JPS6322262B2 - - Google Patents
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- Publication number
- JPS6322262B2 JPS6322262B2 JP55181051A JP18105180A JPS6322262B2 JP S6322262 B2 JPS6322262 B2 JP S6322262B2 JP 55181051 A JP55181051 A JP 55181051A JP 18105180 A JP18105180 A JP 18105180A JP S6322262 B2 JPS6322262 B2 JP S6322262B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- bilirubin
- reagent
- direct
- measurement
- indirect
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired
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-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/72—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving blood pigments, e.g. haemoglobin, bilirubin or other porphyrins; involving occult blood
- G01N33/728—Bilirubin; including biliverdin
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- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Hematology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Description
本発明は直接ビリルビン測定用試薬に関するも
のである。 体液中のビリルビンには間接型と直接型があ
り、間接ビリルビンは非抱合型ビリルビン（遊離
ビリルビン）であり、直接ビリルビンは抱合型ビ
リルビンであつて、前記遊離ビリルビンの側鎖の
プロピオン酸がグルクロン酸とエステル結合した
グルクロナイド（モノグルクロナイド、ジグルク
ロナイド等）である。総ビリルビンは直接ビリル
ビンと間接ビリルビンの総称である。 体液中に各種のビリルビンの病態時に臨床検査
として測定されるものは血中ビリルビン濃度とそ
の分画（直接型ビリルビンと間接型ビリルビン）、
尿中ビリルビンおよびウロビリン体、糞便中のウ
ロビリン体などが主であつて、このうち血中ビリ
ルビンの動態は最も重要で、各種黄疸の分類、鑑
別に重要な意義をもつている。また近年Rh不適
合による胎児の溶血性疾患の重症度の判定や対策
などに羊水中のビリルビンの分析が重要視されて
いる。 ビリルビンのジアゾ化反応を利用した測定法は
1910年代にHIJMANS VAN DEN BERGHら
により考案され、1930年代にMALLOY，EVE―
LYN，JENDRASSIK，GROFらにより定量法
として確立されて以来、多くの改良法が提案され
ているが、現在もなお、この測定原理を利用した
方法が臨床分析の主流を占めている。 この古典的な測定方法とはジアゾニウム塩を用
いるとき、スルフアニル酸と亜硝酸を反応させて
調製する方法である。そして、この改良方法の１
つとして、KULHANEKら、
ERTHINGHAUSENらによつて提案された安定
化ジアゾニウム塩を用いる方法がある。この改良
法は予め作成した安定化ジアゾニウム塩粉末を緩
衝液に溶解するだけで、試薬調製ができるという
優れた方法である。しかしながら、この改良法で
は総ビリルビンのみの測定で、直接ビリルビンの
測定は行なわれていない。ここで安定化ジアゾニ
ウム塩とは、ジアゾ化合物とナフタリンスルホン
酸塩、塩化亜鉛との複塩、フツ化ホウ素酸塩など
で、固体状態で分離されたものである。 一方、総ビリルビンおよび直接ビリルビンの分
画測定法として、安部らによつて安定化ジアゾニ
ウム塩の１種、ｐ―スルホベンゼンジアゾニウ
ム、１，５―ナフタレンジスルホン酸塩を用いる
方法が提案されている。ところが、該安定化ジア
ゾニウム塩を3.4ミリモル／用いるこの直接ビ
リルビン測定法では間接ビリルビンが強く発色し
て、直接ビリルビン値として過大な測定値を与え
るという欠点がある。 本発明者らはこのような欠点を改良するため
に、種々鋭意検討したところ、安定化ジアゾニウ
ム塩の濃度が該試薬に対して、特定の濃度に調製
することにより、間接ビリルビンの直接反応が問
題ない程度にまで抑制されることを見出し、本発
明に到達した。すなわち本発明はｐ―スルホベン
ゼンジアゾニウム―１，５―ナフタレンジスルホ
ン酸塩および塩酸を含有する直接ビリルビン測定
用試薬において、ｐ―スルホベンゼンジアゾニウ
ム―１，５―ナフタレンジスルホン酸塩が該測定
用試薬に対して0.05〜1.0ミリモル／含有され
ていることを特徴とする直接ビリルビン測定用試
薬である。 本発明では間接ビリルビンの直接ビリルビン反
応を問題ない程度にまで抑制させることにより正
確に直接ビリルビンを測定することができるほか
に、従来の方法、例ええばアルコールをカツプリ
ング試薬とするMALLOY―EVELYN法、カフ
エイン―安息香酸をカツプリング試薬とし、ジア
ゾ発色後フエーリング液を加えアルカリアゾビ
リルビンとして比色するJENDRASSIK―GROF
法およびそれらの改良法ではジアゾニウム塩の濃
度は調整時、亜硝酸ナトリウムの量によつて決ま
るため、通常1.8〜2.9ミリモル／程度であるの
に対し、本発明では安定化ジアゾニウム塩を従来
より低濃度で測定することが可能となる。通常、
臨床分析において血清中の総ビリルビンおよび直
接ビリルビンは一般に0.1〜40mg／dlの範囲のも
のを定量するが、本発明試薬では充分、この範囲
のものを測定することができる。 本発明の直接ビリルビン測定用試薬は安定化ジ
アゾニウム塩と塩酸とを含む。 塩酸は0.01乃至0.10規定の範囲が望ましい。 本発明に用いる安定化ｐ―スルホベンゼンジア
ゾニウムクロリドを１，５―ナフタレンジスルホ
ン酸で安定したｐ―スルホベンゼンジアゾニウム
―１，５―ナフタレンジスルホン酸塩である。 本発明では安定化ジアゾニウム塩の濃度を直接
ビリルビン測定用試薬に対して、0.05〜1.0ミリ
モル／であることを特徴とする。この範囲の濃
度において間接ビリルビンの直接ビリルビン反応
に対する影響を抑制することができる。0.05ミリ
モル／未満であると、直接ビリルビンの測定を
行なうことが出来ず、1.0ミリモル／を越える
と間接ビリルビンの影響が大きく、正確な直接ビ
リルビンの測定を行なうことができない。 参考例 間接ビリルビン溶液の作成 EDTA・Na20.1ｇ、無水炭酸ナトリウム1.06ｇ
を蒸溜水800mlに溶解し、結晶ビリルビン0.2ｇを
溶解し、次いでヒト血清アルブミン55ｇを溶解
し、蒸溜水を加え1000ml定容とした。この液の３
ml毎をバイアル瓶に分注して後凍結真空乾燥し密
栓し冷暗所に保存した。使用時に凍結乾燥品を３
mlの蒸溜水で再溶解した。 実施例 １ 間接ビリルビンの直接ビリルビン測定試薬にお
ける反応性 直接ビリルビン測定反応試薬として、0.025規
定の塩酸水溶液に第１表に示される種々の量のｐ
―スルホベンゼンジアゾニウム―１，５―ナフタ
レンジスルホン酸塩（以下NDDSと略す）を溶
解して調製した。 参考例で調整した間接ビリルビン溶液50μ
に、上記反応試薬３mlを添加し、37℃で15分間加
温し、波長560nmにおける吸光度を測定した。試
薬ブランクとの吸光度差△ODdを求めた。 一方、総ビリルビン測定反応試薬として、0.1
規定塩酸およびジメチルスルホキシド30％を含有
する水溶液１に第１表に示される種々の量の
NDDSを溶解して調製した。参考例１で調整し
た間接ビリルビン溶液50μに、この反応試薬３
mlを添加し、37℃で15分間加温し、波長560nmに
おける吸光度を測定した。試薬ブランクとの吸光
度差△ODtを求めた。 間接ビリルビンの直接反応率を△ODd／△ODt
により表わす。その結果を第１表に示す。
のである。 体液中のビリルビンには間接型と直接型があ
り、間接ビリルビンは非抱合型ビリルビン（遊離
ビリルビン）であり、直接ビリルビンは抱合型ビ
リルビンであつて、前記遊離ビリルビンの側鎖の
プロピオン酸がグルクロン酸とエステル結合した
グルクロナイド（モノグルクロナイド、ジグルク
ロナイド等）である。総ビリルビンは直接ビリル
ビンと間接ビリルビンの総称である。 体液中に各種のビリルビンの病態時に臨床検査
として測定されるものは血中ビリルビン濃度とそ
の分画（直接型ビリルビンと間接型ビリルビン）、
尿中ビリルビンおよびウロビリン体、糞便中のウ
ロビリン体などが主であつて、このうち血中ビリ
ルビンの動態は最も重要で、各種黄疸の分類、鑑
別に重要な意義をもつている。また近年Rh不適
合による胎児の溶血性疾患の重症度の判定や対策
などに羊水中のビリルビンの分析が重要視されて
いる。 ビリルビンのジアゾ化反応を利用した測定法は
1910年代にHIJMANS VAN DEN BERGHら
により考案され、1930年代にMALLOY，EVE―
LYN，JENDRASSIK，GROFらにより定量法
として確立されて以来、多くの改良法が提案され
ているが、現在もなお、この測定原理を利用した
方法が臨床分析の主流を占めている。 この古典的な測定方法とはジアゾニウム塩を用
いるとき、スルフアニル酸と亜硝酸を反応させて
調製する方法である。そして、この改良方法の１
つとして、KULHANEKら、
ERTHINGHAUSENらによつて提案された安定
化ジアゾニウム塩を用いる方法がある。この改良
法は予め作成した安定化ジアゾニウム塩粉末を緩
衝液に溶解するだけで、試薬調製ができるという
優れた方法である。しかしながら、この改良法で
は総ビリルビンのみの測定で、直接ビリルビンの
測定は行なわれていない。ここで安定化ジアゾニ
ウム塩とは、ジアゾ化合物とナフタリンスルホン
酸塩、塩化亜鉛との複塩、フツ化ホウ素酸塩など
で、固体状態で分離されたものである。 一方、総ビリルビンおよび直接ビリルビンの分
画測定法として、安部らによつて安定化ジアゾニ
ウム塩の１種、ｐ―スルホベンゼンジアゾニウ
ム、１，５―ナフタレンジスルホン酸塩を用いる
方法が提案されている。ところが、該安定化ジア
ゾニウム塩を3.4ミリモル／用いるこの直接ビ
リルビン測定法では間接ビリルビンが強く発色し
て、直接ビリルビン値として過大な測定値を与え
るという欠点がある。 本発明者らはこのような欠点を改良するため
に、種々鋭意検討したところ、安定化ジアゾニウ
ム塩の濃度が該試薬に対して、特定の濃度に調製
することにより、間接ビリルビンの直接反応が問
題ない程度にまで抑制されることを見出し、本発
明に到達した。すなわち本発明はｐ―スルホベン
ゼンジアゾニウム―１，５―ナフタレンジスルホ
ン酸塩および塩酸を含有する直接ビリルビン測定
用試薬において、ｐ―スルホベンゼンジアゾニウ
ム―１，５―ナフタレンジスルホン酸塩が該測定
用試薬に対して0.05〜1.0ミリモル／含有され
ていることを特徴とする直接ビリルビン測定用試
薬である。 本発明では間接ビリルビンの直接ビリルビン反
応を問題ない程度にまで抑制させることにより正
確に直接ビリルビンを測定することができるほか
に、従来の方法、例ええばアルコールをカツプリ
ング試薬とするMALLOY―EVELYN法、カフ
エイン―安息香酸をカツプリング試薬とし、ジア
ゾ発色後フエーリング液を加えアルカリアゾビ
リルビンとして比色するJENDRASSIK―GROF
法およびそれらの改良法ではジアゾニウム塩の濃
度は調整時、亜硝酸ナトリウムの量によつて決ま
るため、通常1.8〜2.9ミリモル／程度であるの
に対し、本発明では安定化ジアゾニウム塩を従来
より低濃度で測定することが可能となる。通常、
臨床分析において血清中の総ビリルビンおよび直
接ビリルビンは一般に0.1〜40mg／dlの範囲のも
のを定量するが、本発明試薬では充分、この範囲
のものを測定することができる。 本発明の直接ビリルビン測定用試薬は安定化ジ
アゾニウム塩と塩酸とを含む。 塩酸は0.01乃至0.10規定の範囲が望ましい。 本発明に用いる安定化ｐ―スルホベンゼンジア
ゾニウムクロリドを１，５―ナフタレンジスルホ
ン酸で安定したｐ―スルホベンゼンジアゾニウム
―１，５―ナフタレンジスルホン酸塩である。 本発明では安定化ジアゾニウム塩の濃度を直接
ビリルビン測定用試薬に対して、0.05〜1.0ミリ
モル／であることを特徴とする。この範囲の濃
度において間接ビリルビンの直接ビリルビン反応
に対する影響を抑制することができる。0.05ミリ
モル／未満であると、直接ビリルビンの測定を
行なうことが出来ず、1.0ミリモル／を越える
と間接ビリルビンの影響が大きく、正確な直接ビ
リルビンの測定を行なうことができない。 参考例 間接ビリルビン溶液の作成 EDTA・Na20.1ｇ、無水炭酸ナトリウム1.06ｇ
を蒸溜水800mlに溶解し、結晶ビリルビン0.2ｇを
溶解し、次いでヒト血清アルブミン55ｇを溶解
し、蒸溜水を加え1000ml定容とした。この液の３
ml毎をバイアル瓶に分注して後凍結真空乾燥し密
栓し冷暗所に保存した。使用時に凍結乾燥品を３
mlの蒸溜水で再溶解した。 実施例 １ 間接ビリルビンの直接ビリルビン測定試薬にお
ける反応性 直接ビリルビン測定反応試薬として、0.025規
定の塩酸水溶液に第１表に示される種々の量のｐ
―スルホベンゼンジアゾニウム―１，５―ナフタ
レンジスルホン酸塩（以下NDDSと略す）を溶
解して調製した。 参考例で調整した間接ビリルビン溶液50μ
に、上記反応試薬３mlを添加し、37℃で15分間加
温し、波長560nmにおける吸光度を測定した。試
薬ブランクとの吸光度差△ODdを求めた。 一方、総ビリルビン測定反応試薬として、0.1
規定塩酸およびジメチルスルホキシド30％を含有
する水溶液１に第１表に示される種々の量の
NDDSを溶解して調製した。参考例１で調整し
た間接ビリルビン溶液50μに、この反応試薬３
mlを添加し、37℃で15分間加温し、波長560nmに
おける吸光度を測定した。試薬ブランクとの吸光
度差△ODtを求めた。 間接ビリルビンの直接反応率を△ODd／△ODt
により表わす。その結果を第１表に示す。
【表】
第１表から明らかなようにNDDS濃度が約1.0
ミリモル／を越えると、間接ビリルビンの直接
反応は30％以上となり好ましくない。 実施例 ２ 直接ビリルビンの直接反応の反応性 直接ビリルビン測定反応試薬として、0.01規定
塩酸水溶液１にNDDS0.15ミリモル（及び参考
例として0.02ミリモル）を溶解して調整した。 試料（MALLOY―EVELYNの方法で測定し
た直接ビリルビン値39.3mg／dl）蒸溜水で希釈し
第２表に示される希釈系列を作成した。この希釈
試料50μに対し、上記直接ビリルビン測定試薬
３mlを加え、37℃で５分間加温した後、波長
560nmの吸光度を測定した。その結果を第２表に
示す。
ミリモル／を越えると、間接ビリルビンの直接
反応は30％以上となり好ましくない。 実施例 ２ 直接ビリルビンの直接反応の反応性 直接ビリルビン測定反応試薬として、0.01規定
塩酸水溶液１にNDDS0.15ミリモル（及び参考
例として0.02ミリモル）を溶解して調整した。 試料（MALLOY―EVELYNの方法で測定し
た直接ビリルビン値39.3mg／dl）蒸溜水で希釈し
第２表に示される希釈系列を作成した。この希釈
試料50μに対し、上記直接ビリルビン測定試薬
３mlを加え、37℃で５分間加温した後、波長
560nmの吸光度を測定した。その結果を第２表に
示す。
【表】
第２表から明らかなように、希釈度に対して吸
光度は直線的に変化している。 一方、NDDS濃度が低い参考例では発色度が
低い直線性が劣る。
光度は直線的に変化している。 一方、NDDS濃度が低い参考例では発色度が
低い直線性が劣る。
Claims (1)
- １ ｐ―スルホベンゼンジアゾニウム―１，５―
ナフタレンジスルホン酸塩および塩酸を含有する
直接ビルリビン測定用試薬において、ｐ―スルホ
ベンゼンジアゾニウム―１，５―ナフタレンジス
ルホン酸塩が該測定用試薬に対して0.05〜1.0ミ
リモル／含有されていることを特徴とする直接
ビリルビン測定用試薬。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP18105180A JPS57103056A (en) | 1980-12-19 | 1980-12-19 | Reagent for measuring direct bilirubin |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP18105180A JPS57103056A (en) | 1980-12-19 | 1980-12-19 | Reagent for measuring direct bilirubin |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS57103056A JPS57103056A (en) | 1982-06-26 |
| JPS6322262B2 true JPS6322262B2 (ja) | 1988-05-11 |
Family
ID=16093910
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP18105180A Granted JPS57103056A (en) | 1980-12-19 | 1980-12-19 | Reagent for measuring direct bilirubin |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS57103056A (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE3225331A1 (de) * | 1982-07-07 | 1984-01-12 | Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim | Verfahren zur bestimmung von direktem und gesamt-bilirubin sowie hierfuer geeignetes reagens |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS4929475A (ja) * | 1972-07-19 | 1974-03-15 | ||
| JPS5412840A (en) * | 1977-06-30 | 1979-01-30 | Canon Inc | Measuring method for surface potential of electrophotographic photoreceptor by time series |
| US4190419A (en) * | 1978-09-22 | 1980-02-26 | Miles Laboratories, Inc. | Device for detecting serum bilirubin |
-
1980
- 1980-12-19 JP JP18105180A patent/JPS57103056A/ja active Granted
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS57103056A (en) | 1982-06-26 |
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