグラフ法で測定される口臭と極めてよい
相関性を示すこと、当該VSCおよびチオール
類は、次式（）、
で表わされる５，5′―ジチオビス（２―ニトロ安
息香酸）（以下DTNBと略称する）を検出剤とし
て使用し、その変化をみることによつて測定でき
ることを見出し、本発明を完成した。
すなわち、本発明はDTNBを含有する口臭検出
剤を提供するものである。
本発明の原理は、次の反応式に従い、DTNB
が、アルカリ性溶液中で―SH基を有する化合物
と容易に交換反応を起こし変色することを利用し
たものである。
本反応の結果生成するチオニトロフエノレート
アニオン（）は、412nmに極大吸収を持ち、黄
色を呈する。
本発明の口臭検出剤は常法によりDTNBを水又
は水溶性有機溶媒（メタノール、エタノール等）
と水の混合溶液に溶解させることにより調製され
る。
得られた口臭検出剤は、緩衝液等を使用してそ
のPHを中性〜弱アルカリ性（PH7.0〜9.0）、好ま
しくはPH7.5〜8.0にして置くのが良く、またその
DTNBの濃度には特に制限はないが、１〜
10mM／とするのが適当である。
次に、本発明の口臭検出剤を使用し、口臭を測
定する方法の一例を挙げ説明する。
まず口臭検出剤と唾液とを直接には接触しない
が、唾液から発生する気体は口臭検出剤に接触す
るようにした密封容器（例えば第５図に示すよう
なコンウエイ皿等）に入れ、一定時間約37℃でイ
ンキユベート（保温）する。次いで口臭検出剤の
変色を肉眼で観察するか（定性検出）、または吸
光光度計を用いて定量し（定量検出）、口臭を検
出、測定する。本測定方法は、インキユベートに
より、唾液中に含まれる硫化水素やメチルメルカ
プタン等の―SH基を有する揮発性硫化物が密封
容器内に揮散してDTNBと反応し変色することを
利用するものである。
本発明によれば、個人差の大きな官能評価に頼
ることなく、またFPDのような特殊な機器を使
用する必要もないので、極めて操作が簡便であ
り、一度に多数の試料を分析できる。一方でガス
クロマトグラフ法のように硫化水素とメチルメル
カプタン等を別々に検出することはできないが、
生化学的研究を目的とするものでなく、口臭の有
無を検出するには何ら支障はない。
以下に実施例をもつて本発明を説明するが、本
発明はこれらに限定されるものではない。
実施例 １
＜検量線の作製＞
第５図に示すコンウエイ皿（Conway dish、紫
田科学器械工業株式会社製微量検測器）の中央２
にDTNBの4mMを含む50ｍＭリン酸カリウム緩
衝液（PH7.5）溶液１mlを添加し、外側３にメチ
ルメルカプタン（ベンゼン溶液）１〜４μｇを添
加した後ふた１で密閉し、室温で30分間放置し
た。放置後DTNB溶液の波長412nmにおける吸光
度を測定して検量線を作製したところ、第１図に
示す通りの直線性の良好なものが得られた。
＜ヒト唾液の評価＞
メチルメルカプタン溶液の代りに人の唾液を用
い、コンウエイ皿の外側３に一定量の全唾液（唾
液そのまま）を添加し、37℃で一定時間インキユ
ベートした後、室温に戻し、DTNB溶液の波長
412nmの吸光度を測定した。第２図は、人の唾液
500μからのVSCの経時的産生を調べたもので
ある。この場合には、VSC量は30時間まで経時
的に増加していた。この結果から、一般に人の唾
液中のVSCを検出する場合には、20時間前後が
適当と考えられる。
＜官能評価法と本発明との相関＞
本発明が口臭の検出剤として有効であることを
確認するため、被検者15人の起床時の唾液と呼気
を採取し、それぞれ本発明を用いる方法と下記基
準による官能評価法で評価し、その相関を検討し
た。結果は第３図に示す通りで、相関係数γ＝
0.6423（ｎ＝15）で有意の（危険率２％未満）相
関を示した。このことは、本発明品が口臭検出剤
として十分有用であることを示している。
The present invention relates to a halitosis detecting agent, and more particularly to a halitosis detecting agent containing a substance that changes color by acting on a substance containing an --SH group in saliva, which is the cause of bad breath. Generally, bad breath is considered to be composed of molecules having an unpleasant odor produced by the decay of proteins in the oral cavity, except for special cases caused by internal diseases. In other words, the oral cavity contains food proteins, exfoliated epithelium,
Various protein components such as blood cell components and periodontal tissue cells are present in the exudate. These proteins are decomposed into various amino acids by the action of proteolytic enzymes derived from oral bacteria, and further into amines and ammonia by the action of decarboxylases and deaminases. Hydrogen sulfide and methyl mercaptan are also produced from sulfur-containing amino acids. In recent years, the relationship between bad breath and sulfides has attracted particular attention, and oral volatile sulfides (hereinafter referred to as FPD) have been investigated using a flame photometric detector (hereinafter referred to as FPD) that selectively and highly sensitively detects sulfur compounds. (abbreviated as VSC)
A number of analyzes have reported a close relationship between halitosis and VSC. That is, from the oral gas of a subject who is determined to have bad breath by sensory evaluation,
High concentrations of VSC have been detected, and it has been confirmed that methyl mercaptan shows the closest correlation with the intensity of bad breath based on its threshold concentration and aversive properties. The mechanism of development of VSCs has also been investigated. The production of VSCs is caused by the release of disulfides by the breakdown of cellular components such as leukocytes and exfoliated epithelial cells in whole saliva, which are further reduced to thiols. It is believed that VSCs are then produced. On the other hand, conventional methods for detecting and evaluating bad breath include a sensory evaluation method using the human sense of smell and a gas chromatography method that measures the amount of VSC using an FPD. In clinical practice, sensory evaluation methods are mainly used, and in fact, it is said that the human sense of smell is superior in its detection ability to any analytical equipment. Judgment is possible. However, the sense of smell is easily fatigued, its sensitivity varies greatly from person to person, and it is easily influenced by factors other than the oral cavity (e.g., diet). It is difficult to objectively and quantitatively evaluate the strength of bad breath, and there is also a drawback that those who have bad breath cannot evaluate the same bad breath. Also
Although objective evaluation is possible using gas chromatography using FPD, it requires special analytical equipment, requires incubation (keeping warm for a certain period of time) when saliva is used, and takes time, and experimental operations. There are problems such as being complicated.
Therefore, it can be said that there is currently no simple and objective method for evaluating halitosis. Under the current circumstances, the present inventors conducted intensive research to develop a method that can easily and objectively detect and evaluate bad breath. As a result, the inventors measured VSC or (and) thiols, which are its precursors, in saliva. Then, the measurement results show an extremely good correlation with the halitosis measured by sensory evaluation or gas chromatography, and the VSC and thiols are expressed by the following formula (), The present invention was completed based on the discovery that measurement can be performed by using 5,5'-dithiobis(2-nitrobenzoic acid) (hereinafter abbreviated as DTNB) represented by the following as a detection agent and observing the change. That is, the present invention provides a halitosis detection agent containing DTNB. The principle of the present invention is that according to the following reaction formula, DTNB
This method takes advantage of the fact that in an alkaline solution, it easily undergoes an exchange reaction with a compound containing a --SH group, resulting in a change in color. The thionitrophenolate anion () produced as a result of this reaction has a maximum absorption at 412 nm and is yellow in color. The halitosis detecting agent of the present invention is prepared by converting DTNB into water or a water-soluble organic solvent (methanol, ethanol, etc.) using a conventional method.
It is prepared by dissolving it in a mixed solution of and water. It is best to adjust the pH of the obtained halitosis detection agent to neutral to slightly alkaline (PH7.0 to 9.0), preferably PH7.5 to 8.0, using a buffer solution, etc.
There is no particular limit to the concentration of DTNB, but 1 to
It is appropriate to set it at 10mM/. Next, an example of a method for measuring halitosis using the halitosis detecting agent of the present invention will be described. First, the halitosis detection agent and saliva are not in direct contact with each other, but the gas generated from the saliva is placed in a sealed container (for example, a Conway dish as shown in Figure 5), and the gas generated from the saliva is placed in a sealed container (such as a Conway dish as shown in Figure 5) for a certain period of time. Incubate (keep warm) at approximately 37℃. Next, the change in color of the halitosis detection agent is observed with the naked eye (qualitative detection) or quantitatively determined using an absorption photometer (quantitative detection) to detect and measure bad breath. This measurement method utilizes the fact that volatile sulfides containing -SH groups, such as hydrogen sulfide and methyl mercaptan contained in saliva, evaporate into a sealed container and react with DTNB, resulting in discoloration. . According to the present invention, there is no need to rely on sensory evaluation that has large individual differences, and there is no need to use special equipment such as an FPD, so the operation is extremely simple and a large number of samples can be analyzed at once. On the other hand, it is not possible to detect hydrogen sulfide and methyl mercaptan separately like gas chromatography, but
It is not intended for biochemical research, and there is no problem in detecting the presence or absence of bad breath. The present invention will be explained below with reference to Examples, but the present invention is not limited thereto. Example 1 <Preparation of calibration curve> Center 2 of the Conway dish (micrometer measuring instrument manufactured by Shida Kagaku Kikai Kogyo Co., Ltd.) shown in Fig. 5
Add 1ml of 50mM potassium phosphate buffer (PH7.5) solution containing 4mM of DTNB to the outside, add 1 to 4μg of methyl mercaptan (benzene solution) to the outside, then seal with lid 1 and leave at room temperature for 30 minutes. did. After standing, a calibration curve was prepared by measuring the absorbance of the DTNB solution at a wavelength of 412 nm, and a calibration curve with good linearity as shown in FIG. 1 was obtained. <Evaluation of human saliva> Using human saliva instead of the methyl mercaptan solution, a certain amount of whole saliva (saliva as it is) was added to the outside 3 of a Conway dish, incubated at 37°C for a certain period of time, and then returned to room temperature. Wavelength of DTNB solution
Absorbance at 412 nm was measured. Figure 2 shows human saliva
This study investigated the production of VSC from 500μ over time. In this case, the amount of VSC increased over time up to 30 hours. From this result, it is considered that approximately 20 hours is generally appropriate for detecting VSC in human saliva. <Correlation between the sensory evaluation method and the present invention> In order to confirm that the present invention is effective as a halitosis detection agent, saliva and exhaled breath of 15 subjects were collected upon waking, and the present invention was used in each case. The results were evaluated using a sensory evaluation method based on the following criteria, and the correlation was examined. The results are shown in Figure 3, where the correlation coefficient γ=
A significant correlation (less than 2% risk) was shown at 0.6423 (n=15). This indicates that the product of the present invention is sufficiently useful as a halitosis detection agent.
【表】【table】
【表】
＜ガスクロマトグラフ法と本発明との相関＞
従来よりVSCの検出に用いられているFPDを
使用してメチルメルカプタン量を測定するガスク
ロマトグラフ法と本発明との相関を、被検者15人
の唾液を採取してそれぞれ評価した。結果は第４
図に示す通りで、相関係数0.7528（ｎ＝15）で有
意（危険率１％未満）の相関が得られた。このこ
とは、本発明が口臭の検出においては、ガスクロ
マトグラフ法と同等に客観的であることを示して
いる。[Table] <Correlation between the gas chromatography method and the present invention> The correlation between the present invention and the gas chromatography method that measures the amount of methyl mercaptan using FPD, which has been conventionally used for the detection of VSC, was determined by subject 15. Human saliva was collected and evaluated. The result is the 4th
As shown in the figure, a significant correlation (risk rate of less than 1%) was obtained with a correlation coefficient of 0.7528 (n=15). This shows that the present invention is as objective as gas chromatography in detecting bad breath.
【図面の簡単な説明】[Brief explanation of the drawing]
第１図は検量線である。第２図はヒト唾液から
のVSC産生の経時変化を示す。第３図は官能評
価法と本発明との相関を示す。第４図はガスクロ
マトグラフ法と本発明との相関を示す。第５図は
実施例で使用したコンウエイ皿の断面説明図を示
す。
１……ふた、２……中央、３……外側、４……
仕切り。
Figure 1 is a calibration curve. Figure 2 shows the time course of VSC production from human saliva. FIG. 3 shows the correlation between the sensory evaluation method and the present invention. FIG. 4 shows the correlation between gas chromatography and the present invention. FIG. 5 shows a cross-sectional explanatory view of the Conway dish used in the example. 1...Lid, 2...Center, 3...Outside, 4...
partition.