JPS6311360B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 この発明は、DNA等微量自動合成装置に関し、
特にDNAまたはRNAの微量自動合成に好適な装
置を提供する。

DNAの合成法として、いわゆるホスホジエス
テル法、ホスホトリエステル法、ホスフアイト法
と改良発展がなされ、さらにこれらの方法を利用
し、固形支持体を用いる固相合成法が各種の利点
を有することから多用されるに到つている。一
方、固相合成法に用いられる反応器（反応カラ
ム）は、試薬溶液との混合・接触面からみて、固
形支持体を入れた反応器自体を振盪させるタイ
プ、同反応器に試薬溶液を循環接触させるタイプ
（特開昭56−138199号及び特開昭57−9797号）、同
反応器に多量の試薬溶液を一過性に通過させるタ
イプの３種類が知られている。しかし、いずれの
タイプも反応時間、反応効率、経済性等の観点か
ら種々の欠点がある。また、一方従来の自動合成
装置では、固形支持体の量として100mg以上用い
るスケールがほとんどであり、合成すべきDNA
の必要量、原料の保護基付ヌクレオチドなどの試
薬が高価であることなどの観点から、より小さな
スケールでの自動合成装置が望まれていた。

この発明の発明者は、種々検討の結果、公知の
自動合成装置を改良することに成功した。

１ 反応器が、 (a) 底部に排液口を有し、 (b) 内部下方にDNA等合成用の固形支持体を
載置可能でかつ試薬溶液を通過しうるフイル
タを有し、 (c) フイルタ上方に、容積80μ〜800μの反
応部空間を有し、かつ (d) 反応部空間の上方にすりばち状フランジ及
びこのフランジ用栓を、具備する容器にて構
成されてなり、 上記フランジ用栓に多数の試薬溶液等供給用
のノズルを挿着すると共に、 上記反応器に入れられた上記支持体の量に応
じた量で試薬溶液を供給しうる試薬溶液供給手
段を具備してなるDNA等微量自動合成装置が
提供される。

この発明の装置の主な特徴は、(i)反応器を振盪
させるなどの混合・接触あるいは循環のための特
別の動作を行わせる手段を不要にすること、(ii)固
体支持体として10mg〜50mg位のスケールで、また
DNAとして縮合10回位で0.3〜2μmol位のスケー
ルでの合成が可能な反応システムを提供できるこ
と、(iii)使用する試薬溶液が固体支持体の体積に対
し５〜７倍程度ですみ、かつそれに適した供給手
段を提供することにある。

以下、図に示す実施例に基いてこの発明を詳説
する。なお、これによりこの発明が限定されるも
のではない。

第１図に示す１は、この発明を適用したホスホ
トリエステル法によるDNA微量自動合成装置で
ある。

反応器２は内径８mm、高さ10mmの円筒状の本体
３の上方にすりばち状フランジ４を設けた容器で
ある。すりばち状フランジ３には、多数の試薬溶
液等供給用のノズルが挿着された栓５が装着され
ている。そこで、本体３の頭部開口が試薬溶液等
供給口６となる。本体３の内部下方にはガラスフ
イルタのごときフイルタ７が嵌着され、さらに底
部には排液口８が設けられている。フイルタ７
は、ポリスチレン、シリカビーズのごとき支持体
９を載置できる（透過させない）もので、試薬溶
液、溶媒、ガスを透過させるものである。フイル
タ７の上部空間が反応部１０になり、約450μ
の容積の空間である。

試薬溶液は全部で８種類ある。１１〜１４は各
種のヌクレオチド試薬で、それぞれ塩基としてア
デニン、シトシン、グアニン、チミンを有してい
る。１５は縮合剤で、メシチレンスルホニル―３
―ニトロトリアゾリド（MSNT）のピリジン溶
液である。３９は保護基脱離剤で、イソプロパノ
ールと塩化メチレンの混合溶媒に臭化亜鉛を溶解
した溶液である。４０はマスキング用試薬で、無
水酢酸とピリジンの混合液である。４１はマスキ
ング用試薬で、ジメチルアミノピリジンのピリジ
ン溶液である。

シリンジポンプ２１〜２５は、それぞれ切換コ
ツク１６〜２０を介して上記試薬溶液１１〜１５
を吸入し、反応器２へ供給しうる。

シリンジポンプ２１〜２５のプランジヤはそれ
ぞれプランジヤ駆動機構２６〜３０で駆動され
る。

プランジヤ駆動機構２６は、パルスモータ３１
と、それにより回転されるネジ軸３２と、そのネ
ジ軸３３の回転により移動してプランジヤ２１ａ
を上下させるナツト３３とからなつており、パル
スモータ３１はマイクロコンピユータのごとき制
御回路３４でパルス制御されている。他のプラン
ジヤ駆動機構２７〜３０も同様の構造である。

３６〜３８は溶媒で、それぞれ乾燥用揮発性溶
媒のテトラヒドロフラン（THF）、洗浄用溶媒の
ピリジン、同じく洗浄用溶媒のイソプロパノール
と塩化メチレンの混合液である。これら溶媒３６
〜３８および前記試薬溶液３９〜４１は、窒素ガ
ス圧によつてそれぞれ弁４２〜４７を介して反応
器２に供給されうる。

弁４８は、窒素ガスで反応器２内をブローする
ために、窒素ガスを直接反応器２へ供給するもの
である。なお窒素ガスは塩化カルシウムのごとき
乾燥剤４９で乾燥されている。

制御回路３４は、前述のようにプランジヤ制御
機構２６〜３０を制御する外に、切換コツク１６
〜２０、弁４２〜４８、排液弁５０および排気弁
５１の作動を制御する。また、操作卓３５を介し
てオペレータと対話を行う。

DNA合成に際しては、まず栓５をはずして反
応器２内に、DNA分子の末端部分のみを結合し
た支持体９を入れる。この量は、たとえば支持体
９がポリスチレン粉体の場合には10mg〜50mgが好
適である。栓５を元に戻した後、入れた支持体９
の量などを操作卓３５を介して制御回路３４に入
力し、ついでスタート指令を入力する。

すると制御回路３４は、弁４４，４８，５０，
５１を作動してイソプロパノールと塩化メチレン
の混合溶媒３８を反応器２に供給し、支持体９を
洗浄する。つまり、弁４４，５１を開いて溶媒３
８を供給し、弁４４，５１を閉じたのち、しばら
くおいて弁４８，５０を開いて排液し、弁４８，
５０を閉じる。これを数回行う。この洗浄のの
ち、弁４５，５１を作動して保護基脱離剤３９を
反応器２に供給し、所定時間おいたのち、弁４
８，５０を作動して排液する。

支持体９に結合されていたDNA分子の末端部
分の反応基は、あらかじめ保護基としてジメトキ
シトリチル基（DMTr）をつけられてブロツク
されているが、上記動作によつて所定部位の
DMTrが脱離される。

次に制御回路３４は、再び弁４４，４８，５
０，５１を作動してイソプロパノールと塩化メチ
レンの混合溶媒３８を反応器２に供給し、支持体
９を洗浄する。さらに弁４３，４８，５０，５１
を作動してピリジン３７で反応器２内を洗浄す
る。

ついで弁４２，４８，５０，５１を作動して
THF３６で反応器２内を洗浄し、次に弁４８，
５０を作動して窒素ガスで反応器２内を数分間ブ
ローする。これにより反応器２内は完全に乾燥さ
れる。

制御回路３４は、合成しようとするDNAの塩
基配列に基いて、異なる塩基をもつ４つのヌクレ
オチド試薬１１〜１４から１つのヌクレオチド試
薬を選択し、それに対応する切換コツクおよびプ
ランジヤ駆動機構を作動し、また排気弁５１を作
動してそのヌクレオチド試薬溶液を反応器２に供
給する。たとえば、塩基としてアデニンを持つヌ
クレオチドがDNA塩基配列として次に必要なら
ば、１１のヌクレオチド試薬溶液を選択し、切換
コツク１６およびプランジヤ駆動機構２６を作動
し、排気弁５１を作動してシリンジポンプ２１に
よつて１１を反応器２に供給する。

また同時に、切換コツク２０およびプランジヤ
駆動機構３０を作動し、シリンジポンプ２５によ
つて縮合剤１５を反応器２に供給する。

供給量は、ヌクレオチド試薬溶液と縮合剤の合
計量が支持体９を膨潤するのに充分な最低量とな
るように制御される。具体的にはたとえば支持体
９がポリスチレン粉体の場合には支持体１ｇ当り
に、ヌクレオチド試薬約３ml、縮合剤約３mlとす
る。言うまでもなく、これら最低量の試薬溶液中
に充分に試薬を含むように濃度調整しておくこと
が必要である。

上記動作によつて、支持体９に結合されていた
DNA分子の末端部分の所定部位に所望の塩基を
もつヌクレオチドが連結される。なお、そのヌク
レオチドの5′水酸基は、予め保護基のDMTrによ
りブロツクされている。

支持体９がポリスチレン粉体の場合、支持体１
ｇ当りに約0.1ｍmolのDNA分子の末端部分が結
合されており、そのほとんどには上記のように新
たなヌクレオチドが連結される。しかしながら数
％程度は未反応で残る場合がある。このため制御
装置３４は次のように未反応の5′水酸基にマスキ
ングを行う。すなわち、一定時間ののち、弁４
３，４８，５０，５１を作動してピリジン３７に
て反応器２内を洗浄する。次に、弁４６，５１を
作動してマスキング用試薬４０を反応器２に供給
する。また同時に弁４７を作動してマスキング用
試薬４１を反応器２に供給する。

上記動作によりマスキングを行つた後、制御回
路３４は、弁４３，４８，５０，５１を作動して
反応器２内をピリジン３７にて洗浄する。

ここまでの動作により、予め支持体９に結合さ
れていたDNA分子の末端部分に新たに１つのヌ
クレオチドを連結する１つのサイクルが終了す
る。

制御回路３４は、弁４４，４８，５０，５１を
作動してイソプロパノールと塩化メチレンの混合
溶媒３８を供給する前記保護基脱離動作から上記
マスキング動作までの合成サイクルを繰返し、操
作卓３５で入力された目的DNAを合成する。

さて、上記実施例のDNA合成装置１によれば、
従来と異なつて、試薬溶液１１〜１５は常に支持
体の量に基いて算出される最低量で供給されて、
かつ混合・接触操作は行われない。そこで試薬消
費量が節約されると共に混合・接触操作用の装置
も不要になつている。

このように改良したのは、反応器２の反応部１
０を小型化すると共に、フイルタ７の上に支持体
９を載置し、上方から試薬溶液１１〜１５を供給
し、底部から排液するようにしたためである。す
なわち排液弁５０を閉じたまま試薬溶液を上方か
ら供給すれば、その試薬溶液は支持体９に含まれ
てこれを膨潤すると共にフイルタ７より上の反応
部１０内にとどまつて下方へ落ちない。従つて、
供給した全ての試薬溶液が反応に参加し、デツド
スペースに溜まるものが無くなる。この結果、供
給量は最低量で充分になり、高価な試薬が節約で
き、かつ反応器への付着等による試薬のロスがさ
けられて経済上のメリツトをもたらす。また混
合・接触操作も無用になり、混合のための装置が
節約できる。

加えて、反応器は、反応部空間の上方にすりば
ち状に広がるフランジがあるため、DNA合成に
必要な試薬溶液、溶媒等の供給用の多数のノズル
を設置できるとともに、フランジ内壁を伝つて、
溶液等が反応部に導入され易く、試薬のロスがさ
けられることになる。

なお、新たなヌクレオチドを連結する反応の前
に反応器２内を完全に乾燥させて縮合反応器を阻
害する水分をとり、反応効果を上げることも試薬
の節約に役立つている。

変形実施例としては、反応部１０の容積を80μ
〜800μの間で変化したものが挙げられる。

他の実施例としては、ホスホモノトリアゾリド
法やホスフアイト法、あるいはホスホジエステル
法によるDNA等合成装置にこの発明を適用した
ものが挙げられる。

固体支持体９の他の例としては、Kel―Ｆ・ｇ
スチレン、シリカゲル、ポリアクリルモルフオリ
ドなどがある。これらの支持体は粒径30〜300μ
ｍ程度のものが好ましい。

以上の説明から理解されるように、この発明の
DNA等微量自動合成装置によれば、高価な合成
用試薬の無駄な消費が抑えられてランニングコス
トが安価になる効果がある。また、混合・接触操
作も不要となる。さらに、必要量だけの微量合成
ができ、無駄がない。

【図面の簡単な説明】

第１図はこの考案のDNA等自動微量合成装置
の一実施例であるDNA微量自動合成装置の構成
説明図である。 １…DNA微量自動合成装置、２…反応器、３
…本体、４…フランジ部、６…試薬溶液等供給
口、７…フイルタ、８…排液口、９…支持体、１
０…反応部、１１〜１５，３９〜４１…試薬溶
液、１６〜２０…切換コツク、２１〜２５…シリ
ンジポンプ、２６〜３０…プランジヤ駆動機構、
３４…制御回路、３６〜３８…溶媒、４２〜４
８，５０，５１…弁。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 反応器が、 (a) 底部に排液口を有し、 (b) 内部下方にDNA等合成用の固形支持体を載
   置可能でかつ試薬溶液を通過しうるフイルタを
   有し、 (c) フイルタ上方に、容積80μ〜800μの反応
   部空間を有し、かつ (d) 反応部空間の上方にすりばち状フランジ及び
   このフランジ用栓を、具備する容器にて構成さ
   れてなり、 上記フランジ用栓に多数の試薬溶液等供給用の
   ノズルを挿着すると共に、 上記反応器に入れられた上記支持体の量に応じ
   た量で試薬溶液を供給しうる試薬溶液供給手段を
   具備してなるDNA等微量自動合成装置。