JPS629311B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は培養生細胞標本から細胞を生きたまゝ
極めて短時間のうちに特殊技能を要することなく
適確に算出し得る装置に関する。この算定値は従
来の人為的な細胞数算出値より変動係数が小さく
て精度が高いものである。本発明装置によれば細
胞数のみならず細胞の形態認識迄も可能となる。 生体用修復材料及び多相系生医学材料の毒性や
組織接着性など生物学的性状に関する評価性の確
立が各方面で急がれており、その基礎となる組織
培養法にも迅速性及び高確度が要求されてきてい
る。 組織培養法は各種の生細胞を培養する傍ら上記
異物材料の生体組織に与える為害性を検査するも
のであり、異物によつて生細胞がどれ位死滅した
或はどのような細胞挙動を経て死滅もしくは異常
な活動に追い込むかなどを究明するものである
が、これ迄の組織培養法は次の理由で迅速性及び
精度に於て必ずしも十分ではなかつた。すなわ
ち、一般に実施されている核数計算法（以下NC
法とする）では培養生細胞に異物を混入して所定
の日数期間毎に標本を取り出して細胞核数を算定
する方法であるが、検査時に生細胞に細胞死滅固
定剤を含む染色剤を加えて殺して細胞活動を固定
した状態で標本を計算皿上に展延して単位体積当
りの核数を読出すものであつて一組の標本に最低
３本の試験管を組対させ対照標本（異物のないも
の）も同様３本１組とし、このような組を各日数
期間毎に多数備えねばならないので、先づ実験系
が大がかりとなること、次に計算皿上で核を算出
する場合、実際の核とゴミ、チリ、細菌等の異物
との判断がむづかしく相当な熟練が要ること、標
本の染色固定から計算皿に至る間の工程が多くな
るので人為的誤差が累積されてマスとしてはその
誤差が無視出来ない程に達すること………等が問
題点として挙げられる。 本発明は上述に鑑みてなされたもので、(a)実験
系の簡略化、(b)算定スピード迅速化、(c)人為的誤
差の排除、(d)特殊技能の撤廃、(e)情報の画像処理
………等を図つたものであり、以下に望ましい実
施例を図に採つて詳細に説明するに、図に於て第
１図は本発明装置のフローチヤート、第２図は画
像解析の原理を示す波形図、第３図は顕微鏡のセ
ルフフオーカス機構の原理説明図である。 本発明は第１図の如く、培養中の生細胞標本１
と、この標本１を接写する倒立位相差顕微鏡２
と、この顕微鏡２を通して上記生細胞標本１の顕
微鏡像を撮像するTVカメラ３と、得られた映像
信号を画像走査して画像中の生細胞の光学的濃度
により生細胞を判定し、その数を算出する画像解
析装置４と、この装置４からのデジタル解析信号
を情報処理するコンピユータ６とより成る培養生
細胞数の自動算定装置である。 本発明装置は以上のように、生細胞標本１の顕
微鏡像をTVカメラ３を介して画像走査に於て画
像解析をかけて細胞数及びその形態認識を実施せ
んとするものであり、死滅固定化された状態で検
査するのではなく生標本が被検体とされているこ
と、人間の視覚による判断によらず画像解析装置
による自動的判断に委ねられていること、画像形
成統計処理、図表作成等迄全自動化されているこ
とが特筆される点である。 以下に本発明を更に詳述する。 (i) 生細胞標本１の作成： 細胞の培養自体は従来法と変らないが、特記
すべき細胞数の算出に当つて細胞を殺さないで
生きたまゝ且つ染色しないで生標本として用い
る点である。即ち、培養は通常の生細胞（初代
培養細胞及びＬ、Hella、T6L等の株細胞）を
通常の培養液（MEM培養液など）で或る期間
培養する。その后培養皿としてのマルチデイシ
ユ（多数の独立した穴部を有する皿）に移して
期間を置いて培養してから本発明装置に付す
る。 (ii) 倒立位相差顕微鏡２： 培養皿（マルチデイシユ）の底面より培養中
の生標本を各穴部毎に顕微鏡視し得る公知の顕
微鏡を用いるがそのフオーカシングは手動によ
るものでもよいが、セルフフオーカス機構をも
つたものがよい。この機構の一つを本発明者が
本発明と関連して開発したので之を第３図に基
づいて原理を概説する。 試料台２１はステツプモータ２２、タイミン
グベルト２６、プーリ２３によつて昇降自在と
され、このステツプモータ２２が画像解析装置
４内に内蔵されているマイクロプロセツサ素子
２４に接続されており、対物レンズ筒２５より
試料台２１の標本１（マルチデイシユの各穴
部）を下方より接写した際、その標本画像走査
に於て光学的コントラストが１番強い点（波形
のうち波高が最も峻鋭な点）に自動的に焦点が
合つて停止するようマイクロプロセツサ２４か
らステツプモータ２２に信号が這入るようにな
つている。 上述は試料台２１を対物レンズ筒２５に対し
て進退させる例として示したが、同じ昇降手段
を用いて試料台２１を固定し対物レンズ筒２５
を長軸方向に進退させることも可能であり、更
には試料台２１を固定し、接眼レンズ２７及び
もしくは対物レンズ２８間で相対移動を行わせ
所望の位置に焦点調整することも可能である。 このようなセルフフオーカス機構は検査の全
自動化に寄与する上で望ましく採択される。 (iii) TVカメラ３： TVカメラ３は顕微鏡像を撮像するもので市
販の工業用もしくは医療用のTVカメラが用い
られる。 (iv) 画像解析装置４： TVカメラ３よりのデジタル映像信号にもと
づき生細胞標本１の生画像の画像走査をして画
像中の生細胞の光学的濃度により生細胞を判定
しその数を算出するものであるが、第１図のよ
うにこの装置４個有のTVモニタ８上に標本１
の生画像が映出されると共にその生画像中に与
えられている解析の内容が同モニタ８上にスー
パーインポーズされる。 細胞数の判定の算出の内容は第２図のように
水平同期走査の波形のうち波高及び波幅が夫々
一定値以内のものを生細胞として判定、算出す
るのである。同図に於て波高△ｙ及び波幅△ｘ
より小さなもの即ち、○イ・○ハが生細胞として判
定算出され、○ロ・○ニはそれ以外（例えばゴミ、
細菌類）のものと判定される。この△ｙ、△ｘ
の値は後記の（表１）より適宜設定される。解
析が単なる細胞数だけではなく面積率算定法に
基づく解析の場合は生画像中に算定に関与して
いる或る面積域が点滅可視光によりスーパーイ
ンポーズされて解析の内容が可視される。解析
装置４からの出力信号は図の場合AD変換器５
によつてデジタル信号としてコンピユータ６に
入力される。AD変換器５を解析装置４より前
置しておくことも技術的に可能であるがコスト
の面から後置する方が得策である。生細胞の数
の他にその形態を観察するについては、生細胞
の形状、すなわち、円形、三角形、多角形、不
定形の形状のうち、外輪線の長さよりその形状
を判読する解析も（例えば円形は外輪線が最
短、多角形は最長）それに必要なアダプタの付
設により大小の区別なく形態認識判断を実施し
得るのである。生細胞のあるものが異物の存在
によつて細胞活動が死滅した場合、或は何等か
の異常な活動を続けている場合、細胞形態を可
視像の中に見出し解析によつて形態判断するこ
とは意義の深いことである。 (v) コンピユータ６： 解析装置４からのデジタル解析信号をCRT
画像表示を含む情報処理をするものであつて、
その処理の一例としては数量変換、グラフ表
示、統計処理等がある。通常のフロツピイデイ
スク、ビデオメモリ等のメモリ手段９によつて
各種の情報の記憶保存が可能となることはもち
ろんである。 (vi) その他： 第１図のようにTVカメラ３による生標本の
画像をTVモニタ７（含メモリ手段）によつて
表示することによつて該画像中における細胞数
を肉眼で判定・算出して、その結果と、コンピ
ユータ６のCRT画像の結果とを比較して本発
明装置による算定数の精度比較を行ない最適な
解析能力を決定することは後述の実施例より必
要であるが、一度その解析能力が選定された場
合はこのTVモニタ７は敢て設置しなくてもよ
い。 以上のような構成に基づき本発明装置を実施す
るについては、培養生細胞標本１を作製し、これ
を倒立位相差顕微鏡２にて接写し、その生標本像
をTVカメラ３にて撮像し画像解析装置４にて画
像走査しつつ細胞の判読と細胞数の算出とを行な
いAD変換された解析信号をコンピユータでCRT
表示したり更に数量変換、グラフ表示等を行うも
のであり、更にメモリ手段９によつて生細胞像の
データを経時的に自動録画して各種の解析データ
と共に演算をして各種の表示を実行することが可
能となる。 なお、顕微鏡２とTVカメラ３とにより、撮像
面で４倍、テレビモニタ８〔および７〕で120倍
の生細胞像が得られたが、これら光学系の改善に
よつては像の拡大率は更に改良される筈である。 以下に本発明装置の実験例、実施例を比較例と
共に示す。 実験例 本発明装置に於ける生細胞標本像からの細胞数
算定値の誤差を少なくし得る解析能力（波形処
理）を見出すために、TVモニタ７上に写し出さ
れた細胞像から肉眼で数えた細胞実数と、解析の
ための波形処理（感度）及びゴミ、細菌等の夾雑
物を細胞から明確に区別するための被写体の大き
さとを種々変えた時の本発明による細胞数算定値
の閾値を調べた結果を（表１）に示す。なお、こ
の実験例に於ける生細胞の培養は実施例と同一で
ある。（表１）より閾値が１に近い（最も誤差の
少ない）場合は波高感度が6.0、波幅が0.4の時で
あつたので、解析装置４における解析能力（濃度
の波形処理）は△ｙ＝6.0、△ｘ＝0.4に照準を合
わせた。

【表】

【表】 実施例 (a) 生細胞標本の作成：Ｌ細胞を５％仔牛血清加
MEM培養液で７日間隔で予備培養し、４日間
の本培養の後24穴マルチデイシユに分配した後
２日、４日、７日培養後本発明装置にかけた。
なお、標本個数は30個である。 (b) 解析能力：△ｙ＝6.0、△ｘ＝0.4 (c) 拡大率：TVモニタで120倍 (d) 結 果：上記条件で得られた結果から変動率
（即ち誤差のバラツキ）を調べた結果を（表
３）に示す。 比較例 上記実施例と全く同一の標本を作製し従来の
NC法に従つて得た細胞数を（表２）に示す。

【表】

【表】 （表２）、（表３）から明らかなように、NC法
の場合、実験開始から２時間で変動係数が29.3
％、２日後で29.3％、４日後で12.2％の値を示し
たのに対し、本発明装置によると、変動係数が実
験開始後２時間で5.56％、２日後で2.7％、４日
後で2.25％とNC法に較べて遥かに減少してお
り、精度が飛躍的に改善されていることが判る。 本発明装置は以上の如く培養生細胞標本の顕微
鏡像をTVカメラで撮像したものを画像表示をか
けながら画像解析を実施して生細胞数の判定、算
出を行うものであるので、算出スピードが迅速化
され得ること、人為的誤差がないこと、実験系を
小規模なものとして算定経費を低廉とし得るこ
と、処理能力を大きく出来ること、細胞の増殖度
も連続的、定期的に記録し、保存し得ること、新
旧両データを基に各種の対比、判断が可能となつ
たこと、生細胞の形態認識も出来る………等、従
来方式の問題点を一掃し得る優れた効果を備えた
ものである。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明装置のフローチヤート、第２図
は画像解析の原理を示す波形図、第３図は顕微鏡
のセルフフオーカス機構の原理説明図である。 （符号の説明）、１……生細胞標本、２……倒
立位相差顕微鏡、３……TVカメラ、４……画像
解析装置、５……AD変換器、６……コンピユー
タ、７，８……TVモニタ、９……メモリ手段。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 培養中の生細胞標本１と、この標本１を接写
   する倒立位相差顕微鏡２と、この顕微鏡２を通し
   て上記生細胞標本１の顕微鏡像を撮像するTVカ
   メラ３と、得られた映像信号を画像走査して画像
   中の生細胞の光学的濃度により生細胞を判定しそ
   の数を算出する画像解析装置４と、この装置４か
   らのデジタル解析信号を情報処理するコンピユー
   タ６とより成る培養生細胞数の自動算定装置。 ２ 画像解析装置４による生細胞の判定算出が画
   像の水平走査の濃度波形の波高及び波幅によつて
   実施される特許請求の範囲第１項記載の装置。 ３ TVカメラ３の映像信号がTVモニタ７によつ
   て映像され、画像解析装置４の解析像が個有の
   TVモニタ８により映像され該装置４のアナログ
   解析信号がAD変換器５を経てコンピユータ６に
   入力される特許請求の範囲第１項記載の装置。 ４ AD変換器５よりのデジタル解析信号がメモ
   リ手段９によつて記憶保存される特許請求の範囲
   第３項記載の装置。 ５ 倒立位相差顕微鏡２がセルフフオーカス機構
   を含んでいる特許請求の範囲第１項記載の装置。