JPS6330571B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はくえん酸塩寒天ゲル及びゲルバツフア
ーを用いる電気クロマトグラフイーによりグリコ
シル化されていないヘモグロビンからグリコヘモ
グロビンを個別的に分離する方法に関する。 過血糖の程度と糖尿病の長期合併症との間に関
係があるかないかを明らかにする上での主たる困
難の一つは糖尿病のコントロールを評価する確実
で容観的な方法がないということである。しかし
ながら最近、正常ヘモグロビンのグリコシル化誘
導体例えば、ヘモグロビンA_1cの測定がその様な
糖尿病コントロールの一つの指標であることが示
唆された（例えばＤ・Gonen及びＡ・Ｈ・
Rubenstein，糖尿病学 15，１（1978）参照）。
ヘモグロビンのこの誘導体はベター鎖の末端バリ
ン部分においてヘモグロビンA₀（大人のヘモグロ
ビン）をグリコシル化（Post―trans criptional
に）することによつて形成される。その様なグリ
コシル化は赤血球の寿命（約120日）期間を通じ
て生起する緩慢な化学反応であり、普通のプラズ
マグルコーゼ濃度がヘモグロビンA_1cの量を制御
する最も重要なフアクターである。 グリコシル化ヘモグロビンのより迅速な電気泳
動性1957年にすでに寒天ゲル電気泳動法により示
されているが、定量データはその方法ではまだ得
られなかつた。それらヘモグロビンの割合は幾人
かの糖尿病被験者において他の被験者よりも多い
様に思われる。寒天ゲル上のグリコシル化ヘモグ
ロビンに最初に気付いた人達さえもそれを定量出
来る程度に分離することはできなかつた（S.
Rahbar外、Biochem.及びBiophys.Res.Comm.，
36，838（1969））。従つて定量の研究は大部分クロ
マトグラフイーによつて行われて来た（D.W.
Allen外、J.Am.Chem.Soc.， 80，1628（1958）。 爾来多くの研究者が糖尿病患者の糖コントロー
ルの状態を評価するためにグリコシル化ヘモグロ
ビン定量が極めて大切であるということを証明し
てきた。しかし乍ら、精巧なクロマトグラフイー
による分離がほぼ全般的に行われてきた（例え
ば、W.R.Holmquist及びW.A.Schroeder，
Biochem.Biophys.Acta，82，639（1964）及びL.
A.Trivelli外、N.Engl.j.Med．，281，353（1971）
参照）。それら方法によつて糖尿病患者は曲型的
にはヘモグロビンA_1cの量が２倍多くなり、グリ
コシル化ヘモグロビンの主成分は末梢血管中に存
在するということが明かにされた。 糖尿病コントロール中でのグリコシル化ヘモグ
ロビンパラメーターの臨床的重要性及び正常値と
異常値との間の比較的僅かな差異は、糖代謝障害
を明かにするのに充分な精密さで定量出来る様な
グリコシル化ヘモグロビンの迅速定量法を必要と
する。ミニコラムクロマトグラフイーによる方法
を色々と変えた方式は公開されており、グリコシ
ル化ヘモグロビンの定量的評価用に商業的に採用
されてさえいる。それら方法の主たる批判は正確
さの欠如を指摘して現れている。純粋グリコシル
化ヘモグロビン抗原性によるイソエレクトリツク
フオーカシングや免疫法の様なより実験室的な技
法が示唆されているが、日常的な臨床検定用にう
け入れられるに至つていない。なぜならば、フオ
ーカシング法の複雑さや、特異的な純抗体をうる
ことには困難が判うからである。 従つて、本発明はゲルバツフアーが0.05Mのく
えん酸塩濃度を持ち、PHが6.2である様なくえん
酸塩寒天ゲル電気クロマトグラフイーによつてグ
リコシル化されていないヘモグロビンからグリコ
ヘモグロビンを個別的に分離する方法において、 Ａ 約0.1〜0.5mmなる湿潤厚さを持つ寒天ゲル、 Ｂ 0.02〜0.05Mなるくえん酸塩濃度で約5.8〜
6.8のPHを持つくえん酸塩ゲルバツフアー、 Ｃ 約0.05〜0.1Mのくえん酸塩濃度と約6.0〜6.5
のPHを持つくえん酸塩ウエルバツフアー、 Ｄ 約５〜20ボルト／cmなる強さの場電流を用い
ることよりなる改良を提供するものである。 本発明はヘモグロビンやその他のヘモグロビン
誘導体からグリコヘモグロビンを個別に分離する
ために用いることができる。更に、本発明の方法
は、ヘモグロビンA_1cを残余のA₁ヘモグロビン誘
導体から分離することを可能にするものである。 上述の分離法の理論的な基礎は電気的クロマト
グラフイーとして特性づけることが出来る。そし
て電気的クロマトグラフイーなる用語はおそらく
電気泳動法なる字句よりも適切であろう。何故な
らば(1)問題になつているプロテインの逆荷電分子
と寒天ゲル中の荷電分子との間の相互作用の組合
せによつて大部分達成されているヘモグロビン類
の移動と分離(2)そのゲル中に生じている電気浸透
流及び(3)適用された場電流によるものだからであ
る。電気泳動なる用語は先行技術において専ら用
いられているものであるが、明かに電気クロマト
グラフイーの原理は従前から理解されていた（例
えば、R.J.Wieme，「寒天ゲル電気泳動法」
Elsevier出版社アムステルダム1965，192〜195頁
参照）。 従つて「電気クロマトグラフイー」なる用語を
酸性条件下の寒天ゲル上でのプロテインの電気泳
動型分離に関する本開示においては用いることに
する。 この発明の方法は約0.1〜0.5mmなる湿潤厚さを
持つ寒天ゲルの使用を必要としている。寒天の性
質は臨界的でない。しかし、くえん酸塩ゲルバツ
フアーのPHは或程度まで使用寒天の性質によつて
決まる。即ち、より少ない荷電を持つ寒天は幾分
異なるバツフアーPHを必要とする。しかし乍ら、
必要とするPHはなお以下論議する範囲内にあり、
適度なPHは専門家によつて容易に決めることがで
きる。適当な寒天は市場で容易に入手でき、本発
明の方法に適していることが判つた。使用寒天の
量は約2wt／vol％である。しかしながら他のパ
ラメーターを適切に調整しさえすればより多量か
少量例えば約１〜３％の寒天を使用できることは
専門家には明らかである。 一般的にいうと1wt／vol％より低い寒天濃度
は適当でない。 場合によつては、ゲルは少量即ち、10wt／vol
％以下の１種又は複数の軟釈剤を含んでよい。適
当な軟釈剤の例は蔗糖、オキシエチルセルロー
ズ、グリセロール、ソルビトール、等である。軟
釈剤の殊に有用な量は好ましい材料の蔗糖やソル
ビトールを用いて約４〜６％である。軟釈剤は表
面への少量の水の滞留を助け、その際湿潤フイル
ムを安定化する。軟釈剤はまた乾燥フイルム安定
剤として役立つ。軟釈剤の使用は好ましく４％ソ
ルビトールと１％グリセロールとの組合せが殊に
適切である。 その上そのゲルはまた乾燥フイルム安定剤とし
て作用する湿潤剤を少量含んでいることができ
る。湿潤剤の使用は実際上好ましいもので、約
0.1wt／vol％より少ない量でよい。適当な湿潤剤
はアニオン性又は非イオン性表面活性剤や他の湿
潤剤の性質を持つものを含んでいる。その様な化
合物の例は、殊にポリビニルアルコール、アルキ
ルフエノキシポリオキシアルキレンアルカノール
の硫酸エステル、アルキルアリールスルホン酸
塩、その硫酸塩及びスルホン酸塩のアルカリ金属
塩、脂肪酸石けん、ポリエーテルアルコール、等
である。ポリビニルアルコールの外、その様な湿
潤剤の特別の例はノニルフエニルポリオキシエチ
レン硫酸塩、ナトリウムラウリル硫酸塩及びノニ
ルフエニルポリオキシエチレンエタノールであ
る。注意すべきことは、ポリビニルアルコールを
使用するときは、それがポリビニル酢酸を事実上
含んではならないことである。 くえん酸塩ゲルバツフアーは約0.02〜0.05Mの
くえん酸塩濃度を持つことが出来、公知の方法で
つくることができる。くえん酸ナトリウム2H₂O
の所望量を適当な量の水にとかし、それにくえん
酸水溶液を加えてPHを所望のものにする。殊に有
用なくえん酸塩の濃度は0.0375Mである。普過く
えん酸塩ゲルバツフアーは約5.8〜6.8のPHを持ち
うるが約6.0から6.3のPHが好ましい。 既に述べた様に、ゲル製造に用いた寒天の性質
次第で、ゲルバツフアーのPHを微調整することが
往々必要である。 くえん酸塩ウエルバツフアーはゲルバツフアー
について記したと本質的に同じ様に造られる。ウ
エルバツフアーは約0.05〜0.1Mのくえん酸塩濃
度と約6.0〜6.5のPHを持つであろう。殊に有用な
くえん酸塩濃度は約0.1Mであり、好ましいPHは
約6.0〜6.3である。 既に指摘した様にこのゲルは約0.1〜0.5mmの厚
さを持たなければならない。殊に好ましい湿潤厚
は約0.3〜0.4mmである。このゲルはどの様な公知
の方法でつくつてもよいが、最も便利な方法は、
US―P3499265及び3635808に記されている様な
カセツトの型を用いる製法である。 普通、電気クロマトグラフイーは電気泳動に普
通によく知られた方法で行われる。普通、場の強
さは約５〜20ボルト／cmの間で変動できる。好ま
しい場の強さは10ボルト／cmである。好ましい場
の強さの条件下では電気クロマトグラフイー法は
約30〜45分行われるのが普通である。正確な所用
時間は、ただし、臨界的ではなく関連する他のパ
ラメータの函数である。 材料及び方法 望ましければ、こうして分離したグリコシル化
ヘモグロビン量はゲルを目で見て評価出来る。し
かしその量は各種方法で定量化できる。 例えば、そのゲルはデンシトメーターで直接走
査することが出来る（420nmでのヘム最大吸収を
使用）。実際上は、その様な直接走査法が好まし
い。なぜなら溶血をつくるための簡易法を用いる
ことが出来るからである。 その様な簡易法は１部の全血を２部の水（サポ
ニン0.1wt／vol％を含む）と混合する方法からな
つている。得られた混合物の容量は0.8μである
のが典型であつて、ゲルサンプルウエルに適用さ
れる。 或は、グリコシル化ヘモグロビンの量はアミノ
ブラツク又はポンソーＳの様な非特異プロテイン
染色剤を用いてそのフラクシヨンを染色（stain）
し、次いで適当な波長濃度計中でゲル走査するこ
とにより直接定量することも出来る。その様な染
色標識法を採用する場合、サンプル溶血は加工赤
血球から造らなければならない。何故なら、若し
普通のプロテイン染色を用いたとき非―ヘム―プ
ロテインは存在しえないからである。加工赤血球
から溶血の製造法は勿論、専門家によく知られて
いる。というのは、グリコシル化ヘモグロビンを
クロマトグラフイーで検出する場合もいつも普通
に用いられているからである。 グリコシル化ヘモグロビン量の定量のためのそ
の他のメソドは専門家に容易に判ることである。 ゲルバツフアー 0.0375Mのくえん酸塩濃度と室温で6.0のPHを
持つゲルバツフアーは、イオンを除去した蒸留水
１中に11.03ｇのくえん酸塩ナトリウム．2H₂O
を溶かすことによりつくられた。得らた溶液のPH
は１のイオン除去蒸留水に7.20ｇのくえん酸を
溶かしてつくつた、0.0375Mくえん酸塩液の充分
量を加えて6.0に調整した。 寒 天 ゲル溶液は、2.0ｇのバクトアガー（Bacto
Agar：Difco社の商品名）、4.0ｇのソルビトー
ル、1.0mlのグリセロール、及び2.0mgのナトリウ
ムアジドを、100mlのゲルバツフアーと混合する
ことによつてつくつた。得られた混合物は、内容
物が全部溶解してしまつたのち、かきまぜ乍ら、
沸騰水溶上で30分間加熱した。 ゲルフイルムの製造 カセツトの空型は、コーニングメデイカル社か
ら購入し、薄いゲルをつくるのに使用した。ゲル
溶液を65〜70℃に冷却し、ガラス製注射器を用い
て、型の下方ニツプル中に注入した。そして注射
器には、直径３mmのプラスチツクチユーブが付さ
れている。型は、注入中垂直の位置をとり、上方
のニツプルから空気が逃げ出す様にした。約５ml
のゲルを注入の終えたのち、カセツト型をフラツ
トな作業台上におき、約500ｇのフラツトな錘り
を型上にのせて、余分のゲル溶液を押し出した。
ゲルが固化したのち（環境温度で５分間後、各ゲ
ルを拡げたプラスチツク又はアルミホイル中に包
み、使用するまで24時間４℃で貯蔵した。こうし
てつくつたゲルは、若し密封されており、かつ、
保存剤があるならば、少くとも６ケ月間安定であ
る。 ウエルバツフアー 0.1Mのくえん酸塩濃度と室温で6.0のPHとを持
つウエルバツフアーは、イオン除去蒸溜水１
に、くえん酸塩ナトリウム．2H₂Oの29.41ｇをと
かすことによつてつくつた。この溶液のPHは、イ
オン除去蒸溜水１に19.21ｇのくえん酸をとか
した0.1Mくえん酸溶液を充分量加えることによ
つて、6.0に調整した。 電気クロマトグラフイー ヘモグロビンA₀とA_1cスタンダードは上記トリ
ベリ法により、プレパラテイブコラムクロマトグ
ラフイーによりつくられた。ヒト血液サンプル
は、地方病院（コーニングホスピタル，ニユーヨ
ーク）から採取した。用いた装置は、コーニング
メデイカル社製の電気泳動セルであり、60ボルト
のコンスタント出力に適合したコーニングメデイ
カルパワーサプライに、リード線で連結されてい
た。溶血物は、コーニングメデイカル電気泳動オ
ペレーシヨンプロセヂユアーマニユアルによる
か、又は、全血（１部）を0.1wt／vol％サポニン
水溶液（２部）に注意深く混合することによつて
つくつた。典型的には溶血物0.8μ（総ヘモグロ
ビンの約40μｇ）を、各サンプルウエルに適用し
た。 電気泳動セルベースの各ウエルには、ウエルバ
ツフアー90mlを入れた。ゲルはゲルホルダーカバ
ー中におかれ、セルベース中にセツトしたので、
ゲルの末端はバツフアー中に浸つていた。10ボル
ト／cmの定常的な場の強さが約30分適用された。 可視状態にする方法及び定量法 電気クロマトグラフイーによる分離工程の完了
時に、ゲルは、以下の２つの方法の何れか一つ
で、可視状態にされ、定量された。好ましい方法
によれば、ゲルを電気泳動セルから取り出し、コ
ーニングメデイカル乾燥炉中で約63℃で、約15分
間乾燥した。乾燥ゲルを、次いで、420mmのフイ
ルターを附したコーニングメデイカルモデル720
濃度計中で直接走査した。 或はまた、ゲルをアミドブラツク又はポンソ−
Ｓの何れかで染色標識した。各染色剤は、５％
（vol）の酢酸水１中に、染料1.0〜2.0ｇを溶か
すことによりつくつた。染色標識時間は５〜10分
程度で、そのあと、各ゲルを５％酢酸水で洗い、
コーニングメデイカル乾燥炉で20分間乾燥した。
乾燥ゲルから、稀酢酸溶液を用いて完全に脱色
し、次いで新しい稀酢酸溶液で洗つて、背景部分
の着色を完全に除いた。グリコシル化ヘモグロビ
ンは、コーニングメデイカル濃度計中で、アミド
ブラツクの場合は600nmで、ポンソーＳの場合は
520nmで、ゲルを走査することによつて定量し
た。 直接定量法の精度は、正常ヒト溶血―検体及び
糖尿病溶血の二検体を反復して行い、次いで
420nmでゲルを直接走査することによつて行つ
た。 得られたデータを第１表に一括して示す。 【表】 正常溶血検体では、平均が6.53であつた。標準
偏差は0.26で、変動係数は４％であり、血中グル
コース値は85mg％であつた。 糖尿病血溶血検体では、平均はそれぞれ10.08
及び19.22であり、標準変差は0.33及び0.4、変動
係数はそれぞれ3.3及び2.1％、そして、血中グル
コース値は158mg％及び348mg％であつた。 分離精度及び間接的定量法の精度も求められ
た。分離精度を求めるため、既知であるが予め判
明しているヘモグロビンA_1cを有するヘモグロビ
ンA₀とヘモグロビンA_1cの標準サンプルを予め混
合して、本発明の方法で処理した。それらサンプ
ルは、５％〜50％含量のヘモグロビンA_1cを含ん
でいた。 サンプル当り４つの測定値を用い、つくつたヘ
モグロビンA_1cの各含量における４つの測定値の
平均を第表に示す。 【表】 検出精度は、繰返し行つたヒト溶血及びアミノ
ブラツク又はポンソーＳ染色のいずれかを用いる
可視化によつて求めた。得られたデータを第表
に示す。 【表】 表のデータは統計的に解析された。アミドブ
ラツク染色した13個のサンプルを用いた場合、そ
の平均値は6.43（標準偏差0.39）であり、平均の
標準誤差は0.11であつた。同様にして、ポンソー
Ｓで染色した８個のサンプルを用いた平均値は、
7.45であつた。標準偏差は0.36であり、平均の標
準誤差は0.13であつた。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 寒天ゲルが0.1〜0.5mmの湿潤厚さで用いら
   れ、くえん酸塩ゲルバツフアーが0.02〜0.05Mの
   くえん酸塩濃度5.8〜6.8のPHで用いられ、くえん
   酸塩ウエルバツフアーが0.05〜0.1Mのくえん酸
   塩濃度、6.0〜6.5のPHで用いられ、そして場電流
   が５〜20ボルト／cmの強さで適用されていること
   を特徴とする、くえん酸塩寒天ゲル及びゲルバツ
   フアーを用い、電気クロマトグラフイーによりグ
   リコシル化されていないヘモグロビンからグリコ
   ヘモグロビンを個別的に分離する方法。 ２ ゲルが軟釈剤を10wt／vol％含有することを
   特徴とする特許請求の範囲第１項記載の方法。 ３ 軟釈剤が4wt／vol％のソルビトール及び／
   又は1.3wt／vol％のグリセロールよりなることを
   特徴とする特許請求の範囲第２項記載の方法。 ４ ゲルが0.1wt／vol％までの湿潤剤を含有する
   ことを特徴とする特許請求の範囲第１項または第
   ２項記載の方法。 ５ 湿潤剤が0.017wt／vol％のポリビニルアルコ
   ールからなつていることを特徴とする特許請求の
   範囲第４項記載の方法。 ６ ゲルの湿潤厚さが0.3〜0.5mmであることを特
   徴とする特許請求の範囲第１項から第５項のいず
   れか１項記載の方法。 ７ ゲルバツフアーが0.038Mのくえん酸塩濃度
   及び／又は６〜6.3のPHを持つことを特徴とする
   特許請求の範囲第１項から第６項のいずれか１項
   記載の方法。 ８ ウエルバツフアーが0.1Mのくえん酸塩濃度
   及び／又は６〜6.3のPHを持つことを特徴とする
   特許請求の範囲第１項から第７項のいずれか１項
   記載の方法。 ９ 場が10ボルト／cmの強さであることを特徴と
   する特許請求の範囲第１項から第８項のいずれか
   １項記載の方法。