JPS6328920B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、一般に補酵素を安定化する方法及び
組成物に関し、そして特に溶液中のNADHを安
定化する方法及び組成物に関する。 〔従来の技術） 生化学反応は、ほとんど例外なく酵素により触
媒化される。それぞれの酵素は、基質における非
常に特異的な化学的変化を促進するたん白であ
る。 多くの種類の酵素が機能するために、補酸素と
呼ばれる或る型の低分子量分子の参与が必要とさ
れる。一般に、補酵素における化学変化は、反応
の所望の産物である基質における変化と平衡す
る。例えば、補酵素は、基質から水素イオンを受
け取るか又は水素イオンを基質に供与する。 多くの臨床の診断アツセイは、酸化還元反応を
含む。これらの診断上の反応の中で、ジヌクレオ
チドが補酵素として働くものがある。このような
ジヌクレオチドの例は、ニコチンアミドアデニン
ジヌクレオチド（NAD）、ニコチンアミドアデニ
ンジヌクレオチド2′−ホスフエート（NADP）及
びフラビンアデニンジヌクレオチド（FAD）を
含む。 ジヌクレオチドはホスフエート橋かけにより結
合されたモノヌクレオチドである。モノヌクレオ
チドは含窒素塩基及び糖のりん酸エステルであ
る。NAD及びNADPでは、第一のモノヌクレオ
チドは塩基アデニン及び糖リボースから形成され
るヌクレオチドのりん酸エステルであり、一方第
二のモノヌクレオチドは塩基ニコチンアミド及び
リボースから形成されるヌクレオチドのりん酸エ
ステルである。FADにおいて、アデニン及びリ
ボースのりん酸エステルから形成される第一のモ
ノヌクレオチドは、塩基7.8−ジメチル−イソア
ロキサジン及び糖アルコールＤ−リビトールのり
ん酸エステルから形成される第二のモノヌクレオ
チドに結合される。 NAD又はNADPの何れかは、会合された電子
により水素を受容することにより還元された基質
（Sr）からの電子受容体として働くか、又は可逆
反応において酸化された基質（So）への電子供
与体として働き、即ち (1) NAD⁺＋Sr−H₂＝NADH＋So＋H⁺ (2) NADP⁺＋Sr−H₂＝NADPH＋So＋H⁺ となる。これらの反応の有用な特徴は、これらの
ジヌクレオチドの還元された形（即ち、NADH
及びNADPH）は、340nｍの波長で光を吸収す
るが、酸化された形（即ちNAD⁺及びNADP⁺）
はそうではない。その故、既知の量の酵素につい
て反応速度の較正曲線をプロツトした後に、これ
らの反応の一つを触媒化する未知の量の酵素が、
或る量の基質、酵素に関する既知の活性及び
340nｍにおける光学密度の観察された変化速度
から得られよう。同様に、これらの反応の一つを
触媒化する酵素の基質の量は、較正曲線、既知の
活性の或る量の酵素及び340nｍにおける光学密
度の測定された変化速度から求められよう。 診断アツセイにおいて重要であるが、NADH
は、他の還元されたジヌクレオチドと同じく、水
溶液では非常に不安定である。これは、それが一
層安定した形の乾燥粉末でNADHを処理するの
よりも、NADHの水溶液を処理することが極め
て容易、安価そして正確である限り、診断アツセ
イキツトの製造者及び使用者にとり特別な問題を
提供する。 NADH溶液を安定化する一つのやり方は、で
きる限り水を除却するための有機溶媒との混合を
含む。 米国特許第4153511号明細書において、不活性
且つ吸湿性の剤及び有機溶媒が用いられて0.5％
より少ない水を含むNADH溶液を得ている。し
かし、利用しうる非水性の溶媒中のNADH溶液
は、正確且つ精密に処理するには困難な点まで粘
稠になり勝ちである。 他のやり方では、補酵素例えばNAD及び
NADPは、酸性PHで有機溶媒好ましくは液体ポ
リオール例えばグリセロール又はプロピレングリ
コールの存在下安定化される。モドロビツチ
（Modrovich）の米国特許第4153511号明細書参
照。しかし、このような溶液は、比較的不安定で
あり、そしてほぼ100％の還元された補酵素の安
定性が要求される自動化アツセイについて特に適
さない。 （発明の概要） 本発明による安定化された補酵素組成物は、塩
基性水溶液；水溶液中の第一の濃度の還元された
ジヌクレオチド好ましくはNADH又は
NADPH；水溶液中のポリヒドロキシルアルキ
ル溶媒最も好ましくはプロピレングリコール；そ
して水溶液中の第二の濃度のボレートシス−ヒド
ロキシル結合化合物最も好ましはくほう酸又はそ
の塩を含み、第二の濃度は第一の濃度にほぼ等し
いか又はそれより高い。 本発明による現在好ましい安定化された補酵素
組成物は、約８〜約11の間のPHの水溶液；約10ｍ
Ｍから約500ｍＭまでの範囲内の濃度のビシン
（Bicine）バツフアー（Ｎ，Ｎ−ビス［２−ヒド
ロキシエチルグリシン］）；約0.001ｍＭから約50
ｍＭまでの範囲内の濃度のNADH；NADHの濃
度に少なくとも等しい濃度でしかも約10ｍＭから
約500ｍＭまで範囲内の濃度のほう酸；及び水溶
液の約20％ｖ／ｖから約90％ｖ／ｖまでの範囲内
の濃度のプロピレングリコールを含む。最も好ま
しい補酵素組成物は、NADHが10ｍＭの濃度、
ほう酸が50ｍＭの濃度、プロピレングリコールが
50％ｖ／ｖの濃度をそしてビシン・バツフアーが
200ｍＭの濃度であり約PH10.0へ調節されたもの
である。 本発明による還元されたジヌクレオチドの溶液
を安定化する方法は、第一の濃度の還元されたジ
ヌクレオチドを塩基性水溶液に溶解し；水溶液を
約8.0〜約11.0の間のPHへ緩衝し；第一の濃度に
ほぼ等しいか又はそれより高い第二の濃度で還元
されたジヌクレオチドをボレートシス−ヒドロキ
シル結合化合物に接触させ；そして水溶液をポリ
ヒドロキシルアルキル溶媒中で約20％ｖ／ｖから
約90％ｖ／ｖへすることにより還元されたジヌク
レオチドの水と接触を低下させる工程を含む。 第１図は、種々のPH値における、未混入のプロ
ピレングリコール中のNADHの安定性と金属混
入プロピレングリコール中のNADHが安定性の
比較のグラフである。 第２図は、種々の精製工程をうけたプロピレン
グリコール溶液中のNADHの安定性のグラフで
ある。 第３図は、種々のPH値における、純粋なプロピ
レングリコール中のNADHの安定性と50％ｖ／
ｖプロピレングリコール／水中の安定性との比較
のグラフである。 第４図は、本発明による安定化されたジヌクレ
オチド溶液に関する最適PHの決定の結果を示すグ
ラフである。 NADHは、臨床化学に広く用いられている補
酵素である。現在の処方は、通常乾燥充填又は凍
結乾燥され、そして再溶解すると不安定である。
乾燥処方は、観客による混合中に試薬を浪費し勝
ちである。その上、乾燥処方の製造者は、凍結乾
燥及び乾燥混合の費用がかさむ。又、観客が適切
に試薬を再溶解するのに依存すべきときに、製造
者による品質管理の損失がある。 本発明は、非常に安定な水性NADH溶液の製
造及び使用を含む。現在入手しうる液体NADH
処方は、実質的に無水であると記載されておりそ
してピペツトに吸うことが困難である。本発明と
比べて、これらの処方は、一層高価でありそして
それらの製造には一層人手がかかる。 本発明は、少なくとも約１年間安定である液体
NADHの溶液を提供する。この溶液は、NADH
の酸化が分析物の濃度の決定に用いられるシステ
ムで使用されよう。NADHの損失は、340nｍ領
域の吸収の損失、又はカツプルされた比色定量シ
ステム中の損失により直接に；螢光定量的又は電
気化学的に決定されよう。水性NADH溶液の使
用は、以前作成された全有機溶液よりも一層大き
なフレキシビリテイをもたらす。水を排除する
NADH溶液に対する本発明の一つの利点は、導
電性溶液の存在に依存するNADHの側定を行う
能力である。 NADHはボロネート結合基を有するアフイニ
テイクロマトグラフイカラムに結合し、ほう酸ナ
トリウム溶液により溶離しそして溶離液は
NADHの存在について分光測光法により調べら
れたが［マエスタス（Maestas）ら「ジエ−・ク
ロマトグラ（J.Chromatogr.）」189、225−231
（1980）］、NADHがこのような溶離液中で特に安
定であり、又はこのような溶離液への有機溶媒の
添加は特に安定な補酵素組成物をもたらすという
ことについて、現在までの所どんな教示もされて
いない。 一般に、本発明によれば、NADHは又は他の
他の還元されたジヌクレオチドは、４オングスト
ロームの分子ふるい及びナトリウムボロヒドリツ
ドによりプロピレングリコールを処理して溶液か
ら少量の酸化部を除くことにより、本発明で安定
化される。処理されたプロピレングリコールは、
ほう酸を含むバツフアーと１対１で混合され、そ
してPH10.0に調節される。NADH又はNADHの
還元されたアナローグは、容易に水をベースとす
る材料に溶解する。この溶液は、プラスチツク又
はガラスの貯蔵装置に少なくとも約１年間貯蔵さ
れうる。NADH溶液は何回も再使用され、そし
て容器を開けても何等損失は生じない。 ボロネート陰イオンは、リボースの2′、3′位で
1.2−シスジオールへ結合することにより、ジヌ
クレオチドと結合するものと思われる。この理由
のため、ほう酸及びその塩並びにほう酸のボレー
ト誘導体及びそれらの塩は、一般にシス−ヒドロ
キシル結合化合物とされる。例えば、フルトン
（Fulton）、「ボロネート・リガンズ・イン・バイ
オケミカル・セパレーシヨンズ（Boronate
Ligands in Biochemical Separations）」、アミ
コン・コーポレーシヨン（Amicon
Corporation）、サイエンテイフイク・システム
ズ・デイビジヨン（Scientific Systems
Division）、ダンバーズ（Danvers）、マサチユー
セツツ（1981）参照。本発明により有用なほう酸
のボレート誘導体は、フエニルボロネート、アル
カンボロネート、２−フエニルエタンボロネー
ト、３−アミノベンゼンボロン酸及び他のボロネ
ートエステルを含む。例えば、本明細書において
文献として引用される下記の刊行物参照。フルト
ン、同上；グラツド（Glad）ら「ジエー・クロ
マトグラ（J.Chromatogr）」200、254−260
（1980）及びブーリオチス（Bouriotis）ら「ジエ
ー・クロマトグラ」210、267−278（1981）。NAD
（Ｈ）、NADP（Ｈ）及びFAD（H₂）における１個
より多い利用可能な１、２−シスジオールの存在
は、水素結合及び疎水性効果も又役割をはたす
が、ボレートとの緊密な結合に寄与する。フルト
ン、同上。 本発明は作用のすべての特別な態様に制限され
ることを目的としていないが、ジヌクレオチドの
シスーヒドロキシルへのボレートの結合が、隣接
する不安定な結合上のこれらのヒドロキシルによ
る求核攻撃をブロツクするものと思われる。この
ような求核攻撃は、モノヌクレオチドへの分子の
劣化を生じさせる。 プロピレングリコールは、本発明により用いら
れて、水と還元されたピリジニウム化合物との相
互作用を最少にし、そしてそれにより酸化を最少
にさせる。溶液の比誘電率を低下させることによ
り、NADHを一層安定にさせると思われる。 ビシン・バツフアーが、溶液のPHを約８〜約11
に保つのに用いられる。NADHは、高いPH特に
PH8.0以上で一層安定である。ロウリイ（Lowry）
ら「ジエー・バイオル・ケム（J.Biol.Chem）」
236、2756〜2759（1961）；並びにウ（Wu）ら
「クリニ・ケム（Clin.Chem）」32、314〜319
（1986）。高いPHは 一般にジヌクレオチドを還元
された状態に保つたものと思われ、そしてボレー
トの損失を防ぐ。ナトリウムボロヒドリドが、１
晩約200ml／でプロピレングリコールを処理す
るのに用いられる。この処理は、溶液に見出され
る酸化物を最少にする。反応により、H₂O、ほ
う酸及びH₂が形成される。ナトリウムボロヒド
リドが現在好ましいが、分解してほう酸を形成す
る他のボロヒドリド塩も又は有用であることが予
想される。 ４オングストロームの分子ふるいが用いられ
て、水、酸化物例えばアルデヒド及びペルオキシ
化合物並びに他の汚染物を引き抜いて、プロピレ
ングリコールを清浄による。 （実施例） 本発明は、下記の実施例において一層詳細に説
明される。実施例１において、金属の混入がある
と思われる缶入りのプロピレングリコールを処理
して、瓶入りのプロピレングリコールの性能に比
較したその性能を改善する。純粋なプロピレング
リコール組成物は、又実施例１の水溶液と比較さ
れる。実施例２は、種々のPH値における本発明に
よるNADH組成物の比較並びにNADH溶液の安
定性に関する最適なPHの測定をもたらす。実施例
３において、本発明の現在好ましい態様の貯蔵寿
命を調べる。実施例４及び５において、それぞれ
血中尿素の窒素（BUN）試薬又はトリグリセリ
ドアツセイ試薬と組み合わされたときの本発明の
安定性が記載される。実施例６は、血中のアンモ
ニアの測定のために材料における、本発明による
安定化された組成物を用いる混合された試薬に関
する。実施例７において、本発明による安定化さ
れた組成物が、自動化されたBUNアツセイにお
ける適合性について調べられる。実施例８におい
て、本発明によるジヌクレオチド組成物が、アラ
ニントランスアミナーゼアツセイにおける応用に
ついて考慮される。実施例９は、アスパルタ−ゼ
アミノトランスフエラーゼアツセイにおける本発
明による安定化された組成物の使用を記載してい
る。実施例10は、本発明によるNADPH溶液の
使用に関する。 実施例 １ 種々のPHの効果を調べるために、種々の混入物
を除去するように処理されたプロピレングリコー
ルの使用と未処理プロピレングリコールとを比較
するために、そして「純粋」なプロピレングリコ
ールの使用と水性混合物の使用とを比較するため
に、下記の実験を行つた。 ８種の異なつた実験条件を３種の群に分けた。
第群、未処理プロピレングリコール；第群、
処理プロピレングリコール；そして第群、50％
溶液プロピレングリコール。 第群において、４種のサンプルがあつた。(1)
22mg／mlのNADHを加えた金属缶からのプロピ
レングリコール；(2)22mg／mlのNADHを加えた
PH8.4の瓶入りプロピレングリコール；(3)22mg／
mlのNADHの入つたPH10.3のプロピレングリコ
ール；そして(4)22mg／mlのNADHの入つたPH
11.8の瓶入りプロピレングリコール。 第群では、３種のサンプルがあつた。(5)22
mg／mlのNADHの入つたNaBH₄により処理され
た上述の第群の(2)；(6)22mg／mlのNADHの入
つたNaBH₄並びにチエレツクス・レジン
（Chelex Resin）５％ｗ／ｖ［シグマ・ケミカ
ル・カンパニー（Sigma Chemical、
Company）、セント・ルイス、ミズーリ］により
処理された前述の第群の(2)；そして(7)分子ふる
い３％ｗ／ｖ、８〜12メツシユ［デビソン・ケミ
カル・デイビジヨン（Davison Chemical
Division）、バルチモナ、メリーランド］だけで
処離された第群の(2)。 第群では唯一種のサンプルがあつた。(8)50％
瓶入りプロピレングリコール、100ｍＭビシン並
びに50ｍＭほう酸、PH8.4；そして11mg／mlの
NADHを含んだ。 NADH溶液を、テトラゾリウム塩（INT）ジ
アホラーゼを含む反応混合物中のサンプルとして
用いた。サンプリングの合間の終わりに残る
NADHの量は、下記の反応により形成されるホ
ルマザン−INTの量に比例した。 ジアホラーゼ (3)NADH＋INT＝ホルマザン−INT＋NAD 即ち、テストされる溶液中に一層NADHが存
在すると、一層ホルマザンが結果として存在す
る。 すべてのNADHサンプルは、第１及び２図に
示された日の数に等しいサンプリングの合間に45
℃で貯蔵された。 この実験の結果に基づいて、第１及び２図に示
された如く、缶入りのプロピレングリコールのサ
ンプルは非常に不安定であることが分かつた。又
PH8.4の溶液はPH10.3の溶液よりもさらに不安定
であることが分かり、後者はPH11.8の溶液よりも
より不安定であることが分かつたが、これらの条
件下のNADH溶液は14日後ではせいぜい75％し
か安定でなかつた。又混入されたプロピレングリ
コールについて、安定性の増大は、ナトリウムボ
ロヒドリド及び分子ふるいにより処理により得ら
れるが、チエレツクス・レジンは助けにならない
ことが結論された。 実施例 ２ 前述の「純粋」なプロピレングリコールに関す
る結果との比較について、実験を行つて、種々の
値のPHにおける水中50％ｖ／ｖ溶液のNADHの
安定性を調べた。実施例１のアツセイ手順が用い
られた。 第３図の上方の３本のラインで示されるように
異なつたPH値における「純粋」なプロピレングリ
コール組成物が、PH8.3以下のとき、第３図の下
方の３本のラインにより示されるように、50％溶
液よりも安定であることが、第３図に示された結
果が示す。 実施例 ３ 好ましいジヌクレオチド安定化溶液は、プロピ
レングリコールを４％ｗ／ｖオングストローム分
子ふるいにより処理し、そして２mg／mlでナトリ
ウムボロヒドリドを加えることにより作られた。
溶液を１晩又は少なくとも８時間ガス抜き系で貯
蔵した。PH９の200ｍＭのビシン及び100ｍＭのほ
う酸の蒸留水溶液を作つた。この溶液を１：１で
プロピレングリコールと混合して、最終濃度が50
％プロピレングリコール、50ｍＭほう酸、100ｍ
Ｍビシンとなつた。PHをNaOHにより10に調節
した。約11mg／mlのNADHを徐々に加えた。こ
の溶液を以下ジヌクレオチド溶液とした。２〜８
℃に混合されずに貯蔵されるとき、この溶液は約
１年間少なくとも安定であつた。代表的な安定性
は次の通りである。−20℃で約１年、２〜８℃で
約１年、室温で２ケ月、37℃で１ケ月、45℃で２
週間。この溶液を臨床上の分析物の測定のため
に、酵素溶液と混合される。 第４図に示した如く、好ましいジヌクレオチド
溶液の安定性テストは、45℃という高温度で行わ
れて、より低い温度の長期間の貯蔵の効果をシミ
ユレートした。第４図に示された結果は、約10の
PHが、使用前に貯蔵される本発明による溶液にと
り最適であることを教示している。 この実施例によるジヌクレオチド溶液に関する
現在好ましい成分は、以下のものを含む。ビシン
［＃Ｂ−3876、シグマ・ケミカル・カンパニー、
セント・ルイス、ミズーリ］；NADH［＃Ｎ−
8129、シグマ・ケミカル・カンパニー］；ナトリ
ウムボロヒドリド［＃Ｓ−9125、シグマ・ケミカ
ル・カンパニー］；プロピレングリコール［食品
グレード、ダウ ケミカル カンパニー、ミドラ
ンド ミシガン］及びほう酸［ベーカー
（Baker）ケミカル カンパニー］。 実施例 ４ 実施例３のジヌクレオチド溶液を用いて、PH
8.3の15ｍＭトリス・バツフアー中の0.2mg／mlの
アルフアケトグルタレートにより１：80に稀釈さ
れた20U／mlのウレアーゼ及び5U／mlのグルタ
メートデヒドロゲナーゼの溶液と組合わされたと
き、BUNのサンプルを測定した。もし溶液が0.1
％のナトリウムジドを含むならば、合わせた試薬
は３ケ月以内のBUN濃度を測定するのに用いら
れる。３ケ月後このような合わせたアツセイ試薬
系は150mg／の元の直線的な値の15％のみを失
つていた。 実施例 ５ 実施例３のジヌクレオチド溶液を用いて、
100U／mlリパーゼ、5U／mlグリセロールキナー
ゼ、2U／mlピルベートキナーゼ、1U／mlラクテ
ートデヒドロゲナーゼ、0.7ｍＭホスフエノール
ピルベート、0.05ｍＭ ATP、10ｍＭ MgCl₂
を含むバツフアーされた溶液により１：80で混合
されたとき、サンプル中のトリグリセリドの濃度
を測定した。合わせたとき、溶液は用いられて１
ケ月以内のサンプル中のトリグリセリドを測定し
た。 実施例 ６ 血清中のアンモニア測定が、毒性学上重要であ
る。多くの大病院は、１ケ月に数回のアンモニア
テストを行う。しかし、このテストの要請の間の
間隔の長さのために、比較的安定な試薬を有する
必要性がある。実施例３のジヌクレオチド溶液
は、PH8.5のトリス・バツフアー中の10U／mlグ
ルタメートデヒドロゲナーゼ及び0.5mg／mlアル
フアケトグルタレートを含むアンモニアのない溶
液と１：80で混合され、そして血清中のアンモニ
ア量を測定するのに容易に用いられる。この溶液
は、混合されないとき少なくとも約１年以内安定
である。混合されたときそれは少なくとも１ケ月
安定である。 実施例 ７ BUNは、本明細書において文献として引用さ
れる米国特許第4495293号明細書の主題であるラ
ジエテイブ・アテヌエーシヨン・アツセイ
（Radiative Attenuation Assay）における試薬
の使用により螢光分析的に測定される。このアツ
セイにおいて、試薬は３個の瓶に分けられる。薬
は以下のものから処理される。瓶＃１は、
NADH溶液を含み、瓶＃２は、PH７のホスフエ
ート・バツフアー中の1600U／mlウレアーゼ、16
mg／mlアルフアケトグルタレート及び400U／ml
グルタメートデヒドロゲナーゼ並びに25％グリセ
ロール並びに５×10^-6mg／ナトリウムフルオレ
セインを含み、瓶＃３は、メドラブルー0.5mg／
ml、10mg／mlチアゾイルブルー及びシトレート・
バツフアーPH25を含む。 瓶１及び２がPH7.5の100ホスフエート・バツフ
アーと１：１：40で混合されるとき、血液サンプ
ルは加水分解され、生成したアンモニアは、
NADHにおける付随した損失とともに、グルタ
メートに還元的に同化される。第二の反応におい
て、残つたNADHは前記バツフアーとの１：40
希釈で瓶＃３と反応して、触媒的にMTT−ホル
マザンを形成する。生成するMTT−ホルマザン
の量は、元のサンプルのBUNの量と比例する。
この試薬系は、概して臨床サンプルと６％以下の
CVを正ずる。瓶１，２及び３の組合わせは、少
なくとも約１年間サンプル中のBUNを検出する
のに用いられる。 実施例 ８ アラニントランスアミナーゼ（ALT）は、又
実施例３のジヌクレオチド溶液、500ｍＭ Ｌ−
アラニン、15ｍＭアルフアケトグタレート、0.1
ｍＭピリドキサール−５−ホスフエート（任意）、
600U／ラクテートデヒドロナーゼを用いて測
定される。この混合物は、組合わさつたとき少な
くとも１ケ月安定でありそして血清又は血漿中の
ALTを定量的に測定するのに用いられる。 実施例 ９ アスパルテートアミノトランスフエラーゼ
（AST）が、240ｍＭ Ｌ−アスパルテート、12
ｍＭアルフアケトグルタレート、0.10ｍＭピリド
キサール−５−ホスフエート、420U／マレー
トデヒドロゲナーゼ、600U／ラクテートデヒ
ドロゲナーゼと組合わされた実施例３のジヌクレ
オチド溶液を用いることにより測定される。この
混合物は、少なくとも１ケ月安定であり、そして
血清又は血漿中のASTを定量的に測定するのに
用いられる。 実施例 10 実施例３のジヌクレオチド溶液において
NADHはNADPHにより置換される。診断テス
ト中の或る酵素はNADHの代わりにNADPHを
利用する。プロテウス（Proteus）菌から精製さ
れたグルタメートデヒドロゲナーゼは、
NADPHのみを利用する。この酵素は、BUNの
測定のために、実施例２のグルタメートデヒドロ
ゲナーゼ酵素を置換するのに用いられる。 本発明は好ましい態様について記述されたが、
本発明の改変及び改善は当業者に生ずることは理
解される。例えば、本発明は主としてNADHの
安定化された溶液により例示されたが、他のジヌ
クレオチドの溶液は本発明により安定化される。
例えば、NADPH、還元された３−アセチルピ
リジンアデニンジヌクレオチド、還元された３−
アセチルピリジンアデニンジヌクレオチドホスフ
エート、還元されたチオニコチンアミドアデニン
ジヌクレオチド、還元されたチオニコチンアミド
アデニンジヌクレオチドホスフエート、還元され
たニコチンアミドヒポキサンチンジヌクレオチド
も又は本発明により安定化されることが考えられ
る。 同様に、ビシン・バツフアーが上述の実施例で
用いられたが、好ましいPH範囲内にジヌクレオチ
ド溶液を保つのに充分なpKa及びバツフアー能力
を有するすべてのバツフアーが用いられることが
考えられる。例えば、他の適当なバツフアーは次
のものを含む。トリス［トリス（ヒドロキシ−メ
チル）アミノメタン］；ヘペス［４−（２−ヒドロ
キシルエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン
酸］；トリエタノールアミン；MOPS［４−モル
ホリンプロパン−スルホン酸］；CHES［２−（シ
クロヘキシルアミノ）エタンスルホン酸］；及び
CAPS［３−シクロヘキシルアミノ−１−プロパ
ンスルホン酸］。 本発明による補酵素組成物が有用である他のア
ツセイは、ラクテイツクデヒドロゲナーゼピルベ
ート対ラクテート［即ちLDH（Ｐ対Ｌ）］及び尿
酸を含むアツセイを含む。 さらに、水と混和しうる他の安定な有機溶媒
が、それらが水素結合による以外で還元されたジ
ヌクレオチドと反応しない限り、プロピレングリ
コールの代わりに本発明で用いられることが考え
られる。２〜４個のヒドロキシル基及び２〜10個
の炭素原子を有する液体ポリオールが好ましい。
これらの好ましいポリオールは、グリセロール及
び1.2−プロパンジオールを含む。 本発明による補酵素組成物が、濃縮された形で
製造されそして使用に当たつて希釈されることも
考慮に入れるべきである。 それ故、本発明は特許請求の範囲に記載された
発明の範囲に入るすべての変化を含むことを目的
とする。

【図面の簡単な説明】

第１図は、種々のPH値における、未混入のプロ
ピレングリコールのNADHの安定性と金属混入
プロピレングリコール中のNADHの安定性の比
較のグラフである。第２図は、種々の精製工程を
うけたプロピレングリコール溶液中のNADHの
安定性のグラフである。第３図は、種々のPH値に
おける、純粋なプロピレングリコール中の
NADHの安定性と50％ｖ／ｖプロピレングリコ
ール／水中の安定性との比較のグラフである。第
４図は、本発明による安定化されたジヌクレオチ
ド溶液に関する最適PHの結果を示すグラフであ
る。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 塩基性の水溶液； 該水溶液中の第一の濃度の還元されたジヌクレ
   オチド； 該水溶液中のポリヒドロキシルアルキル溶媒；
   及び該水溶液中の第二の濃度のボレートシス−ヒ
   ドロキシル結合化合物（前記の第二の濃度は前記
   の第一の濃度にほぼ等しいか又はそれより高い）
   よりなる安定化補酵素組成物。 ２ 該ポリヒドロキシルアルキル溶媒が該水溶液
   の約20％ｖ／ｖ〜約90％ｖ／ｖの範囲内の濃度で
   ある特許請求の範囲第１項記載の補酵素組成物。 ３ 該水溶液が8.0より大きいPHに該水溶液を保
   つのに有効なバツフアーよりなる特許請求の範囲
   第２項記載の補酵素組成物。 ４ 該ボレートシス−ヒドロキシル結合化合物
   が、ほう酸；ほう酸の塩；ほう酸のボレート誘導
   体；及びほう酸のボレート誘導体の塩よりなる群
   から選ばれる特許請求の範囲第３項記載の補酵素
   組成物。 ５ 該ポリヒドロキシルアルキル溶媒がプロピレ
   ングリコールである特許請求の範囲第４項記載の
   組成物。 ６ 該水溶液の該PHが約８と約11との間である特
   許請求の範囲第５項記載の組成物。 ７ 前記の第二の濃度が約10ｍＭと約50ｍＭとの
   間である特許請求の範囲第６項記載の組成物。 ８ 該ポリヒドロキシルアルキル溶媒の該濃度が
   該水溶液の50％ｖ／ｖにほぼ等しい特許請求の範
   囲第７項記載の組成物。 ９ 前記の還元されたジヌクレオチドが、還元さ
   れたピリジンジヌクレオチド及び還元されたピリ
   ジンジヌクレオチドホスフエートよりなる群から
   選ばれる特許請求の範囲第８項記載の補酵素組成
   物。 １０ 前記の還元されたジヌクレオチドが
   NADHでありそして前記の第一の濃度が約0.001
   ｍＭ〜約50ｍＭの範囲内である特許請求の範囲第
   ９項記載の補酵素組成物。 １１ 第一の濃度の還元されたジヌクレオチドを
   塩基性水溶液に溶解し； この水溶液をPH約8.0と約11.0との間に緩衝
   し； 第一の濃度にほぼ等しいか又はそれより高い第
   二の濃度で還元されたジヌクレオチドをボレート
   シス−ヒドロキシル結合化合物と接触させ；そし
   て この水溶液をポリヒドロキシルアルキル溶媒中
   約20％ｖ／ｖ〜約90％ｖ／ｖへすることにより、
   還元されたジヌクレオチドの水との接触を低下さ
   せる工程よりなる還元されたジヌクレオチドの溶
   液を安定化する方法。