JPS629318B2 - - Google Patents
Info
- Publication number
- JPS629318B2 JPS629318B2 JP52132165A JP13216577A JPS629318B2 JP S629318 B2 JPS629318 B2 JP S629318B2 JP 52132165 A JP52132165 A JP 52132165A JP 13216577 A JP13216577 A JP 13216577A JP S629318 B2 JPS629318 B2 JP S629318B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- cells
- culture
- medium
- cell line
- cell
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2509/00—Methods for the dissociation of cells, e.g. specific use of enzymes
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】
産業上の利用分野
本発明は哺乳類細胞の培養法、更に詳しくは、
哺乳類細胞株（cell line）を撹拌液体懸濁培地で
の生育に速やかに適応させる方法に関する。
哺乳類細胞株（cell line）を撹拌液体懸濁培地で
の生育に速やかに適応させる方法に関する。
従来の技術
撹拌液体懸濁液中で哺乳類細胞の増殖は多くの
実験室で実施されている。最初に報告された研究
は、Owens氏等［Ann.N.Y.Acad.Sci.58、1039〜
55（1954）参照］およびEarle氏等［J.Nat.
Cancer Inst.14、1159〜71、（1954）参照］によ
るものである。その時以来、多数の細胞株が懸濁
培養に適応化された。この主題に関する広範な総
説はCherryおよびHull両氏［J.Biochem.
Microbiol.Tech.Eng.、11(3)、267〜85（1960）参
照］そしてMooreおよびUlrich両氏［J.Surg.
Res.、５(6)、270〜82（1965）参照］によりなさ
れた。
実験室で実施されている。最初に報告された研究
は、Owens氏等［Ann.N.Y.Acad.Sci.58、1039〜
55（1954）参照］およびEarle氏等［J.Nat.
Cancer Inst.14、1159〜71、（1954）参照］によ
るものである。その時以来、多数の細胞株が懸濁
培養に適応化された。この主題に関する広範な総
説はCherryおよびHull両氏［J.Biochem.
Microbiol.Tech.Eng.、11(3)、267〜85（1960）参
照］そしてMooreおよびUlrich両氏［J.Surg.
Res.、５(6)、270〜82（1965）参照］によりなさ
れた。
哺乳類細胞の懸濁培養は細胞の大規模増殖の観
点から望ましい。この細胞培養法は、通常の単層
増殖法に固有の多くの時間的および空間的制限が
ない。過去においては、実用的な懸濁培養法を開
発するのに培養装置条件および栄養培地に多くの
開心が払われてきた。これら培養装置条件および
栄養培地の例は、それぞれ米国特許第2990335号
および同第3039932号各明細書に開示されている
ものである。報告された多くの方法では、細胞は
通常ばらばらな細胞の大量浮遊液として生育す
る。懸濁培養中細胞の一時的集塊はすべて不都合
なものとみなされ、そしてそのような集塊を回避
または除去するように条件が配慮されていた［In
Vitro ９(5)、318〜30（1974）および米国特許第
3850748号明細書参照］。
点から望ましい。この細胞培養法は、通常の単層
増殖法に固有の多くの時間的および空間的制限が
ない。過去においては、実用的な懸濁培養法を開
発するのに培養装置条件および栄養培地に多くの
開心が払われてきた。これら培養装置条件および
栄養培地の例は、それぞれ米国特許第2990335号
および同第3039932号各明細書に開示されている
ものである。報告された多くの方法では、細胞は
通常ばらばらな細胞の大量浮遊液として生育す
る。懸濁培養中細胞の一時的集塊はすべて不都合
なものとみなされ、そしてそのような集塊を回避
または除去するように条件が配慮されていた［In
Vitro ９(5)、318〜30（1974）および米国特許第
3850748号明細書参照］。
腫瘍細胞は軟質寒天の非撹拌懸濁液中で多細胞
球形体として成育しうることも知られている［J.
Exptl.Med.138、745〜75（1973）参照］。別の場
合、個々の腫瘍細胞は軟質寒天の表面に集まる
か、または軟質寒天の表面から分離しそして培地
中に浮くことが観察されている［Z.Krebsforsch.
72、24〜31（1969）参照］。
球形体として成育しうることも知られている［J.
Exptl.Med.138、745〜75（1973）参照］。別の場
合、個々の腫瘍細胞は軟質寒天の表面に集まる
か、または軟質寒天の表面から分離しそして培地
中に浮くことが観察されている［Z.Krebsforsch.
72、24〜31（1969）参照］。
これらの従来技術による懸濁培養での細胞増殖
法とは対照的に、本発明は基質結合培養からの生
育細胞を迅速に撹拌液体懸濁液に適応させる手段
として細胞集合体を意図的に使用することに関す
る。
法とは対照的に、本発明は基質結合培養からの生
育細胞を迅速に撹拌液体懸濁液に適応させる手段
として細胞集合体を意図的に使用することに関す
る。
発明が解決しようとする問題点
本発明によれば、基質結合培養において急速に
生育する密集細胞は酵素処理によつて基質からお
だやかに遊離して直径約20μ〜約500μの範囲の
集合体を生成する。これら集合体は次いで撹拌液
体懸濁液の新しい培地に移し、それによつて細胞
は集塊の状態で生育し続ける。これら集合体中で
は、細胞−細胞間の接触および相互作用が細胞−
基質間の接触に十分に代ることができ、そしてそ
れによつて通常の足場依存性細胞の液体懸濁生育
が可能になることが分つた。これら細胞は適応
（アダプテーシヨン）期間をほとんどまたは全く
必要とすることなく、基質結合培養において見出
されるものと同一の倍化時間で分裂しつづける。
生育する密集細胞は酵素処理によつて基質からお
だやかに遊離して直径約20μ〜約500μの範囲の
集合体を生成する。これら集合体は次いで撹拌液
体懸濁液の新しい培地に移し、それによつて細胞
は集塊の状態で生育し続ける。これら集合体中で
は、細胞−細胞間の接触および相互作用が細胞−
基質間の接触に十分に代ることができ、そしてそ
れによつて通常の足場依存性細胞の液体懸濁生育
が可能になることが分つた。これら細胞は適応
（アダプテーシヨン）期間をほとんどまたは全く
必要とすることなく、基質結合培養において見出
されるものと同一の倍化時間で分裂しつづける。
基質足場依存性から単一細胞懸濁培養に変換さ
せるのに通常必要とされるようなこれまでの長い
適応期間は、異つた性質を有する細胞の選択およ
び所望の生成物の潜在的損失を包含する。本発明
に規定された集塊懸濁への速やかな変換はそのよ
うな選択を必要とせず、そして一般には細胞性質
の損失を回避する。細胞は長期間集塊浮遊液とし
て増殖しうるし、あるいは連続懸濁増殖が任意の
所望の性質に対して選択を行う場合には、こうし
た細胞は屡々基質結合培養から変換されうる。さ
らにまた、細胞を長期間にわたつて凍結保存し、
解凍して基質結合培地中に植えつけ、そして速や
かに本発明による集塊懸濁に変換させることがで
きる。
せるのに通常必要とされるようなこれまでの長い
適応期間は、異つた性質を有する細胞の選択およ
び所望の生成物の潜在的損失を包含する。本発明
に規定された集塊懸濁への速やかな変換はそのよ
うな選択を必要とせず、そして一般には細胞性質
の損失を回避する。細胞は長期間集塊浮遊液とし
て増殖しうるし、あるいは連続懸濁増殖が任意の
所望の性質に対して選択を行う場合には、こうし
た細胞は屡々基質結合培養から変換されうる。さ
らにまた、細胞を長期間にわたつて凍結保存し、
解凍して基質結合培地中に植えつけ、そして速や
かに本発明による集塊懸濁に変換させることがで
きる。
所望の細胞株をまず基質結合培地に生育させ
る。基質結合生育期間の間、その細胞株を、懸濁
培養で以後使用するものと同一の培地中で急速生
育に適応させるべきである。
る。基質結合生育期間の間、その細胞株を、懸濁
培養で以後使用するものと同一の培地中で急速生
育に適応させるべきである。
種々の通常の足場依存性の哺乳類樹立細胞株
は、本発明の方法によつて、撹拌液体懸濁培地に
おける生育に速やかに適応させた。これら細胞株
は次のとおりであるが、これは例示および説明の
ためであり、本発明を限定するものではない。
は、本発明の方法によつて、撹拌液体懸濁培地に
おける生育に速やかに適応させた。これら細胞株
は次のとおりであるが、これは例示および説明の
ためであり、本発明を限定するものではない。
人肺SV−40形質転換細胞系、名称WI38、
VA13（ATCCNo.CCL75.1）、 人肺SV−40形質転換細胞株、名称WI26、VA4
（ATCCNo.CCL95.1）、 マウス腎臓SV−40形質転換細胞株、名称
TCMK−１、（ATCCNo.CCL139）、 マウス腎臓腺癌細胞株、名称RAG、（ATCCNo.
CCL142）、 マウス胎児カーステン（Kirsten）ビールス形
質転換細胞株、名称KNIH、 マウス胎児SV−40形質転換細胞株、名称
SV3T3。
VA13（ATCCNo.CCL75.1）、 人肺SV−40形質転換細胞株、名称WI26、VA4
（ATCCNo.CCL95.1）、 マウス腎臓SV−40形質転換細胞株、名称
TCMK−１、（ATCCNo.CCL139）、 マウス腎臓腺癌細胞株、名称RAG、（ATCCNo.
CCL142）、 マウス胎児カーステン（Kirsten）ビールス形
質転換細胞株、名称KNIH、 マウス胎児SV−40形質転換細胞株、名称
SV3T3。
本発明で使用する後の２種の細胞株の培養物
は、ハーバード・メデイカル・スクールのJudah
Folkman博士から得た。その他の培養物はアメ
リカン・タイプ・カルチユア・コレクシヨンから
得た。
は、ハーバード・メデイカル・スクールのJudah
Folkman博士から得た。その他の培養物はアメ
リカン・タイプ・カルチユア・コレクシヨンから
得た。
KNIH細胞株は最初Jainchill氏等［J.Virology
４、549〜53（1969）参照］により培養され次
いでカーステンビールスすなわちKirsten氏等
［J.Nat.Cancer Inst.39、311〜35（1967）参照］
により単離されたねずみ肉腫ビールスにより形質
転換されたNIHマウス胎児繊維芽細胞から誘導し
た。
４、549〜53（1969）参照］により培養され次
いでカーステンビールスすなわちKirsten氏等
［J.Nat.Cancer Inst.39、311〜35（1967）参照］
により単離されたねずみ肉腫ビールスにより形質
転換されたNIHマウス胎児繊維芽細胞から誘導し
た。
本発明方法による撹拌液体懸濁培養に適応させ
るために適当な他の樹立細胞株は、当業者には明
白であろう。本発明の目的に対しては、「樹立」
細胞株とは、インビトロで無限に継代培養能を示
す細胞株を意味する。これはTissue Culture
Associationによつて1966年６月３日サンフラン
シスコにおけるその年会において受理されたS.
Federoff氏による動物組織培養用語として提案さ
れたものである。
るために適当な他の樹立細胞株は、当業者には明
白であろう。本発明の目的に対しては、「樹立」
細胞株とは、インビトロで無限に継代培養能を示
す細胞株を意味する。これはTissue Culture
Associationによつて1966年６月３日サンフラン
シスコにおけるその年会において受理されたS.
Federoff氏による動物組織培養用語として提案さ
れたものである。
細胞生育用に適当な培地には同化可能な窒素
源、炭素源および無機塩を含有している。これら
は周知の組織培養用培地例えば基礎培地イーグル
（BME）、イーグル最小必須培地（MED）、ダル
ベツコの修正イーグル培地、培地199およびバラ
ンスされた塩溶液（BSS）例えば種々の栄養源を
加えたEarleおよびHank氏液のいずれかでよい。
これらは市販の組織培養用培地であり、そして
H.J.Morton氏により詳細に記載されている［In
Vitro ６、89〜108（1970）参照］。これら培地
は既知の必須アミノ酸、鉱物塩、ビタミンおよび
炭水化物を含有している。それらはまた往々にし
て哺乳類血清例えば胎児仔牛血清が添加されてい
る。
源、炭素源および無機塩を含有している。これら
は周知の組織培養用培地例えば基礎培地イーグル
（BME）、イーグル最小必須培地（MED）、ダル
ベツコの修正イーグル培地、培地199およびバラ
ンスされた塩溶液（BSS）例えば種々の栄養源を
加えたEarleおよびHank氏液のいずれかでよい。
これらは市販の組織培養用培地であり、そして
H.J.Morton氏により詳細に記載されている［In
Vitro ６、89〜108（1970）参照］。これら培地
は既知の必須アミノ酸、鉱物塩、ビタミンおよび
炭水化物を含有している。それらはまた往々にし
て哺乳類血清例えば胎児仔牛血清が添加されてい
る。
作 用
懸濁培養の前に、樹立細胞株を所望の培地中で
基質結合培養での通常の単層生育以上の段階まで
生育させて、多層細胞を生成させ、そして三次元
での細胞間接触を確立させるべきである。これ
は、継代培養せずに基質結合細胞を頻繁に接種し
て行なうことができる。この生育は、通常の培養
フラスコ例えばフアルコン（Falcon）75cm2フラ
スコ中で実施することができる。
基質結合培養での通常の単層生育以上の段階まで
生育させて、多層細胞を生成させ、そして三次元
での細胞間接触を確立させるべきである。これ
は、継代培養せずに基質結合細胞を頻繁に接種し
て行なうことができる。この生育は、通常の培養
フラスコ例えばフアルコン（Falcon）75cm2フラ
スコ中で実施することができる。
効 果
基質から細胞を遊離させるのに使用する処理は
重要である。それは、直径約20μ〜約500μの範
囲の細胞の集合体または塊を生成させるようなも
のでなくてはならない。この範囲内では約75％の
細胞が１集合体当り約６個〜約100個の細胞の集
合体になつていることが好ましい。それらを一緒
に集塊化することができないためかまたは細胞の
処理の間に細胞集合体からそれらが分離した結
果、小割合の単一細胞が存在しるうことが理解さ
れる。不当に多数のそのような単一細胞を撹拌液
体懸濁培養に移すことは避けることが好ましい。
何故ならばそれらは死滅し易いからである。細胞
集合体が大きすぎる場合、例えば直径約500μ以
上の場合には、その中心の細胞に充分な栄養が到
着せず、そして細胞の生育を阻止しあるいは生存
性を破壊する毒性物が産生される。
重要である。それは、直径約20μ〜約500μの範
囲の細胞の集合体または塊を生成させるようなも
のでなくてはならない。この範囲内では約75％の
細胞が１集合体当り約６個〜約100個の細胞の集
合体になつていることが好ましい。それらを一緒
に集塊化することができないためかまたは細胞の
処理の間に細胞集合体からそれらが分離した結
果、小割合の単一細胞が存在しるうことが理解さ
れる。不当に多数のそのような単一細胞を撹拌液
体懸濁培養に移すことは避けることが好ましい。
何故ならばそれらは死滅し易いからである。細胞
集合体が大きすぎる場合、例えば直径約500μ以
上の場合には、その中心の細胞に充分な栄養が到
着せず、そして細胞の生育を阻止しあるいは生存
性を破壊する毒性物が産生される。
基質から細胞を目的通り遊離するには、顕微鏡
下で注意深く観察しつつ、室温（通常約20〜25
℃）で、酵素的溶解例えばトリプシン処理等によ
り容易になる。この酵素処理により、細胞は３種
類の異なる物理的状態すなわち単一細胞、細胞塊
または集合体、または大形細胞の層となる。細胞
が所望のサイズの集合体で遊離された場合には、
それ以上の処理は不要である。しかしながら、細
胞が主として単独かまたは大形の層で遊離された
場合には、更に処理を行わなくてはならない。単
独で遊離された場合には、培養フラスコを所望の
集合体が生成するまで室温に放置しておく。酵素
処理により遊離した細胞は粘着性であり、そして
もし撹拌しないならばある時間後には集合体を形
成する。大細胞の層が形成された場合には、これ
をおだやかな撹拌例えば振盪によるかまたは小さ
な開口部例えば所望の直径を有するピペツトチツ
プまたはニードルを通過させて所望の集合体サイ
ズに再分割または破壊するべきである。
下で注意深く観察しつつ、室温（通常約20〜25
℃）で、酵素的溶解例えばトリプシン処理等によ
り容易になる。この酵素処理により、細胞は３種
類の異なる物理的状態すなわち単一細胞、細胞塊
または集合体、または大形細胞の層となる。細胞
が所望のサイズの集合体で遊離された場合には、
それ以上の処理は不要である。しかしながら、細
胞が主として単独かまたは大形の層で遊離された
場合には、更に処理を行わなくてはならない。単
独で遊離された場合には、培養フラスコを所望の
集合体が生成するまで室温に放置しておく。酵素
処理により遊離した細胞は粘着性であり、そして
もし撹拌しないならばある時間後には集合体を形
成する。大細胞の層が形成された場合には、これ
をおだやかな撹拌例えば振盪によるかまたは小さ
な開口部例えば所望の直径を有するピペツトチツ
プまたはニードルを通過させて所望の集合体サイ
ズに再分割または破壊するべきである。
基質から細胞を遊離するのに使用する適当な酵
素は、トリプシン、プロナーゼ、コラゲナーゼお
よびヒアルロニダーゼであるが、これらは例示の
ためであり限定的なものではない。トリプシンは
好ましい酵素であり、例えばマイルス・ラボラト
リーズ社（Miles Laboratories Inc.）およびワ
ーシントン・バイオケミカル社（Worthington
Biochemical Corp.）から市場的に容易に入手可
能である。一時組織解離において、これら酵素の
使用についての情報に関しては、Kruseおよび
Patterson両氏著「Tissue Culture Methods ＆
Applications」（アカデミツクプレス1973年
版）第３〜36頁を参照することができる。
素は、トリプシン、プロナーゼ、コラゲナーゼお
よびヒアルロニダーゼであるが、これらは例示の
ためであり限定的なものではない。トリプシンは
好ましい酵素であり、例えばマイルス・ラボラト
リーズ社（Miles Laboratories Inc.）およびワ
ーシントン・バイオケミカル社（Worthington
Biochemical Corp.）から市場的に容易に入手可
能である。一時組織解離において、これら酵素の
使用についての情報に関しては、Kruseおよび
Patterson両氏著「Tissue Culture Methods ＆
Applications」（アカデミツクプレス1973年
版）第３〜36頁を参照することができる。
基質から適当に離脱させた後、この細胞集合体
を新しい培地を含有する急速撹拌容器に移す。こ
うした容器は、例えばガラス、プラスチツクまた
は金属製でよい。ニユー・ブランズウイツク・サ
イエンテイフイツク社製のステンレススチールジ
ヤケツトつき醗酵槽はベルコ・グラス社製のガラ
スびんと同様に、バツフルを除去して改変すれば
一般に適当である。そのような醗酵槽の例は米国
特許第3445341号および同第3445342号各明細書に
記載の装置である。撹拌びんの例は、米国特許第
2958517号および同第3622129号各明細書に開示の
ものである。大規模で撹拌液体懸濁培養するため
のその他の別の装置は、米国特許第3039932号明
細書に記載されている。これら撹拌容器の使用に
あたつての撹拌速度は好ましくは、約200〜約
300rpmの範囲にあるべきである。
を新しい培地を含有する急速撹拌容器に移す。こ
うした容器は、例えばガラス、プラスチツクまた
は金属製でよい。ニユー・ブランズウイツク・サ
イエンテイフイツク社製のステンレススチールジ
ヤケツトつき醗酵槽はベルコ・グラス社製のガラ
スびんと同様に、バツフルを除去して改変すれば
一般に適当である。そのような醗酵槽の例は米国
特許第3445341号および同第3445342号各明細書に
記載の装置である。撹拌びんの例は、米国特許第
2958517号および同第3622129号各明細書に開示の
ものである。大規模で撹拌液体懸濁培養するため
のその他の別の装置は、米国特許第3039932号明
細書に記載されている。これら撹拌容器の使用に
あたつての撹拌速度は好ましくは、約200〜約
300rpmの範囲にあるべきである。
懸濁培養において満足すべき細胞増殖を確実な
らしめるためには、結合基質から撹拌容器に移す
細胞の濃度を浮遊液１ml当り少くとも細胞約106
個となすべきである。
らしめるためには、結合基質から撹拌容器に移す
細胞の濃度を浮遊液１ml当り少くとも細胞約106
個となすべきである。
懸濁培養の間そのPHは約6.7〜約7.7、そして好
ましくは約7.0〜約7.4に保持されるべきである。
このPHは、適当なバツフアー例えば燐酸バツフア
ー添加食塩水（PBS）または記載のPHを有するそ
の他の既知のバツフアーの使用によつて適当に保
持することができる。
ましくは約7.0〜約7.4に保持されるべきである。
このPHは、適当なバツフアー例えば燐酸バツフア
ー添加食塩水（PBS）または記載のPHを有するそ
の他の既知のバツフアーの使用によつて適当に保
持することができる。
培養温度は約30℃〜約38℃そして好ましくは約
35℃〜約37℃の範囲にあるべきである。
35℃〜約37℃の範囲にあるべきである。
懸濁培養生育期間の間、所定の定期的間隔で、
生育細胞を新しい培地へ連続的に移植を実施する
ことができる。大規模に細胞の急速増殖を容易な
らしめるためには、これら移植を前と同様の新し
い栄養培地を含有するますます大形の培養容器中
に対して行うことができる。
生育細胞を新しい培地へ連続的に移植を実施する
ことができる。大規模に細胞の急速増殖を容易な
らしめるためには、これら移植を前と同様の新し
い栄養培地を含有するますます大形の培養容器中
に対して行うことができる。
適当な細胞生育後に、例えば35〜37℃で２週間
細胞培養期間後に、細胞を例えば沈降または200
〜1000Gで遠心してこの浮遊液から収穫すること
ができる。パツクされた細胞を次いで例えば食塩
水、乳酸塩添加リンゲル液、PBSおよび約6.7〜
約7.7そして好ましくは約7.0〜約7.4のPHを有する
その他の水溶液中で完全に洗う。洗つた細胞は必
要に応じて使用に備えて保存しておくことができ
るしまたはこれを所望の生成物例えば酵素、ホル
モン、抗生物質および細胞代謝物質を得るために
抽出することができる。
細胞培養期間後に、細胞を例えば沈降または200
〜1000Gで遠心してこの浮遊液から収穫すること
ができる。パツクされた細胞を次いで例えば食塩
水、乳酸塩添加リンゲル液、PBSおよび約6.7〜
約7.7そして好ましくは約7.0〜約7.4のPHを有する
その他の水溶液中で完全に洗う。洗つた細胞は必
要に応じて使用に備えて保存しておくことができ
るしまたはこれを所望の生成物例えば酵素、ホル
モン、抗生物質および細胞代謝物質を得るために
抽出することができる。
次に詳細な実施例により本発明を更に説明する
が、本発明はこれら特定例に限定されない。
が、本発明はこれら特定例に限定されない。
例 １
WI26、VA4と命名した人肺SV−40形質転換細
胞株の培養物はCCL95.1の寄託番号でアメリカ
ン・タイプ・カルチユア・コレクシヨンから得
た。この培養物を75cm2プラスチツク製フアルコン
フラスコ中に基質結合状態で60日間保持した。こ
の期間に細胞を以後の懸濁培養に使用する培地、
すなわち4.5ｇ／mlのグルコースを含有しそして
10％の胎児仔牛血清を添加したダルベツコの修正
最小必須培地に適応させた。この細胞を一週間間
隔で継代培養しそして培地に２日目ごとに新しい
培地を仕込んだ。最後の２週間は細胞を継代培養
せず、毎日培地を補充して保持した。
胞株の培養物はCCL95.1の寄託番号でアメリカ
ン・タイプ・カルチユア・コレクシヨンから得
た。この培養物を75cm2プラスチツク製フアルコン
フラスコ中に基質結合状態で60日間保持した。こ
の期間に細胞を以後の懸濁培養に使用する培地、
すなわち4.5ｇ／mlのグルコースを含有しそして
10％の胎児仔牛血清を添加したダルベツコの修正
最小必須培地に適応させた。この細胞を一週間間
隔で継代培養しそして培地に２日目ごとに新しい
培地を仕込んだ。最後の２週間は細胞を継代培養
せず、毎日培地を補充して保持した。
60日後に、６個の75cm2フラスコ中の密集多層細
胞を次のようにして収穫した。
胞を次のようにして収穫した。
使用済の培地を流出させた。0.02％ジナトリウ
ムエチレンジアミンテトラ酢酸（EDTA）を含有
するPH7.2の燐酸バツフアー添加食塩水（PBS）
を使用してこの結合細胞を洗つた。この洗浄操作
をくりかえした。次いで0.02％EDTAを含有する
PBS中の0.2％トリプシン５mlを加え、そして室
温でこれを細胞上に放置した。フラスコを倒立顕
微鏡で注意して観察した。３分間放置後、フラス
コをわずかに撹拌すると、直径20μ〜500μの所
望の範囲の細胞集合体が生成した。この撹拌は、
表面に結合している細胞を液体より下になるよう
に一方の手でフラスコをまつすぐに保持しそして
これを他方の掌におだやかに打ちつけることによ
つ行なつた。小さな波から細胞を液体中で洗う大
波までの範囲の動きはこのようにして生成され
た。それによつて、細胞は動的液体と比較的に静
止状態のフラスコとの間の剪断力を受けた。
ムエチレンジアミンテトラ酢酸（EDTA）を含有
するPH7.2の燐酸バツフアー添加食塩水（PBS）
を使用してこの結合細胞を洗つた。この洗浄操作
をくりかえした。次いで0.02％EDTAを含有する
PBS中の0.2％トリプシン５mlを加え、そして室
温でこれを細胞上に放置した。フラスコを倒立顕
微鏡で注意して観察した。３分間放置後、フラス
コをわずかに撹拌すると、直径20μ〜500μの所
望の範囲の細胞集合体が生成した。この撹拌は、
表面に結合している細胞を液体より下になるよう
に一方の手でフラスコをまつすぐに保持しそして
これを他方の掌におだやかに打ちつけることによ
つ行なつた。小さな波から細胞を液体中で洗う大
波までの範囲の動きはこのようにして生成され
た。それによつて、細胞は動的液体と比較的に静
止状態のフラスコとの間の剪断力を受けた。
得られた５mlの細胞集合体浮遊液を200mlの培
地を含有する500ml容ベルコ撹拌フラスコに移し
た。この培地を37℃の温室で約250rpmの撹拌速
度を使用して培養した。細胞はその速度低下また
はラグを示すことなく成長しつづけた。定期的間
隔で培地を加えそして培地を次のようにしてより
大きい容器に移した。
地を含有する500ml容ベルコ撹拌フラスコに移し
た。この培地を37℃の温室で約250rpmの撹拌速
度を使用して培養した。細胞はその速度低下また
はラグを示すことなく成長しつづけた。定期的間
隔で培地を加えそして培地を次のようにしてより
大きい容器に移した。
48時間後、追加の培地を加えて全浮遊液の体積
を500mlとした。
を500mlとした。
全部で144時間後、400mlの浮遊液を使用して２
の培地を含有する３容ベルコ撹拌容器に接種
した。400mlの新しい培地を最初の500ml容撹拌び
に加えた。３容撹拌びんに、毎分１で５％
CO2含有空気を吹きこんだ。両方のびんを37℃の
温室で250rpmで撹拌しつづけた。
の培地を含有する３容ベルコ撹拌容器に接種
した。400mlの新しい培地を最初の500ml容撹拌び
に加えた。３容撹拌びんに、毎分１で５％
CO2含有空気を吹きこんだ。両方のびんを37℃の
温室で250rpmで撹拌しつづけた。
全部で240時間の集合体懸濁培養後に、新しい
培地で３容撹拌びん中の浮遊液の体積を４に
増加させた（目盛り体積より１上）。500ml容撹
拌びんを収穫しそして細胞をこの時点で液体窒素
中で凍結した。
培地で３容撹拌びん中の浮遊液の体積を４に
増加させた（目盛り体積より１上）。500ml容撹
拌びんを収穫しそして細胞をこの時点で液体窒素
中で凍結した。
335時間後、浮遊液３を12容撹拌容器に移
し、そしてこの３容および12容各撹拌びに新
しい培地を加えてそれらの体積をそれぞれ４お
よび12とした。両者を37℃、250rpmで５％
CO2含有空気層にて培養した。
し、そしてこの３容および12容各撹拌びに新
しい培地を加えてそれらの体積をそれぞれ４お
よび12とした。両者を37℃、250rpmで５％
CO2含有空気層にて培養した。
集合体浮遊培養の開始から全部で480時間の
後、16のこの浮遊液を遠心により収穫して30ml
の密集細胞を得た。DNA測定（140±2.6mg
DNA）は約1.4±0.03×1010個の細胞収量を示し
た。
後、16のこの浮遊液を遠心により収穫して30ml
の密集細胞を得た。DNA測定（140±2.6mg
DNA）は約1.4±0.03×1010個の細胞収量を示し
た。
例 ２
通常は足場依存性の人細胞株である別の人肺
SV−40形質転換細胞株、WI38、VA13（ATCC
No.CCL75.1）を実質的には例１に使用されたと同
一の方法および条件下に速やかに撹拌液体懸濁培
養に適応させた。集塊懸濁培養の開始から全部で
38日後、16の浮遊液を収穫して1.84±0.3×1010
個の細胞を得た。
SV−40形質転換細胞株、WI38、VA13（ATCC
No.CCL75.1）を実質的には例１に使用されたと同
一の方法および条件下に速やかに撹拌液体懸濁培
養に適応させた。集塊懸濁培養の開始から全部で
38日後、16の浮遊液を収穫して1.84±0.3×1010
個の細胞を得た。
例 ３
通常は足場依存性細胞株である。マウス腎臓
SV−40形質転換細胞株TCMK−１（ATCCNo.
CCL139）を実質的には例１に使用されたと同一
の方法および条件で撹拌液体懸濁培養に速やかに
適応させた。撹拌懸濁培養の開始から全部で19日
経過した後、この浮遊液16を収穫して2.57±
0.05×1010個の細胞を得た。
SV−40形質転換細胞株TCMK−１（ATCCNo.
CCL139）を実質的には例１に使用されたと同一
の方法および条件で撹拌液体懸濁培養に速やかに
適応させた。撹拌懸濁培養の開始から全部で19日
経過した後、この浮遊液16を収穫して2.57±
0.05×1010個の細胞を得た。
例 ４
通常は足場依存性のマウス細胞株であるマウス
胎児SV−40形質転換細胞株、SV3T3を実質的に
は例１に使用されたと同一の方法および条件下に
速やかに撹拌液体懸濁培養に適応させた。集塊懸
濁培養の開始から全部で14日経過した後、浮遊液
60を収穫して8.1±0.22×1010個の細胞を得た。
胎児SV−40形質転換細胞株、SV3T3を実質的に
は例１に使用されたと同一の方法および条件下に
速やかに撹拌液体懸濁培養に適応させた。集塊懸
濁培養の開始から全部で14日経過した後、浮遊液
60を収穫して8.1±0.22×1010個の細胞を得た。
例 ５
通常は足場依存性マウス胎児細胞株であるカー
ステンビールス形質転換細胞株、KNIHを、実質
的には例１に使用されたと同一の方法および条件
で撹拌液体懸濁培養に速やかに適応させた。撹拌
懸濁培養の開始から全部で15日経過した後、60
の浮遊液を収穫して視覚的に観察して有意量の細
胞を得た。
ステンビールス形質転換細胞株、KNIHを、実質
的には例１に使用されたと同一の方法および条件
で撹拌液体懸濁培養に速やかに適応させた。撹拌
懸濁培養の開始から全部で15日経過した後、60
の浮遊液を収穫して視覚的に観察して有意量の細
胞を得た。
例 ６
更に別の通常は足場依存正マウス細胞株である
マウス腎臓腺癌細胞株RAG（ATCCNo.CCL142）
を、実質的には例１に使用されたと同一の方法お
よび条件下に撹拌液体懸濁培養に速やかに適応さ
せた。撹拌懸濁培養の開始から全部で10日経過し
た後、４の浮遊液を収穫して視覚的に観察して
有意量の細胞を得た。
マウス腎臓腺癌細胞株RAG（ATCCNo.CCL142）
を、実質的には例１に使用されたと同一の方法お
よび条件下に撹拌液体懸濁培養に速やかに適応さ
せた。撹拌懸濁培養の開始から全部で10日経過し
た後、４の浮遊液を収穫して視覚的に観察して
有意量の細胞を得た。
本明細書における記述において「懸濁」および
「浮遊」なる語はいずれも相互交換的に使用され
ていることを理解されたい。これらの語はサスペ
ンジヨンを意味するものであり、従つて「懸濁
液」および「浮遊液」そして「懸濁培養」および
「浮遊培養」の語はそれぞれ同義に解されるもの
である。
「浮遊」なる語はいずれも相互交換的に使用され
ていることを理解されたい。これらの語はサスペ
ンジヨンを意味するものであり、従つて「懸濁
液」および「浮遊液」そして「懸濁培養」および
「浮遊培養」の語はそれぞれ同義に解されるもの
である。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ 通常は足場依存性の樹立細胞株の接種物を基
質結合培養基中通常の単層成長以上の段階まで生
育させて、細胞の多重層を生成させ、この細胞を
基質結合培養物から直径約20μ〜約500μ範囲の
細胞集合体の形で遊離させ、この集合体を必須ア
ミノ酸、鉱物塩、ビタミンおよび炭水化物の栄養
培地の液体懸濁液中に移し、実質的に連続的にこ
の培地を撹拌しつつ約30℃〜約38℃の温度で培養
し、定期的に成長細胞を新しい培地に移植し、そ
して撹拌培養を続けてこの細胞を集合状態で増殖
させることを特徴とする、細胞株を撹拌液体懸濁
培養に速やかに適応させる方法。 ２ 培養温度は約35°〜約37℃である、特許請求
の範囲第１項記載の方法。 ３ 新しい栄養培地に成長細胞を２回定期的に所
定の間隔で継代させる、特許請求の範囲第１項記
載の方法。 ４ 栄養培地に哺乳類血清を添加する、特許請求
の範囲第１項記載の方法。 ５ 細胞株はSV−40形質転換細胞株である、特
許請求の範囲第１項記載の方法。 ６ 栄養培地はダルベツコの改良必須最小培地で
ある、特許請求の範囲第１項記載の方法。 ７ 基質結合培養物から細胞を遊離させるのを、
酵素溶解により容易化させる、特許請求の範囲第
１項記載の方法。 ８ 酵素はトリプシンである、特許請求の範囲第
７項記載の方法。 ９ 酵素による溶解におだやかな撹拌を伴なわせ
る、特許請求の範囲第７項記載の方法。 １０ 酵素はトリプシンである、特許請求の範囲
第９項記載の方法。 １１ 基質結合培養から細胞を遊離させるのに、
顕微鏡により注意深い観察を行ない、前記直径範
囲の細胞集合体の形成を確実ならしめる、特許請
求の範囲第７項又は第９項記載の方法。
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US05/738,515 US4059485A (en) | 1976-11-03 | 1976-11-03 | Adaptation of cell lines to suspension culture |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS5359091A JPS5359091A (en) | 1978-05-27 |
| JPS629318B2 true JPS629318B2 (ja) | 1987-02-27 |
Family
ID=24968344
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP13216577A Granted JPS5359091A (en) | 1976-11-03 | 1977-11-02 | Applicating method cell strain to suspension culture |
Country Status (10)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4059485A (ja) |
| JP (1) | JPS5359091A (ja) |
| BE (1) | BE860413A (ja) |
| CA (1) | CA1093994A (ja) |
| DE (1) | DE2749022C2 (ja) |
| FR (1) | FR2370095A1 (ja) |
| GB (1) | GB1535490A (ja) |
| IL (1) | IL53281A0 (ja) |
| IT (1) | IT1088864B (ja) |
| SE (1) | SE432778B (ja) |
Families Citing this family (21)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4184916A (en) * | 1977-11-14 | 1980-01-22 | Monsanto Company | Continuous cell culture system |
| US4229532A (en) * | 1978-12-29 | 1980-10-21 | Monsanto Company | Production of tumor angiogenesis factor by cell culture |
| US4210718A (en) * | 1978-12-29 | 1980-07-01 | Monsanto Company | Production of tumor angiogenesis factor by cell culture |
| US4209587A (en) * | 1978-12-29 | 1980-06-24 | Monsanto Company | Production of tumor angiogenesis factor by cell culture |
| US4225670A (en) * | 1978-12-29 | 1980-09-30 | Monsanto Company | Production of tumor angiogenesis factor by cell culture |
| US4210719A (en) * | 1978-12-29 | 1980-07-01 | Monsanto Company | Production of tumor angiogenesis factor by cell culture |
| US4229531A (en) * | 1978-12-29 | 1980-10-21 | Monsanto Company | Production of tumor angiogenesis factor by cell culture |
| US4217412A (en) * | 1979-04-25 | 1980-08-12 | President And Fellows Of Harvard College | Production of tumor angiogenesis factor by cell culture |
| US4335215A (en) * | 1980-08-27 | 1982-06-15 | Monsanto Company | Method of growing anchorage-dependent cells |
| US5998200A (en) * | 1985-06-14 | 1999-12-07 | Duke University | Anti-fouling methods using enzyme coatings |
| US5219752A (en) * | 1988-05-25 | 1993-06-15 | Teijin, Limited | Process for continuously culturing adherent animal cells |
| AT393277B (de) * | 1990-01-04 | 1991-09-25 | Immuno Ag | Verfahren zur herstellung von fruehsommer- meningoenzephalitis-virus (fsme-virus)-antigen |
| US6133019A (en) * | 1995-03-28 | 2000-10-17 | Kinetic Biosystems, Inc. | Centrifugal fermentation process |
| US20050266548A1 (en) * | 1995-03-28 | 2005-12-01 | Kbi Biopharma, Inc. | Biocatalyst chamber encapsulation system for bioremediation and fermentation with improved rotor |
| US6660509B1 (en) | 1995-03-28 | 2003-12-09 | Kinetic Biosystems, Inc. | Methods and devices for remediation and fermentation |
| US6916652B2 (en) * | 1995-03-28 | 2005-07-12 | Kinetic Biosystems, Inc. | Biocatalyst chamber encapsulation system for bioremediation and fermentation |
| US5622819A (en) * | 1995-03-28 | 1997-04-22 | Kinetic Biosystems, Inc. | Centrifugal fermentation process |
| US6214617B1 (en) | 1995-03-28 | 2001-04-10 | Kinetic Biosystems, Inc. | Centrifugal fermentation process |
| EP1025207B1 (de) * | 1997-10-25 | 2005-09-07 | Roche Diagnostics GmbH | Suspensions-verpackungszellinien für retrovirusvektoren |
| AU2001236601A1 (en) | 2000-01-31 | 2001-08-07 | Robert A. Cuneo | Methods and devices for remediation and fermentation |
| CN114196634A (zh) * | 2021-12-15 | 2022-03-18 | 香港大学深圳医院 | 一种循环肿瘤细胞系的建立方法 |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US3850748A (en) * | 1973-06-28 | 1974-11-26 | Lilly Co Eli | Method of producing animal cells in suspension culture |
-
1976
- 1976-11-03 US US05/738,515 patent/US4059485A/en not_active Expired - Lifetime
-
1977
- 1977-11-02 DE DE2749022A patent/DE2749022C2/de not_active Expired
- 1977-11-02 SE SE7712376A patent/SE432778B/sv not_active IP Right Cessation
- 1977-11-02 IT IT29257/77A patent/IT1088864B/it active
- 1977-11-02 CA CA290,090A patent/CA1093994A/en not_active Expired
- 1977-11-02 FR FR7732957A patent/FR2370095A1/fr active Granted
- 1977-11-02 JP JP13216577A patent/JPS5359091A/ja active Granted
- 1977-11-02 IL IL53281A patent/IL53281A0/xx not_active IP Right Cessation
- 1977-11-02 GB GB45501/77A patent/GB1535490A/en not_active Expired
- 1977-11-03 BE BE182290A patent/BE860413A/xx not_active IP Right Cessation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| FR2370095A1 (fr) | 1978-06-02 |
| CA1093994A (en) | 1981-01-20 |
| IT1088864B (it) | 1985-06-10 |
| GB1535490A (en) | 1978-12-13 |
| JPS5359091A (en) | 1978-05-27 |
| IL53281A0 (en) | 1978-01-31 |
| FR2370095B1 (ja) | 1980-06-06 |
| SE432778B (sv) | 1984-04-16 |
| DE2749022A1 (de) | 1978-05-18 |
| BE860413A (fr) | 1978-05-03 |
| SE7712376L (sv) | 1978-05-04 |
| DE2749022C2 (de) | 1986-10-30 |
| US4059485A (en) | 1977-11-22 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JPS629318B2 (ja) | ||
| US8741638B2 (en) | In vitro expansion of postpartum-derived cells in roller bottles | |
| JP7154525B2 (ja) | 細胞ミクロコンパートメントおよびその調製方法 | |
| Iype | Cultures from adult rat liver cells I. Establishment of monolayer cell‐cultures from normal liver | |
| Wang et al. | Bead-to-bead transfer of Vero cells in microcarrier culture | |
| JPS6219840B2 (ja) | ||
| CN110055222B (zh) | 包被液和原代肿瘤细胞的分离培养方法 | |
| Reid | [12] Cloning | |
| CN115261302B (zh) | 一种基质胶及其制备方法和应用 | |
| CN116555171A (zh) | 一种适应无载体无血清悬浮培养的猪肌肉干细胞的驯化方法、干细胞系和应用 | |
| CN111925982A (zh) | 一种应用三维细胞的人骨髓间充质干细胞培养工艺 | |
| US20060035375A1 (en) | Method for selectively culturing epithelial or carcinoma cells | |
| US20190002821A1 (en) | Methods and compositions for detaching adherent cells | |
| WO2024251234A1 (zh) | 间充质干细胞无血清培养基及其应用 | |
| CN115322964B (zh) | 一种3d培养羊膜间充质干细胞种子库构建方法 | |
| JP3982843B2 (ja) | 多孔質担体を用いた動物細胞の逐次培養方法 | |
| Matsushita et al. | Expansion and differentiation of human iPS cells in a three-dimensional culture using hollow fibers and separation of the specific population by magnetic-activated cell sorting | |
| GB2104081A (en) | Production of plasminogen activator | |
| Duvar et al. | Scale up cultivation of primary human umbilical vein endothelial cells on microcarriers from spinner vessels to bioreactor fermentation | |
| US2990335A (en) | Fluid suspension culture method for fixed tissue cells | |
| KR910007609B1 (ko) | 미립담체에 의한 b형 간염 표면항원의 연속적인 대량 배양방법 | |
| JP2026504736A (ja) | 培養方法 | |
| CN118792247A (zh) | 细胞聚集体培养基、细胞聚集体及其制备方法和应用 | |
| JPH01215281A (ja) | 動物細胞のゲル包括固定化培養方法及び装置 | |
| CN120536356A (zh) | 一种脐带间充质干细胞三维培养方法 |