【発明の詳細な説明】
本発明はモルテイエレラ属の糸状菌を炭化水素
を炭素源とする培地に培養し、培養物よりγ−リ
ノレン酸含量の高い脂質〔中性脂質（油脂など）、
極性脂質（リン脂質、糖脂質）〕を製造する方法
に関するものである。
現在までに報告されているγ−リノレン酸を含
む微生物としてはムユール．グロボサス（全脂肪
酸に対する含リノレン酸含量：中性脂質12.3％、
極性脂質25.7％、以下、単に中性脂質と極性脂質
の含量を示す）、ムユール．プシルス（中性脂質
1.5％、極性脂質1.4％）〔R.O.Mumma etal，
Lipids，６，584（1971）〕、ユアネホラ・ククルビ
タルム（全脂質10.8％）〔H.B.White，Jr.S.S.
Rowell，Biochim.Biophys.Acta，116，388
（1966）〕、ピチウム・テバリアナム（全脂質4.5
％）、サプロレグニア．リトラリス（全脂質2.8
％）、リゾパス．ストロニフア（全脂質15.6％）、
リゾパス．アルヒザス（全脂質9.8％）、ピユミセ
ス．ブラケエスレアヌス（全脂質5.4％）、ムユー
ル．ジヤバニカス（全脂質13.7％）、ヘリユステ
イルム．ピリホルメ（全脂質8.5％）〔R.Shaw，
Biochim，Biophys.Acta，98，230（1965）〕、エ
ントモフトラ．コロナタ（全脂質2.2％）〔R.O.
Mumma，Ｔ，E.BruszewsKi，Lipids，５，915
（1970）〕等が知られているが、これらはいずれも
炭素源が炭水化物であり、含量も極性脂質で一部
高い値が出ているが、全脂質でのγ−リノレン酸
含量は多くて10.数％に過ぎない。
本発明はγ−リノレン酸含量の高い脂質を生産
する糸状菌について研究した結果、モルテイエレ
ラ属に属する特定の糸状菌が炭水化物を炭素源と
した培地では、窒素源濃度、培養温度等を変えて
培養を行つても、菌体内の全脂肪酸中に含まれる
γ−リノレン酸の含量が一般には５％以下であ
り、多くて10％程度あつたのに対して、炭化水素
を炭素源とした培地で培養した菌体では、γ−リ
ノレン酸含量が一般的に全脂質の脂肪酸組成の23
％以上、極性脂質では40％という高い値に達する
脂質を生産することを見出し、本発明は完成する
に到つた。
すなわち、本発明はモルテイエレラ属に属する
特定の糸状菌を炭化水素を炭素源とする培地に培
養し、培養物によりγ−リノレン酸含量の高い脂
質〔中性脂質（油脂など）、極性脂質（リン脂質、
糖脂質）〕を製造する方法である。
本発明の使用菌は、モルテイエレラ
（Mortierella）属のラマニアナ・アングリスポラ
（ramaniana var.anglispora）〔IFO.8187〕であ
る。
なお、上記した菌は財団法人発酵研究所に保存
され、IFOカタログ（菌株目録）に記載されてい
る糸状菌である。
上記糸状菌を培養する培地の炭素源である炭化
水素としては、例えばケロセン（ｎ−デカン80％
含有）、ｎ−アルカン（C10〜C15）、ｎ−デカン、
ウンデカン、ヘキサデカン、ペンタデカンなどが
用いられる。炭化水素は培地１中に10〜30ml用
いるのが好ましい。また窒素源としては、例えば
NH4NO3，（NH4）2SO4などのような無機窒素源、
または尿素、ペプトン、酵母エキス、コーン・ス
チーブ・リカーなどの有機窒素源が用いられる。
無機塩としては、例えばKH2PO4，K2HPO4，
NaCl，FeSO4・7H2O，MgSO4・7H2O，
ZnSO4・7H2Oなどが用いられる。その他必要に
応じて微量要素、その他の栄養源を添加する。
上記糸状菌の培養は通常液体培地で静置培養、
振とう培養、通気撹拌培養などにより行われる。
培地のPHは4.0〜6.0が良く、通常10〜33℃で５日
〜30日培養が行われる。かくして、培養物中にγ
−リノレン酸含量の高い脂質が生産されるので、
培養物から脂質を採取する脂質の採取にあたつて
は、脂質が糸状菌の菌体中に含まれるので、培養
物より菌体を分離し、この菌体より脂質を採取す
るのが好適である。脂質の採取は常法に従つて例
えば溶媒抽出などによつて行われる。
かくして、本発明によれば、炭化水素を炭素源
としてγ−リノレン酸含量の高い脂質を生成する
ことが可能になる。γ−リノレン酸〔18：３（６，
９，12）〕はリノール酸と共に哺乳動物では体内
で合成することのできない、食飼として要求され
る脂肪酸（必須脂肪酸）である。これはγ−リノ
レン酸が体内でビスホモ−γ−リノレン酸とな
り、さらにはアラキドン酸となる前駆体であるこ
と、ビスホモ−γ−リノレン酸、アラキドン酸は
それぞれプロスタグランジン、E1，E1d及びE2，
E2dとなり生体中で極めて重要な生理的な役割を
はたしているからである。植物種子などから生産
されるリノレン酸はα−リノレン酸〔18：３（９，
12，15）〕が大部分を占めており、γ−リノレン
酸を生産するものは少なく、この意味でγ−リノ
レン酸含量の多い脂質の生産はγ−リノレン酸の
生産という意味においても重要な意義を持つてい
る。
次に本発明の実施例を示すが、本発明はこれに
より制限を受けるものではない。
実施例 １
ｎ−デカン12.5ml、KH2PO4 2g、MgSO4・
7H2O 0.3g、NaCl 0.1g、FeSO4・7H2O 10mg、
CaCl2・2H2O 10mg、CuSO4・5H2O 0.2mg、
ZnSO4・7H2O 1.0mg、MnCl2・4H2O 1.0mg、
Thiamine−HCl ２mg、Ｄ−Biotin 0.02mgと窒
素源としてNH4NO3 0.91g、〔Ｃ／Ｎ比（ｎ−デ
カン中の炭素原子重量／窒素源中の窒素原子重
量）は24.1〕を脱イオン水1000mlに混合し、PHを
4.6に調整した。この合成培地400mlを１の三角
フラスコに入れ、それぞれ菌株を接種し、所定の
温度で所定の期間150rpmで振とう培養を行つた。
培養後、ロ過法あるいは遠心分離法で菌体を集め
た。その一部を含水率の定量の為、精秤し、恒温
槽中120℃で一昼夜乾燥し、含水率を求め、残り
の菌体について脂質の抽出を行つた。菌体からの
脂質の抽出は、残り湿菌体にクロロホルム−メタ
ノール（２：1v／ｖ）混液を加え、ガラスビー
ズ存在下にホモジナイズすることにより菌体の破
砕と脂質の抽出を同時に行つた。なお、抽出を完
全に行うため、これを５回繰返し、全抽出液を集
めた。上記抽出液をFlochの分配洗浄法により精
製した後、溶媒を減圧留去し、重量法で全脂質量
を測定した。
菌体から抽出し、精秤した生成脂質は一部を取
りメチルエステル化の後、ガスクロマトグラフイ
ーにより脂肪酸組成を分析した。残りの脂質につ
いて、ユニシルを充填剤とし、クロロホルム及び
メタノールを展開溶剤とするカラムクロマトグラ
フイーにより中性脂質と極性脂質に分離し、それ
ぞれの存在量を求めると共に、それぞれの脂質に
ついてもガスクロマトグラフイーを行い、脂肪酸
組成を求めた。このような方法により求めた各種
モルテイエレラ属糸状菌の脂質生成量とγ−リノ
レン酸含量を次表に示した。
この表−１の結果から、モルテイエラ属のラマ
ニアナ・アングリスポラは、他のモルテイエラ属
菌に比較し、菌体に対する全脂質生産量が高く、
かつγ−リノレン酸生産割合も高いことから、効
率的にγ−リノレン酸を生産することができる。
【表】DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION The present invention involves culturing filamentous fungi of the genus Morteierella in a medium containing hydrocarbons as a carbon source, and culturing lipids [neutral lipids (oils, etc.),
The present invention relates to a method for producing polar lipids (phospholipids, glycolipids). Muyur is a microorganism containing γ-linolenic acid that has been reported to date. Globosus (linolenic acid content relative to total fatty acids: neutral lipids 12.3%,
Polar lipids 25.7% (hereinafter simply the content of neutral lipids and polar lipids), Muyur. pusillus (neutral lipid
1.5%, polar lipids 1.4%) [ROMumma etal,
Lipids, 6 , 584 (1971)], Euanephora cucurbitarum (total lipids 10.8%) [HBWhite, Jr.SS
Rowell, Biochim. Biophys. Acta, 116 , 388.
(1966)], Pythium tevarianum (total lipid 4.5
%), Saprolegnia. litoralis (total fat 2.8
%), Rhizopus. Stronifa (15.6% total fat),
Rhizopus. Alhizas (9.8% total fat), Piymyces. Brakeethreanus (total fat 5.4%), Muyur. J. jabanica (total fat 13.7%), Heliyusteilum. Piriforme (total fat 8.5%) [R.Shaw,
Biochim, Biophys. Acta, 98 , 230 (1965)], Entomophthora. Coronata (2.2% total fat) [RO
Mumma, T., E. BruszewsKi, Lipids, 5 , 915
(1970)], but in all of these, the carbon source is carbohydrate, and the content is high in some polar lipids, but the γ-linolenic acid content in all lipids is high. 10. Only a few percent. As a result of research on filamentous fungi that produce lipids with a high content of γ-linolenic acid, the present invention found that certain filamentous fungi belonging to the genus Morteierella can be cultured in a medium using carbohydrates as a carbon source by changing the nitrogen source concentration, culture temperature, etc. Even when using a medium containing hydrocarbons as a carbon source, the content of γ-linolenic acid in the total fatty acids within the bacterial cells was generally less than 5%, and was around 10% at most. In cultured bacterial cells, the γ-linolenic acid content is generally 23% of the fatty acid composition of total lipids.
The present invention has been completed based on the discovery that lipids can be produced at a high value of 40% for polar lipids. That is, the present invention cultivates a specific filamentous fungus belonging to the genus Morteierella in a medium containing hydrocarbons as a carbon source, and the culture produces lipids with a high content of γ-linolenic acid [neutral lipids (fats and oils, etc.), polar lipids (phosphorus, etc.)]. lipids,
glycolipids)]. The fungus used in the present invention is ramaniana var. anglispora [IFO.8187] belonging to the genus Mortierella. The above-mentioned bacteria are filamentous bacteria stored at the Fermentation Research Institute and listed in the IFO catalog (strain inventory). Hydrocarbons that are carbon sources for the medium for culturing the filamentous fungi include, for example, kerosene (n-decane 80%
), n-alkane (C 10 - C 15 ), n-decane,
Undecane, hexadecane, pentadecane, etc. are used. It is preferable to use 10 to 30 ml of hydrocarbon in medium 1. In addition, as a nitrogen source, for example,
Inorganic nitrogen sources such as NH4NO3 , ( NH4 ) 2SO4 , etc.
Alternatively, organic nitrogen sources such as urea, peptone, yeast extract, corn stave liquor, etc. are used.
Examples of inorganic salts include KH 2 PO 4 , K 2 HPO 4 ,
NaCl, FeSO4・7H2O , MgSO4・7H2O ,
ZnSO 4 .7H 2 O etc. are used. Add trace elements and other nutritional sources as necessary. The above filamentous fungi are usually cultured statically in a liquid medium.
This is done by shaking culture, aerated agitation culture, etc.
The pH of the medium is preferably 4.0 to 6.0, and the culture is usually carried out at 10 to 33°C for 5 to 30 days. Thus, γ in the culture
-Produces lipids with high linolenic acid content,
Collecting lipids from a culture When collecting lipids, since lipids are contained in the cells of filamentous fungi, it is preferable to separate the cells from the culture and collect the lipids from the cells. be. The lipids are collected according to conventional methods, such as by solvent extraction. Thus, according to the present invention, it is possible to produce lipids with a high content of γ-linolenic acid using hydrocarbons as carbon sources. γ-linolenic acid [18:3(6,
[9, 12)] is a fatty acid (essential fatty acid) that cannot be synthesized in the mammalian body, and is required in the diet, along with linoleic acid. This is because γ-linolenic acid is a precursor that becomes bishomo-γ-linolenic acid and then arachidonic acid in the body, and bishomo-γ-linolenic acid and arachidonic acid are respectively prostaglandins, E 1 , E 1d and E2 ,
This is because it becomes E 2d and plays an extremely important physiological role in living organisms. Linolenic acid produced from plant seeds is α-linolenic acid [18:3 (9,
12, 15)], and there are few that produce γ-linolenic acid, and in this sense, the production of lipids with a high γ-linolenic acid content is also important in terms of the production of γ-linolenic acid. It has meaning. Next, examples of the present invention will be shown, but the present invention is not limited thereto. Example 1 12.5 ml of n-decane, 2 g of KH 2 PO 4 , MgSO 4 .
7H2O 0.3g, NaCl 0.1g, FeSO4・7H2O 10mg,
CaCl2・2H2O 10mg, CuSO4・5H2O 0.2mg,
ZnSO4・7H2O 1.0mg, MnCl2・4H2O 1.0mg,
Deionized 2 mg of Thiamine-HCl, 0.02 mg of D-Biotin, and 0.91 g of NH 4 NO 3 as a nitrogen source, [C/N ratio (weight of carbon atoms in n-decane/weight of nitrogen atoms in nitrogen source) was 24.1]. Mix in 1000ml of water and adjust the pH
Adjusted to 4.6. 400 ml of this synthetic medium was placed in Erlenmeyer flask No. 1, each strain was inoculated, and cultured with shaking at 150 rpm at a predetermined temperature for a predetermined period of time.
After culturing, bacterial cells were collected by filtration or centrifugation. A portion of the cells was accurately weighed to determine the water content, dried overnight at 120°C in a constant temperature bath to determine the water content, and lipids were extracted from the remaining bacterial cells. To extract lipids from the bacterial cells, a mixture of chloroform and methanol (2:1 v/v) was added to the remaining wet bacterial cells and homogenized in the presence of glass beads, thereby crushing the bacterial cells and extracting the lipids at the same time. In order to perform the extraction completely, this was repeated five times and all the extracts were collected. After the above extract was purified by Floch's partition washing method, the solvent was distilled off under reduced pressure, and the total lipid amount was measured gravimetrically. A portion of the produced lipids was extracted from the bacterial cells and accurately weighed, and after methyl esterification, the fatty acid composition was analyzed by gas chromatography. The remaining lipids were separated into neutral lipids and polar lipids by column chromatography using UNISIL as a packing material and chloroform and methanol as developing solvents, and the abundance of each was determined, and each lipid was also analyzed by gas chromatography. The fatty acid composition was determined. The following table shows the lipid production amount and γ-linolenic acid content of various Morteierella filamentous fungi determined by this method. From the results in Table 1, Lamaniana angrispora of the genus Morteiera has a higher total lipid production amount for the bacterial body than other bacteria of the genus Morteiera.
Moreover, since the production rate of γ-linolenic acid is high, γ-linolenic acid can be efficiently produced. 【table】