JPS6315554B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明はヒトまたは動物の細胞または体液中の
成分と特異的に結合する免疫学的に活性な微粒子
の製造法に関する。 抗原と抗体との反応を利用してそのいずれか一
方を免疫学的に検出または定量する場合に、測定
したい物質に結合する側の物質を適当な大きさの
粒子に固定化させておき、その粒子が被測定物質
の存在下で凝集を起こす現象を利用して高感度の
測定を行なう方法は免疫学的臨床検査の重要な手
段となつている。また逆に測定したい物質を粒子
に固定化しておき、その被測定物質と特異的に反
応する抗原または抗体の存在による被測定物質固
定粒子の凝集が、被検液中の被測定物質の存在に
より阻止されることにより被測定物質を検出また
は定量する方法も免疫学的臨床検査において広く
用いられている。また特定の細胞と選択的に結合
する物質を微粒子表面に固定化しておき、その粒
子が細胞に結合するか否かによつて細胞の標識を
行なう方法も免疫学的検査または細胞学的検査の
手段としてしばしば採用される。 凝集反応用の担体として広く使用されている粒
子としてはヒトを含む哺乳動物や鳥類の赤血球、
カオリンや炭素など無機物の粒子、天然ゴムラテ
ツクスやポリスチレンなどの有機高分子化合物の
ラテツクスが知られている。赤血球は多種類の抗
原・抗体を固定化することが可能で応用範囲が最
も広い。しかし採取する動物個体によつて差があ
ること、安定性に難があり保存が難かしいこと、
またヒト血清により非特異的に凝集する場合があ
ることなどの問題点がある。非生物由来の粒子と
して最も広く用いられるポリスチレン粒子は合成
高分子化合物であり、品質を一定にすることが可
能でまたそれ自体では安定である。ポリスチレン
は疎水性で種々の蛋白質を吸着する性質があるた
め、通常ポリスチレンへの抗原または抗体の固定
化は物理吸着によつて行なわれる。しかし物理吸
着によつて抗原または抗体を固定化した場合には
固定化した抗原（または抗体）と遊離の抗原（ま
たは抗体）との間に平衡が存在するため、測定の
目的物質である対応する抗体（または抗原）に対
して粒子に固定化した抗原（または抗体）と遊離
の抗原（または抗体）との間に競争反応が起こ
り、この競争反応は凝集に対して抑制的に作用す
る。その結果、多くの例において感度と安定性の
不足が指摘されている。また当然のことながらポ
リスチレンに対して物理的に吸着されにくい物質
は固定化することができない。これらの問題点の
ためにポリスチレン粒子の凝集反応は赤血球を担
体とする場合に比較して限られた範囲でしか実用
に供されていない。そこで抗原または抗体を共有
結合によつて粒子に固定化することにより上記問
題点の解決を図ることが検討された。例えば
DT2649218においては、スチレン−メタクリル
酸共重合体ラテツクスにヒト絨毛性ゴナドトロピ
ンをカルボジイミドを使用して結合することが記
載されている。また特公昭53−12966にはカルボ
キシル化スチレン−ブタジエン、カルボキシル化
ポリスチレン、アミノ基をもつカルボキシル化ポ
リスチレン、アクリル酸ポリマー、アクリロニト
リルポリマー、メタクリル酸ポリマー、アクリロ
ニトリル−ブタジエン−スチレンコポリマー、ポ
リ酢酸ビニルアクリレート、ポリビニルピリジン
及び塩化ビニル−アクリレートコポリマーなど
種々のラテツクスポリマーにヒト絨毛性ゴナドト
ロピン、ヒト血清アルブミンまたは変性ガンマグ
ロブリンをアミド結合して縮合させた粒径0.01〜
0.9ミクロンの粒子が免疫学的診断試薬として使
用できると述べられている。さらに臨床病理27、
補冊、522頁（1978）にはメタクリル酸、２−ヒ
ドロキシエチルメタクリレートおよびメチルメタ
クリレートを共重合して製造したヒドロキシル基
およびカルボキシル基を含有するメチルメタクリ
レート系ラテツクスにトレポネーマ抗原を臭化シ
アノゲンまたはカルボジイミド法で結合させる方
法が述べられている。また特公開昭55−110118に
はポリスチレン粒子を芯としてそれをスチレン−
グリシジルメタクリレート共重合体の外皮で被覆
したラテツクスの遊離エポキシ基とヒト絨毛ゴナ
ドトロピン又はインシユリンを反応させて、それ
らをラテツクスに結合させた試薬が提案されてい
る。これら先行技術においてはカルボジイミドに
より免疫活性物質を粒子に結合させる方法が多用
されているが、カルボジイミドを使用すると免疫
活性物質分子間および分子内の縮合反応を惹起す
る。これはのぞましくない副反応であつて免疫活
性物質の活性を損なうものである。臭化シアノゲ
ンを用いれば免疫活性物質分子間および分子内の
縮合反応を回避することはできるが、この場合に
はヒドロキシル基を有する重合体と臭化シアノゲ
ンとの反応の再現性を得ることが難かしく、その
結果免疫活性物質を固定化した粒子の免疫活性が
変動しやすい。これらの免疫活性物質固定化法に
比較して重合体に導入された遊離エポキシ基と蛋
白質又はポリペプチドを反応させる方法は免疫活
性の失活も少なく再現性も良好である。しかしエ
ポキシ基を利用する上記先行技術においては、予
め作成したポリスチレンのような硬質重合体微粒
子の存在下にエポキシ基含有単量体とスチレンな
どの疎水性単量体を共重合することによつて、硬
質重合体からなる芯をエポキシ基含有単量体の共
重合体からなる外皮で被覆するという担体微粒子
の製造方法を採用している。そのため免疫活性物
質固定化後においても粒子表面に疎水性部分が露
出しており蛋白質を非特異的に吸着する傾向があ
る。 一般にヒト又は動物の体液中には多種類の蛋白
質が含まれ、とくに血漿又は血清中にはこれが高
濃度で含有されている。検体体液から蛋白質が担
体粒子に吸着されると、それが目的とする抗原−
抗体反応などの免疫学的反応に干渉し、凝集反応
の選択性や感度の低下をもたらすおそれがある。
本発明者らはこれらの問題点を解消することを目
的に検討を行なつた結果本発明に到達した。 本発明はグリシジルアクリレートまたはグリシ
ジルメタクリレートを、単量体は溶解するが生成
重合体は沈殿析出するような媒体中で重合させる
ことによつて、平均直径0.03ないし10μｍの微粒
子状重合体を沈殿析出させ、次いで該微粒子状重
合体とアミノ基を有する免疫活性物質を反応させ
ることを特徴とする免疫活性物質の製造方法より
なるものである。 本発明方法によれば免疫学的検査に適した直径
を有し、しかも粒径分布の狭い遊離エポキシ基含
有担体微粒子を１段階で製造することができる。
次いで免疫活性物質のアミノ基と微粒子表面の遊
離エポキシ基との反応によつて生成する共有結合
によつて、免疫活性物質が担体微粒子上に固定化
される。免疫活性物質との反応によつて遊離エポ
キシ基が全部消費されずに活性を有するまま残存
する可能性がある場合には血清アルブミン、ゼラ
チンなど目的とする免疫学的検査に干渉しない親
水性蛋白質を遊離エポキシ基と反応させることに
よつて、エポキシ基の反応性を失わせることがで
きる。その際エポキシ基消去用の親水性蛋白質は
固定化の目的である免疫活性物質と混合して同時
に反応させてもよく、また免疫活性物質を先に単
独で反応させた後に反応させてもよい。また上記
アルブミンやゼラチンなどの親水性蛋白質の代り
にグリシン、アラニンなどのアミノ酸を用いるこ
とも可能である。 グリシジルアクリレートとグリシジルメタクリ
レートとの混合割合は任意であり、いずれか一方
のみを単独で使用してもよい。 架橋剤を重合系に添加することは必須ではない
が、通常重合に当つて重合性炭素炭素二重結合を
分子内に２基以上含む多官能性単量体を添加して
積極的に重合体を架橋させることがのぞましい。
そのような目的で重合系に添加するに適した多官
能性単量体は多数存在するが、若干例をあげれ
ば、ジビニルベンゼン、エチレングリコールジメ
タクリレート、ジエチレングリコールジメタクリ
レート、ポリエチレングリコールジメタクリレー
ト、Ｎ，N′−メチレンビスアクリルアミド、コ
ハク酸ジビニル、コハク酸ジアリル、メタクリル
酸ビニル、メタクニル酸アリル、トリアリルシア
ヌレート、トリアリルイソシアヌレートなどであ
る。架橋剤の添加量は通常全単量体中の30モル％
以下である。また架橋結合は重合反応後生成重合
体の反応性を利用してこれを多官能化合物と反応
させることによつて導入することもできる。例え
ば生成重合体に含まれるエポキシ基とエチレンジ
アミンなどのジアミンとを反応させることにより
重合体を架橋させることができる。 重合に当つてはさらに他の共重合成分を加える
ことがしばしば好ましい結果をもたらす。共重合
成分添加の効用は粒径の調節である。共重合成分
としてのぞましいのは親水性単量体であり、とく
に水溶性単量体がのぞましい。共重合に用いる水
溶性単量体として適当なものは、例えば２−オキ
シエチルアクリレート、２−オキシエチルメタク
リレート、２−オキシプロピルアクリレート、２
−オキシプロピルメタクリレート、重合度２ない
し25のポリエチレングリコールモノアルキルエー
テルのアクリル酸エステル又はメタクリル酸エス
テル、アクリルアミド、メタクリルアミド、Ｎ−
ビニルピロリドン、グリセロールメタクリレート
などである。これらの水溶性単量体は２種以上併
用してもよい。これら水溶性単量体を共重合した
場合には、免疫活性物質を固定化した後に、重合
体微粒子表面で何らの結合物によつて覆われるこ
ともなく露出しているのは、水溶性単量体に由来
する親水性部分である。蛋白質は水性媒体中では
親水性重合体には吸着しにくいので、本発明によ
る免疫活性物質固定化微粒子は、検体体液に対し
て安定で非特異的凝集を起こしにくく、また細胞
に対する非特異的付着がない。グリシジルアクリ
レートとグリシジルメタクリレートの和に対する
共重合成分の和の比率はモル比で100：０ないし
５：95の範囲で変えることができる。 重合反応は単量体は容易に溶解するが、重合に
より生成する重合体は溶解せずに微粒子状に析出
するような媒体中で行なわれる。このような媒体
としては、例えば酢酸エチル、酢酸ｎ−プロピ
ル、酢酸イソプロピル、酢酸ブチル各異性体およ
びプロピオン酸の上記相当エステルなどのエステ
ル類、メチルエチルケトン、メチルｎ−プロピル
ケトン、メチルイソプロピルケトン、メチルブチ
ルケトン各異性体などのケトン類、ベンゼン、ト
ルエン、ｏ−キシレン、ｍ−キシレン、ｐ−キシ
レンなどである。 かかる方法で得られる重合体微粒子の粒径は均
一性にすぐれており、その平均直径は0.03μｍな
いし10μｍの範囲内にある。平均直径は単量体の
組成および重合媒体の選択によつて調節すること
が可能である。またかかる方法すなわち沈殿重合
法は乳化重合や懸濁重合の場合と異なつて、乳化
剤や懸濁安定剤を使用しないので、重合後これら
の添加剤を除去する必要がないのも利点の一つで
ある。 重合開始剤としては通常のラジカル重合開始
剤、例えば２，2′−アゾビスイソブチロニトリ
ル、２，2′−アゾビス（２，４−ジメチルバレロ
ニトリル）、２，2′−アゾビス（２，４−ジメチ
ル−４−メトキシバレロニトリル）、などのアゾ
化合物、過酸化ベンゾイル、ジラウロイルパーオ
キサイド、ジ−tertブチルパーオキサイドなどの
過酸化物を用いることができる。重合温度も通常
のラジカル重合の温度範囲でよく、20℃ないし80
℃がとくに好ましい。重合開始剤の重合混合液中
の濃度は、通常0.001ない0.03モル／程度であ
る。単量体の重合混合液中の濃度は通常５ないし
50重量％の範囲が好ましい。単量体濃度が50重量
％を超えると生成する重合体粒子が凝集する傾向
がある。また単量体濃度が５重量％未満でも本発
明は実施可能であるが、得られる重合体微粒子が
少なくなるので生産性が低くなる。なお重合は窒
素またはアルゴンなどの不活性ガスで置換して行
なうのがのぞましい。 粒子の形状は多くの場合球形であることは必要
条件ではなく不規則な形状であつても差し支えな
い。不規則な形状の粒子の直径は最大径と最小径
の和の1/2とする。平均直径は式(1)によつて定義
されるによつて表わされる。 ＝_N 〓ⁱ⁼¹ d_i／Ｎ ………(1) ただしd_iはｉ番目の粒子の直径、Ｎは粒子の総
数である。凝集反応が判定しやすいのは経験的に
平均直径が0.1μｍ以上10μｍ以下の場合である。
また細胞標識の目的には平均直径は0.03μｍ以上
5μｍ以下の範囲が好ましい。また染料ないし顔
料により適当に着色した粒子は凝集反応、細胞標
識いずれの目的に対しても好都合である。また細
胞標識に対しては螢光を付与した粒子も好まし
い。 免疫活性物質の微粒子への固定化反応は水性媒
体中で行ない、PHは7.0〜9.0、温度は０℃〜40℃
の範囲が適当である。反応液中の免疫活性物質の
濃度は個々の免疫活性物質の性質によつて増減す
る必要があり一律には決められない。その際すで
に述べたように血清アルブミン、ゼラチンなどの
親水性蛋白質を反応液に添加することはしばしば
免疫活性物質固定化微粒子の分散安定性を改良す
る上で有効である。また固定化反応後にグリシ
ン、アラニンなどのアミノ酸で処理することもし
ばしば同様に好ましい効果をもたらす。 本発明において使用する免疫活性物質はアミノ
基を有することが必要であるが、免疫活性物質の
大部分は蛋白質であるかまたはポリペプチド部分
を含んでいるのでその条件に適合する。ここで免
疫活性物質とは抗原および抗体のみでなく、補
体、Fcレセプター、C3レセプターなど液性免疫
反応ないし細胞性免疫反応に関与してある物質に
特異的に結合する物質を意味するものとする。具
体例を若干あげれば、梅毒トレポネーマ抗原、Ｂ
型肝炎表面抗原（HBs抗原）、Ｂ型肝炎表面抗原
に対する抗体（抗HBs抗体）、風疹抗原、トキソ
プラズマ抗原、ストレプトリジンＯ、抗ストレプ
トリジンＯ抗体、マイコプラズマ抗原、ヒト絨毛
ゴナドトロピン（HCG）、抗HCG抗体、熱凝集
ヒトIgG、リウマチ因子、核蛋白、DNA、抗
DNA抗体、Ｃ反応性蛋白（CRP）、抗CRP抗体、
抗エストロゲン抗体、α−フエトプロテイン（α
−FP）、抗α−FP抗体、癌胎児性抗原（CEA）、
抗CEA抗体、C1q、抗C1q抗体、C3、抗C3抗体、
抗C3b抗体、抗C3b_i抗体、C4、抗C4抗体、プロ
テイン−Ａ、コングルチニン、イムノコングルチ
ニンなどである。 実施例 １ グリシジルメタクリレート、２−オキシエチル
メタクリレートおよびエチレングリコールジメタ
クリレートの３者を85.7：9.5：4.8のモル比で混
合し、その単量体混合物24部（重量、以下同じ）、
プロピオン酸エチル76部および２，2′−アゾビス
（２，４−ジメチル−４−メトキシバレロニトリ
ル）0.13部（4.7ｍmol／）の混合物を窒素ガス
雰囲気下40℃で３時間重合させた。白濁した重合
混合物をアセトンに注ぎ、1500×ｇで10分間遠心
分離し、沈降した粒子をエタノールで再分散して
洗浄、次いで再び遠心分離した。減圧下に乾燥し
て微粒子状重合体11.3部を得た。この微粒子状重
合体は球形でその直径は1.8μｍと4.2μｍの間にあ
り平均3.3μｍ、標準偏差は0.45μｍであつた。 上記のようにして調製した重合体状微粒子に
TP抗原を下記のようにして固定化した。先ず梅
毒病原体Treponema pallidum（以下TPと略記）
Nichols株菌体成分をリン酸塩緩衝生理食塩水
（リン水素２ナトリウム＋リン酸水素１カリウム
0.01mol／、塩化ナトリウム0.14mol／、PH
7.2、以下PBSと略記）の中に10⁹cell／mlの割合
で分散させた分散液を氷水で冷却しながら10KHz
の超音波で20分間処理して菌体を破壊し、これを
TP抗原液とした。このTP抗原液１容とウシ血清
グリコプロテインを１mg／mlの濃度でPBSに溶
解した溶液３容とを混合し、その混合液１mlと前
記重合体50mgをPSB1mlに分散した分散液とを混
合して30℃で２時間撹拌した。次に遠沈により微
粒子を分離してPBSで遠沈により３回洗浄した
後、ウシ血清アルブミン（以下BSAと略記）を
１％添加したPBS20mlに分散した。このTP抗原
固定化粒子分散液を３日間４℃の冷蔵庫中で放置
した後、下記のようにして活性を検定した。 Ｕ字型管底を有するポリスチレン製のマイクロ
タイタープレートに、TPHA力価640の梅毒陽性
血清希釈液を希釈倍率10倍を起点とする2ⁿ希釈系
列で各50μずつ入れた。ただし希釈用液として
はPBSにBSAを１％、梅毒補体結合反応用ライ
ター抗原溶液KW（日本凍結乾燥研究所）を５％、
塩化アンモニウムを0.73mol／の濃度で添加し
た溶液を使用した。またコントロールとして梅毒
陰性血清についても同様の希釈液をマイクロタイ
タープレートに入つた。次に血清希釈液の入つて
いるマイクロタイタープレートの各穴にTP抗原
固定化微粒子分散液を各50μずつ加え、３分振
盪して両液を混合した後室温で２時間静置し、沈
降像によつて凝集の程度を判定した。その結果は
表１の通りでTPHA以上の感度で血清中の梅毒
抗体を検出できることがわかる。

【表】 実施例 ２ １mg／mlの濃度のヒトIgG／PBS溶液0.4mlと
１mg／mlの濃度のウシ血清グリコプロテイン／
PBS溶液1.6mlとを混合し、その混合液に、実施
例１に使用したのと同じ重合体微粒子50mgを分散
させ、30℃で３時間撹拌した。この反応混合物を
４℃の冷蔵庫中で１夜放置した後遠沈により
PBSで洗浄し、BSAを１％添加したPBS4mlに微
粒子を再分散させ、30℃で２時間撹拌した後、４
℃の冷蔵庫に１夜放置した。このようにしてヒト
IgGを固定化した重合体微粒子と抗ヒトIgG抗体
とを次のようにして反応させた。すなわち顕微鏡
用スライドグラス上で抗ヒトIgG抗血清（ヤギ）
IgG分画のPBS溶液10μと上記ヒトIgG固定化
微粒子分散液10μとを混合し、３分後の凝集状
態を肉眼で判定した。その結果を表２に示す。抗
ヒトIgG抗体の検出限界は約10nｇ／mlであるこ
とがわかる。

【表】 実施例 ３ ５mg／mlの濃度のBSA／PBS溶液２mlに実施
例１で使用したものと同じ重合体微粒子を分散さ
せ、30℃で７時間撹拌した後４℃の冷蔵庫に１夜
放置した。次いで遠沈によりPBSで洗浄し、ヒ
ト血清アルブミンを0.5％添加したPBS4mlに微粒
子を再分散し、30℃で１時間撹拌してから４℃の
冷蔵庫に１夜放置した。このようにしてBSAを
固定化した重合体微粒子と抗BSA抗血清（ウサ
ギ）とを実施例２と同様にしてスライドグラス上
で反応させた結果は表３の通りであつた。抗
BSA抗体検出限界は0.1μｇ／mlであることがわ
かる。

【表】 実施例 ４ グリシジルメタクリレート、２−オキシエチル
メタクリレートおよびエチレングリコールの３者
の混合比を71.4：23.8：4.8（モル比）に変えた以
外は実施例１と全く同様にして重合し、平均直径
1.0μｍの微粒子10.8部を得た。この重合体微粒子
を用いて実施例３の場合と全く同様にしてBSA
を固定化した。実施例３と同様にしてスライドグ
ラス上で抗BSA抗血清と反応させた結果は実施
例３の場合と全く同等で、抗BSA抗体検出限界
は0.1μｇ／mlであつた。 実施例 ５ グリシジルメタクリレート、２−オキシプロピ
ルメタクリレートおよびトリエチレングリコール
メタクリレートを47.6：47.6：4.8（モル比）の比
率で混合し、その単量体混合物24部、メチルｎ−
プロピルケトン76部および２，2′−アゾビス
（２，４−ジメチル−４−メトキシバレロニトリ
ル）0.13部（4.7ｍmol／）の混合物をアルゴン
雰囲気下40℃で３時間重合させた。白濁した重合
混合物を実施例１と同様に処理して重合体微粒子
8.4部を得た。平均直径は2.5μｍであつた。この
重合体微粒子を0.5％ヒト血清アルブミン水溶液
中に重合体含量が1.25％になるように分散し、実
施例３と同様にしてBSAを固定化した。そして
実施例３と同様にして抗BSA抗血清とスライド
グラス上で反応させた。その結果を表４に示す。

【表】 実施例 ６ グリシジルメタクリレートの代りにグリシジル
アクリレートを使用しグリシジルアクリレート、
２−オキシエチルメタクリレートおよびトリエチ
レングリコールジメタクリレートの混合比を
23.8：714：4.8（モル比）にした以外は実施例５
と同様にして重合し、平均直径約1μｍの重合体
微粒子7.2部を得た。実施例５と全く同様にして
BSAを重合体微粒子に固定化し、実施例５と同
様にして抗BSA抗血清と反応させた。その結果
は実施例５の場合と同等で、抗BSA抗体検出感
度は約10μｇ／mlであつた。 実施例 ７ 実施例１の２−オキシエチルメタクリレートの
代りに２−オキシエチルアクリレートを使用した
以外は実施例１と全く同様にして重合し、平均直
径約3μｍの重合体微粒子9.5部を得た。この重合
体微粒子に実施例１と同様にしてTP抗原の固定
化を行ない活性を検定した結果、血清中の梅毒抗
体検出感度は実施例１の場合と同等であつた。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ グリシジルアクリレートまたはグリシジルメ
   タクリレートを、単量体は溶解するが生成重合体
   は沈殿析出するような媒体中にて重合させること
   によつて、平均直径0.03ないし10μｍの微粒子状
   重合体を沈殿析出させ、次いで該微粒子状重合体
   とアミノ基を有する免疫活性物質を反応させるこ
   とを特徴とする免疫活性微粒子の製造方法。