JPS6339230B2 - - Google Patents
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- JPS6339230B2 JPS6339230B2 JP53120118A JP12011878A JPS6339230B2 JP S6339230 B2 JPS6339230 B2 JP S6339230B2 JP 53120118 A JP53120118 A JP 53120118A JP 12011878 A JP12011878 A JP 12011878A JP S6339230 B2 JPS6339230 B2 JP S6339230B2
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- enzyme
- coa synthetase
- coa
- acyl
- affinity chromatography
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Description
本発明は、長鎖アシル・コエンザイムＡ・シン
セターゼ（本明細書においては、アシルCoAシ
ンセターゼと略す。EC.6.2.1.3）の精製方法に関
するものである。 アシルCoAシンセターゼは、生体内における
脂肪酸酸化の第一段階に位置する重要な酵素であ
り、下記の反応に関与する。 RCOOH＋CoA＋ATP→RCOCoA＋AMP＋ピ
ロ燐酸 （なお、Ｒはアルキル基またはアルケニル基を
意味するものとする） その所在は、ラツトの肝臓、大腸菌、バチルス
属の細菌酵母等で知られているが膜結合性の酵素
であり、かつ、不安定であるため、これ迄、種々
の精製が試みられてきたが、純粋な標品として取
り出すことは出来なかつた。 例えば、デイー・サミユエル（D.Samuel）等
は、ユーロピアン・ジヤーナル・オブ・バイオケ
ミストリー（European Journal of
Biochemistry）12巻576〜582ページ（1970年）
において、エシエリヒア・コリ（Escherichia
coli以下E.Coliと記す。）のアシルCoAシンセタ
ーゼを精製しているが、完全に単一蛋白には精製
されておらず、又、蛋白質当りの比活性も低い。 又、ジエイ・バー・タナ（J.Bar.Tana）等は、
バイオケミカル・ジヤーナル（Biochemical―
Journal）122巻353〜362ページ（1971年）におい
てラツトの肝臓のミクロソームから、上記長鎖ア
シルCoAシンセターゼを精製しているが、ここ
でも単一性は電気泳動的に問題であり、又比活性
も低い。 本発明者等は、先に微生物のアシルCoAシン
セターゼを研究中、この酵素には２種類あり、そ
のうちの１種アシルCoAシンセターゼは脂肪
酸を直接脂質に取り込む系に関与するのに対し、
アシルCoAシンセターゼは脂肪酸のβ―酸化
系に関与する酵素であることを発見した。〔三品
等 ヨーロピアン・ジヤーナル・オブ・バイオケ
ミストリー（European Journal of
Biochemistry）82巻347〜354ページ（1978年）〕 本発明は、このうちアシルCoAシンセターゼ
の精製方法に関するものである。以下、アシル
CoAシンセターゼを該酵素と呼ぶ。 本発明者等は、微生物起源の長鎖アシルCoA
シンセターゼの精製方法について鋭意検討を続
けた結果、極めて比活性が高く、かつ、電気泳動
的に単一な上記酵素を取得する方法を発見し、本
発明を完成させた。 すなわち、本発明の要旨は、長鎖アシルCoA
シンセターゼ含有キヤンデイダ リポリテイカ
NRRL Ｙ―6795株を破砕後、ポリオキシエチレ
ンアルキルフエノール・エーテル類により膜に結
合した該酵素を可溶化する工程及び可溶化した該
酵素をアフイニテイー・クロマトグラフイーによ
り夾雑蛋白質より分離する工程を含むことを特徴
とする長鎖アシルCoAシンセターゼの精製方法
に存する。 尚、本菌は昭和62年11月17日に工業技術院微生
物工業技術研究所に微生物受託番号 微工研菌寄
第9711号（FERMP―9711）として受託されてい
る菌である。 本発明の１つの特色は、ポリオキシエチレンア
ルキルフエノール・エーテル類による膜からの該
酵素の可溶化及びアフイニテイ・クロマトグラフ
イーによる該酵素の夾雑蛋白からの分離にある。
これ迄のアシルCoAシンセターゼの精製におい
て、アフイニテイー・クロマトグラフイーが用い
られた報告はなかつたが、本発明者等が該酵素に
用いたところ本方法が極めて優れた方法であるこ
とが判明した。 本発明の一つの特徴は、該酵素をキヤンデイダ
リポリテイカ NRRL Ｙ―6795株より取得し
たことにある。 キヤンデイダ リポリテイカ NRRL Ｙ―
6795株は大量に容易に、かつ、安価に酵素を取得
する場合には極めて優れた給源であり、その意味
からも、本発明は該酵素の工業的な製造方法を提
供するものである。 本発明の更に一つの特徴は、得られた該酵素が
非常に純粋であり、かつ、比活性が従来のものの
50〜100倍程度と極めて高いということである。
すなわち、前述のE.Coliの該酵素では最も精製さ
れた段階においても電気泳動的に単一ではなく、
又、比活性も106mU／mg蛋白、又、ラツトの肝
臓の該酵素でも比活性は250mU／mg蛋白であつ
た。しかるに本発明の方法で精製されたCandida
lipolyticaの該酵素は電気泳動的にも全く単一で
あり、かつ、比活性も50〜100倍と極めて高い。 該酵素は、前記反応式で示した如く、遊離脂肪
酸から当量のAMPを生成するが、このAMPを下
記の反応系により測定すれば、酵素法により、血
中の遊離脂肪酸を測定することが出来る。（臨床
化学４巻２号179ページ（1975年）日本臨床研究
会参照） 従つて、本発明の方法により精製される該酵素
は、血中の遊離脂肪酸測定に用いる診断用酵素と
して極めて優れたものである。 又、生化学試薬として重要なラベル化されたア
シルCoAはラベル化された脂肪酸からの該酵素
を用いることにより極めて有利に製造することが
出来る。 次に本発明の詳細について説明する。 アシルCoAシンセターゼは、広い範囲の微
生物に存在しそこから抽出精製できるが、本発明
においては菌の生育が速く、該酵素の活性が高
く、又抽出しやすいことから、キヤンデイダ リ
ポリテイカ NRRL Ｙ―6795株が用いられる。
キヤンデイダ リポリテイカ NRRL Ｙ―6795
株の培養方法は特定されるものではなく、培地は
炭素源（たとえばグルコース）窒素源、燐酸、カ
リウム、マグネシウム等を含む、通常微生物の培
養に用いられるもので良く、又、培養温度、培養
時間等も通常の条件が用いられる。また、該酵素
を誘導的に生成する微生物の場合には誘導物質
（たとえば脂肪酸）を培地中に添加しても良い。 培養菌体は遠心分離、過等によつて集めた時
ホモゲナイザー、超音波、ガラス・ビーズによる
磨砕等の機械的手段、又は、細胞壁溶解酵素等に
よる化学的手段により細胞を破砕した後、遠心分
離により菌体の破片を除去する。 次に、この細胞顆粒部分を含む上澄液につい
て、界面活性剤処理を行ない、顆粒から該酵素を
遊離させる。 この操作に先立つて、この上澄液を超遠心処理
ににより一度顆粒画分を沈澱させ、適当な緩衝液
にけん濁させたものに対し、上記処理を行うこと
も出来る。 ポリオキシエチレンアルキルフエノール・エー
テル類は非イオン性の界面活性剤であり、好まし
い化合物はトライトン（Triton）Ｘ―100（商標
名；ローム・アンド・ハース社製、主成分イソオ
クチル・フエニルポリエトキシアルコール、以下
活性剤Ｔと呼ぶ。平均分子量を628と仮定する。）
である。 その添加量は、通常0.1〜1.0W／Ｖ％である。 この様な活性剤による該酵素の可溶化処理は、
通常30分〜２時間行なう。温度は低温たとえば０
〜10℃、好ましくは０〜４℃である。 この時、可溶化に伴なう失活を防ぐ為、処理液
中に燐酸緩衝液、メルカプトエタノール等の酵素
の保護剤、及びEDTA等を添加しても良い。 この様な条件下で可溶化された該酵素は超遠心
により顆粒画分より上澄として分離される。次
に、この液についてアフイニテイー・クロマトグ
ラフイーによる精製を行なうが、これに先立つ精
製操作を行なつても良い。 この様な操作の１つとして、ホスホセルロース
によるイオン交換クロマトグラフイーが用いられ
る。この操作によりアニオン性の蛋白質等が分離
除去される。ホスホ・セルロース・カラムクロマ
トグラフイーにおいて、通常該酵素の溶出には燐
酸緩衝液を用いるが、次のアフイニテイー・クロ
マトグラフイーに先立つて脱塩しておくことが好
ましい。 次に、この該酵素含有液をアフイニテイー・ク
ロマトグラフイーにより精製する。 この際の吸着体としてはADP，ATP，CoA等
に親和性を持つ酵素を特異的に吸着するものが選
ばれる。 すなわち、その構造の一部に、リガンドとして
ADP及び／またはCoAと構造類似性を有する部
分を持つものである。 ここでいう構造類似性とは、ADP，ATP及
び／またはCoAの関与する反応にあずかる酵素
に親和性を持ち特異的に吸着する性質をいう。こ
の様なADP，ATP及び／またはCoAと構造類似
性を有する物質としては、 式（） で示される１―アミノ―４―（4′―アミノフエニ
ルアミノ）―アンスラキノン―２，3′―ジスルホ
ン酸ソーダや、下記の一般式（）を有するチバ
クロン・ブルー（Cibacron blue）F3G―Ａ（商
標名・チバ・ガイギー社製（以下リガンドＣとい
う））があげられる。 （式中、R1＝Ｈまたは―SO3Na R2＝―SO3NaまたはＨ） これ等を構造類似性を損わない様な方法で支持
体に結合させたものが、本目的のための吸着体と
して好ましい。 スペーサーとしては、この際特に必要ではない
が挿入しても差支えない。 次に、これ等のリガンドの支持体としては、特
に限定されるものではないが、孔径（Pore size）
の大きいこと、リガンドとの結合条件の温和なこ
と、機械的強度の大きいこと、化学的に安定なこ
と、蛋白質の非特異的吸着が少ないこと等の点か
ら、多糖類や多孔性ガラスが望ましい。多糖類と
しては、テキストラン及びその架橋物、アガロー
ス及びその架橋物等が特に好ましく、また、ビー
ズ状のものは取り扱いが容易である。 これ等のアフイニテイー・クロマト用の吸着体
として最も好ましいものは、 一般式（） （式中、R1およびR2は、何れか１つが水素原
子、残りの１つが―SO3Na基を、Ｘは多糖残基
を表わすものとする。） で示されるものであり、このような吸着体として
市販されているものとしては、ブルーセフアロー
スCL―6B（商標名：フアーマシア・フアイン・
ケミカルズ社製（以下B.S.と略す））がある。こ
れは、前述のリガンドＣをリガンドとし、支持体
はセフアロースCL―6B（商標名：フアーマシ
ア・フアイン・ケミカルズ社製、主成分：架橋ア
ガロース）である。 該酵素含有液を上記アフイニテイー吸着体カラ
ムに吸着後、カラムにATP，ADP，AMP，
CoA等を含有する緩衝液を流すと蛋白質は溶出
してくるが、この蛋白画分には活性はない。次
に、このカラムに上記ATP含有緩衝液に塩化ナ
トリウムの０〜1.5Mのグラジエント条件を加え
た液でカラムを処理すると蛋白質が分離溶出して
くる。この時、該酵素は塩化ナトリウム濃度0.05
〜0.5Mの画分に単一ピークとなつて溶出する。 上記結果から該酵素のクロマトグラフイーによ
る分離は、単にアフイニテイーのみならず、イオ
ン交換もミツクスされたクロマトグラフイー分離
によるものであると思われる。 かくして得られた該酵素液は相当に高い比活性
を有するが、更に必要に応じて精製を行なつても
よい。 この際には、通常セフアデツクス（Sephadex）
Ｇ―100（商標名：フアーマシア・フアイン・ケミ
カルズ社製（以下Ｇ―100という））処理、更には
ハイドロキシ・アパタイト（hydroxyapatite）
クロマトグラフイー等が適当である。 この様な方法で得られたアシルCoAシンセタ
ーゼは極めて純粋であり、SDS電気泳動において
も単一バンドを与えた。 これ迄のアシルCoAシンセターゼの精製にお
いては、界面活性を有するデオキシコール酸が該
酵素の可溶化に用いられた例はあるが、この処理
後、通常の硫安塩析、イオン交換クロマトグラフ
イー等の手段では酵素の純度、比活性は不十分で
あつた。しかるに今回、上記界面活性剤による可
溶化処理と共にアフイニテイークロマトグラフイ
ーによる精製法を組み合せることにより極めて容
易に、また極めて純粋な酵素を単離出来ることが
わかつた。 アフイニテイークロマトグラフイーは最近酵素
の精製に広く応用されはじめ、脂質代謝関連酵素
にも漸次利用されているが、該酵素においては用
いられた例はなかつた。しかるに、本発明者等
は、該酵素において初めてアフイニテイークロマ
トグラフイーを適用したところ、これ迄の方法で
は該酵素との分離が困難であるとされていた、物
理的性質の類似した諸蛋白質、たとえばATPase
等も極めて容易に分離されることが判名した。 次に本発明を実施例により説明するが、本発明
は、この実施例のみに制限されるものではないこ
とは当然である。 〔活性の測定方法〕 活性測定はバニスとトーブ（Banis and
Tove）の方法（バイオキミカ・エ・バイオフイ
ジカアクタ）（Biochimica et Biophysica
Acta）348巻210〜220頁（1974年）参照によつ
た。すなわち反応液はトリス塩酸バツフアー（PH
7.5）20μmol，ATP3μmol，MgCl22μmol，ジチ
オスライトール1.0μmol，〔Ｕ― 14C〕パルミチ
ン酸カリ（0.2m Ci／ｍmol）0.2μmol，活性剤
T0.32μmol，CoA0.2μmol，酵素液で全量は0.2ml
とした。５分間予熱をした後、CoA又は酵素液
を添加することにより反応を開始し、（25℃）、10
分後イソプロパノール―ｎヘプタン―1MH2SO4
40：10：１を2.5ml添加して反応を停止させた。
未反応の遊離脂肪酸はヘプタンで抽出除去した。 水層を２回８mgのパルミチン酸を含んだ２mlの
ヘプタンで洗い、水層の放射能を測定した。 上記条件下で１分間で1μmolのパルミトイル
CoAを生成する酵素量を1Uと定義した。 〔蛋白質の測定法〕 ローリー（Lowry）法で行なつた。 実施例 １ キヤンデイダ・リポリテイカNRRL Ｙ―6795
株を２％グルコース，0.5％NH4，H2PO4，0.25
％KH2PO4，0.1％MgSO4・7H2O，0.002％
FeCl3・6H2O，0.1％バクト・イースト・エクス
トラクト（デイフコ社製U.S.A.）PH5.2なる組成
の培地500mlを含む２フラスコ24本を25℃、72
往復／分の条件下で振とう培養し、対数増殖期中
期の菌体を遠心分離により集め250ｇの湿潤菌体
を得た。 次に、この菌体を0.1M燐酸緩衝液（PH6.5）で
洗浄後、5mMのメルカプトエタノール及び1mM
EDTAを含む同一の燐酸緩衝液にけん濁し、ブ
ラウン・セル・ホモゲナイザー（メルシユンゲン
社製、西独）を用いて、液体CO2冷却下で破砕し
た。（以下全ての操作は０〜４℃で行なつた。） こうして出来たホモジエネートを8000Gで15〜
20分遠心分離して上澄部を取り、これを更に
230000Gで１時間超遠心して、その沈澱部分を取
り、前述の濃度の緩衝液、２―メルカプトエタノ
ール EDTAを含む液にけん濁した。（全量72
ml、蛋白濃度46mg／ml、この画分を顆粒画分と呼
ぶ。） 次に、このけん濁液を活性剤Ｔ，PH7.4燐酸緩
衝液、２―メルカプトエタノール、EDTAを含
む液と混合し、それぞれの終濃度が5mM、
50mM、5mM、0.5mMとなる様にした。 （蛋白濃度11mg／ml） 混合液を１時間静置後230000Gで１時間超遠心
してその上澄液265mlを集めた。 次に、この上澄液を1.5倍量の2mM活性剤Ｔ及
び5mM ２―メルカプト エタノール水溶液で希
釈した後、2mM活性剤Ｔ及び5mM2―メルカプ
トエタノールを含む20mM燐酸緩衝液（これを緩
衝液Ａという）で平衡化したホスホ・セルロース
ｐ―11（商標名：フアツトマン社製）のカラム
（52mm×75mm）に吸着させた。カラムを２倍量の
緩衝液Ａで洗つた後、カラムの2.5倍量の緩衝液
Ａ及び同量の0.5M燐酸緩衝液（PH7.4）（2mM活
性剤Ｔ及び5mMのメルカプトエタノール含有）
の間で、直線的にグラジエントをかけた溶出液で
溶出を行なつた。この時の流速は約90ml／hr、分
画は15mlであつた。該酵素は燐酸イオン濃度が
0.05〜0.15Mの間に単一ピークとして現れたので
比活性が0.28U／mg以上を示すフラクシヨン90ml
を集めた。 次に、この画分を脱塩する目的で緩衝液Ａで平
衡化したセフアデツクスＧ―50（商標名：フアー
マシアフアインケミカルズ社製）のカラム（38mm
×350mm）を通して溶出する全蛋白画分を合した
後、同じ緩衝液で平衡化したB.S.のカラム（16mm
×100mm）にかけた。カラムをカラム容量と等し
い緩衝液Ａで洗浄後、10mM ATPを含むカラム
容量の２倍量の緩衝液Ａで洗浄した。次いで
10mM ATPを含む3.75倍量の緩衝液及びこの組
成に更に1.5M NaClを添加した同量の液を用い
た直線的なグラジエント条件下で流速30ml／hr，
10ml分画で該酵素の溶出を行なつた。 該酵素はNaCl濃度0.1〜0.3Mの間で単一ピーク
となつて溶出した。比活性2.6U／mg以上の分画
50mlを合せた。 次に、この溶出液の分画をダイヤフロー・メン
ブラン・フイルターPM―30（アミコン・フア
ー・イースト社製東京）を用いて10ml迄限外過
濃縮を行なつた後、緩衝液Ａで平衡化したＧ―
100のカラム（27mm×870mm）にかけ緩衝液Ａを流
速30ml／hrで流して溶出液を10mlずつ分画した。
溶出パターンは第１図の通りで、酵素活性は２番
目のピークと一致した。比活性が9U／mg以上を
示す分画40mlを集めた。この分画はSDS―ポリア
クリルアミド・ゲル電気泳動において完全に単一
なパンドを示し、純粋なアシルCoAシンセター
ゼであることがわかつた。 表１に上記方法における各精製段階でのデータ
を示す。
セターゼ（本明細書においては、アシルCoAシ
ンセターゼと略す。EC.6.2.1.3）の精製方法に関
するものである。 アシルCoAシンセターゼは、生体内における
脂肪酸酸化の第一段階に位置する重要な酵素であ
り、下記の反応に関与する。 RCOOH＋CoA＋ATP→RCOCoA＋AMP＋ピ
ロ燐酸 （なお、Ｒはアルキル基またはアルケニル基を
意味するものとする） その所在は、ラツトの肝臓、大腸菌、バチルス
属の細菌酵母等で知られているが膜結合性の酵素
であり、かつ、不安定であるため、これ迄、種々
の精製が試みられてきたが、純粋な標品として取
り出すことは出来なかつた。 例えば、デイー・サミユエル（D.Samuel）等
は、ユーロピアン・ジヤーナル・オブ・バイオケ
ミストリー（European Journal of
Biochemistry）12巻576〜582ページ（1970年）
において、エシエリヒア・コリ（Escherichia
coli以下E.Coliと記す。）のアシルCoAシンセタ
ーゼを精製しているが、完全に単一蛋白には精製
されておらず、又、蛋白質当りの比活性も低い。 又、ジエイ・バー・タナ（J.Bar.Tana）等は、
バイオケミカル・ジヤーナル（Biochemical―
Journal）122巻353〜362ページ（1971年）におい
てラツトの肝臓のミクロソームから、上記長鎖ア
シルCoAシンセターゼを精製しているが、ここ
でも単一性は電気泳動的に問題であり、又比活性
も低い。 本発明者等は、先に微生物のアシルCoAシン
セターゼを研究中、この酵素には２種類あり、そ
のうちの１種アシルCoAシンセターゼは脂肪
酸を直接脂質に取り込む系に関与するのに対し、
アシルCoAシンセターゼは脂肪酸のβ―酸化
系に関与する酵素であることを発見した。〔三品
等 ヨーロピアン・ジヤーナル・オブ・バイオケ
ミストリー（European Journal of
Biochemistry）82巻347〜354ページ（1978年）〕 本発明は、このうちアシルCoAシンセターゼ
の精製方法に関するものである。以下、アシル
CoAシンセターゼを該酵素と呼ぶ。 本発明者等は、微生物起源の長鎖アシルCoA
シンセターゼの精製方法について鋭意検討を続
けた結果、極めて比活性が高く、かつ、電気泳動
的に単一な上記酵素を取得する方法を発見し、本
発明を完成させた。 すなわち、本発明の要旨は、長鎖アシルCoA
シンセターゼ含有キヤンデイダ リポリテイカ
NRRL Ｙ―6795株を破砕後、ポリオキシエチレ
ンアルキルフエノール・エーテル類により膜に結
合した該酵素を可溶化する工程及び可溶化した該
酵素をアフイニテイー・クロマトグラフイーによ
り夾雑蛋白質より分離する工程を含むことを特徴
とする長鎖アシルCoAシンセターゼの精製方法
に存する。 尚、本菌は昭和62年11月17日に工業技術院微生
物工業技術研究所に微生物受託番号 微工研菌寄
第9711号（FERMP―9711）として受託されてい
る菌である。 本発明の１つの特色は、ポリオキシエチレンア
ルキルフエノール・エーテル類による膜からの該
酵素の可溶化及びアフイニテイ・クロマトグラフ
イーによる該酵素の夾雑蛋白からの分離にある。
これ迄のアシルCoAシンセターゼの精製におい
て、アフイニテイー・クロマトグラフイーが用い
られた報告はなかつたが、本発明者等が該酵素に
用いたところ本方法が極めて優れた方法であるこ
とが判明した。 本発明の一つの特徴は、該酵素をキヤンデイダ
リポリテイカ NRRL Ｙ―6795株より取得し
たことにある。 キヤンデイダ リポリテイカ NRRL Ｙ―
6795株は大量に容易に、かつ、安価に酵素を取得
する場合には極めて優れた給源であり、その意味
からも、本発明は該酵素の工業的な製造方法を提
供するものである。 本発明の更に一つの特徴は、得られた該酵素が
非常に純粋であり、かつ、比活性が従来のものの
50〜100倍程度と極めて高いということである。
すなわち、前述のE.Coliの該酵素では最も精製さ
れた段階においても電気泳動的に単一ではなく、
又、比活性も106mU／mg蛋白、又、ラツトの肝
臓の該酵素でも比活性は250mU／mg蛋白であつ
た。しかるに本発明の方法で精製されたCandida
lipolyticaの該酵素は電気泳動的にも全く単一で
あり、かつ、比活性も50〜100倍と極めて高い。 該酵素は、前記反応式で示した如く、遊離脂肪
酸から当量のAMPを生成するが、このAMPを下
記の反応系により測定すれば、酵素法により、血
中の遊離脂肪酸を測定することが出来る。（臨床
化学４巻２号179ページ（1975年）日本臨床研究
会参照） 従つて、本発明の方法により精製される該酵素
は、血中の遊離脂肪酸測定に用いる診断用酵素と
して極めて優れたものである。 又、生化学試薬として重要なラベル化されたア
シルCoAはラベル化された脂肪酸からの該酵素
を用いることにより極めて有利に製造することが
出来る。 次に本発明の詳細について説明する。 アシルCoAシンセターゼは、広い範囲の微
生物に存在しそこから抽出精製できるが、本発明
においては菌の生育が速く、該酵素の活性が高
く、又抽出しやすいことから、キヤンデイダ リ
ポリテイカ NRRL Ｙ―6795株が用いられる。
キヤンデイダ リポリテイカ NRRL Ｙ―6795
株の培養方法は特定されるものではなく、培地は
炭素源（たとえばグルコース）窒素源、燐酸、カ
リウム、マグネシウム等を含む、通常微生物の培
養に用いられるもので良く、又、培養温度、培養
時間等も通常の条件が用いられる。また、該酵素
を誘導的に生成する微生物の場合には誘導物質
（たとえば脂肪酸）を培地中に添加しても良い。 培養菌体は遠心分離、過等によつて集めた時
ホモゲナイザー、超音波、ガラス・ビーズによる
磨砕等の機械的手段、又は、細胞壁溶解酵素等に
よる化学的手段により細胞を破砕した後、遠心分
離により菌体の破片を除去する。 次に、この細胞顆粒部分を含む上澄液につい
て、界面活性剤処理を行ない、顆粒から該酵素を
遊離させる。 この操作に先立つて、この上澄液を超遠心処理
ににより一度顆粒画分を沈澱させ、適当な緩衝液
にけん濁させたものに対し、上記処理を行うこと
も出来る。 ポリオキシエチレンアルキルフエノール・エー
テル類は非イオン性の界面活性剤であり、好まし
い化合物はトライトン（Triton）Ｘ―100（商標
名；ローム・アンド・ハース社製、主成分イソオ
クチル・フエニルポリエトキシアルコール、以下
活性剤Ｔと呼ぶ。平均分子量を628と仮定する。）
である。 その添加量は、通常0.1〜1.0W／Ｖ％である。 この様な活性剤による該酵素の可溶化処理は、
通常30分〜２時間行なう。温度は低温たとえば０
〜10℃、好ましくは０〜４℃である。 この時、可溶化に伴なう失活を防ぐ為、処理液
中に燐酸緩衝液、メルカプトエタノール等の酵素
の保護剤、及びEDTA等を添加しても良い。 この様な条件下で可溶化された該酵素は超遠心
により顆粒画分より上澄として分離される。次
に、この液についてアフイニテイー・クロマトグ
ラフイーによる精製を行なうが、これに先立つ精
製操作を行なつても良い。 この様な操作の１つとして、ホスホセルロース
によるイオン交換クロマトグラフイーが用いられ
る。この操作によりアニオン性の蛋白質等が分離
除去される。ホスホ・セルロース・カラムクロマ
トグラフイーにおいて、通常該酵素の溶出には燐
酸緩衝液を用いるが、次のアフイニテイー・クロ
マトグラフイーに先立つて脱塩しておくことが好
ましい。 次に、この該酵素含有液をアフイニテイー・ク
ロマトグラフイーにより精製する。 この際の吸着体としてはADP，ATP，CoA等
に親和性を持つ酵素を特異的に吸着するものが選
ばれる。 すなわち、その構造の一部に、リガンドとして
ADP及び／またはCoAと構造類似性を有する部
分を持つものである。 ここでいう構造類似性とは、ADP，ATP及
び／またはCoAの関与する反応にあずかる酵素
に親和性を持ち特異的に吸着する性質をいう。こ
の様なADP，ATP及び／またはCoAと構造類似
性を有する物質としては、 式（） で示される１―アミノ―４―（4′―アミノフエニ
ルアミノ）―アンスラキノン―２，3′―ジスルホ
ン酸ソーダや、下記の一般式（）を有するチバ
クロン・ブルー（Cibacron blue）F3G―Ａ（商
標名・チバ・ガイギー社製（以下リガンドＣとい
う））があげられる。 （式中、R1＝Ｈまたは―SO3Na R2＝―SO3NaまたはＨ） これ等を構造類似性を損わない様な方法で支持
体に結合させたものが、本目的のための吸着体と
して好ましい。 スペーサーとしては、この際特に必要ではない
が挿入しても差支えない。 次に、これ等のリガンドの支持体としては、特
に限定されるものではないが、孔径（Pore size）
の大きいこと、リガンドとの結合条件の温和なこ
と、機械的強度の大きいこと、化学的に安定なこ
と、蛋白質の非特異的吸着が少ないこと等の点か
ら、多糖類や多孔性ガラスが望ましい。多糖類と
しては、テキストラン及びその架橋物、アガロー
ス及びその架橋物等が特に好ましく、また、ビー
ズ状のものは取り扱いが容易である。 これ等のアフイニテイー・クロマト用の吸着体
として最も好ましいものは、 一般式（） （式中、R1およびR2は、何れか１つが水素原
子、残りの１つが―SO3Na基を、Ｘは多糖残基
を表わすものとする。） で示されるものであり、このような吸着体として
市販されているものとしては、ブルーセフアロー
スCL―6B（商標名：フアーマシア・フアイン・
ケミカルズ社製（以下B.S.と略す））がある。こ
れは、前述のリガンドＣをリガンドとし、支持体
はセフアロースCL―6B（商標名：フアーマシ
ア・フアイン・ケミカルズ社製、主成分：架橋ア
ガロース）である。 該酵素含有液を上記アフイニテイー吸着体カラ
ムに吸着後、カラムにATP，ADP，AMP，
CoA等を含有する緩衝液を流すと蛋白質は溶出
してくるが、この蛋白画分には活性はない。次
に、このカラムに上記ATP含有緩衝液に塩化ナ
トリウムの０〜1.5Mのグラジエント条件を加え
た液でカラムを処理すると蛋白質が分離溶出して
くる。この時、該酵素は塩化ナトリウム濃度0.05
〜0.5Mの画分に単一ピークとなつて溶出する。 上記結果から該酵素のクロマトグラフイーによ
る分離は、単にアフイニテイーのみならず、イオ
ン交換もミツクスされたクロマトグラフイー分離
によるものであると思われる。 かくして得られた該酵素液は相当に高い比活性
を有するが、更に必要に応じて精製を行なつても
よい。 この際には、通常セフアデツクス（Sephadex）
Ｇ―100（商標名：フアーマシア・フアイン・ケミ
カルズ社製（以下Ｇ―100という））処理、更には
ハイドロキシ・アパタイト（hydroxyapatite）
クロマトグラフイー等が適当である。 この様な方法で得られたアシルCoAシンセタ
ーゼは極めて純粋であり、SDS電気泳動において
も単一バンドを与えた。 これ迄のアシルCoAシンセターゼの精製にお
いては、界面活性を有するデオキシコール酸が該
酵素の可溶化に用いられた例はあるが、この処理
後、通常の硫安塩析、イオン交換クロマトグラフ
イー等の手段では酵素の純度、比活性は不十分で
あつた。しかるに今回、上記界面活性剤による可
溶化処理と共にアフイニテイークロマトグラフイ
ーによる精製法を組み合せることにより極めて容
易に、また極めて純粋な酵素を単離出来ることが
わかつた。 アフイニテイークロマトグラフイーは最近酵素
の精製に広く応用されはじめ、脂質代謝関連酵素
にも漸次利用されているが、該酵素においては用
いられた例はなかつた。しかるに、本発明者等
は、該酵素において初めてアフイニテイークロマ
トグラフイーを適用したところ、これ迄の方法で
は該酵素との分離が困難であるとされていた、物
理的性質の類似した諸蛋白質、たとえばATPase
等も極めて容易に分離されることが判名した。 次に本発明を実施例により説明するが、本発明
は、この実施例のみに制限されるものではないこ
とは当然である。 〔活性の測定方法〕 活性測定はバニスとトーブ（Banis and
Tove）の方法（バイオキミカ・エ・バイオフイ
ジカアクタ）（Biochimica et Biophysica
Acta）348巻210〜220頁（1974年）参照によつ
た。すなわち反応液はトリス塩酸バツフアー（PH
7.5）20μmol，ATP3μmol，MgCl22μmol，ジチ
オスライトール1.0μmol，〔Ｕ― 14C〕パルミチ
ン酸カリ（0.2m Ci／ｍmol）0.2μmol，活性剤
T0.32μmol，CoA0.2μmol，酵素液で全量は0.2ml
とした。５分間予熱をした後、CoA又は酵素液
を添加することにより反応を開始し、（25℃）、10
分後イソプロパノール―ｎヘプタン―1MH2SO4
40：10：１を2.5ml添加して反応を停止させた。
未反応の遊離脂肪酸はヘプタンで抽出除去した。 水層を２回８mgのパルミチン酸を含んだ２mlの
ヘプタンで洗い、水層の放射能を測定した。 上記条件下で１分間で1μmolのパルミトイル
CoAを生成する酵素量を1Uと定義した。 〔蛋白質の測定法〕 ローリー（Lowry）法で行なつた。 実施例 １ キヤンデイダ・リポリテイカNRRL Ｙ―6795
株を２％グルコース，0.5％NH4，H2PO4，0.25
％KH2PO4，0.1％MgSO4・7H2O，0.002％
FeCl3・6H2O，0.1％バクト・イースト・エクス
トラクト（デイフコ社製U.S.A.）PH5.2なる組成
の培地500mlを含む２フラスコ24本を25℃、72
往復／分の条件下で振とう培養し、対数増殖期中
期の菌体を遠心分離により集め250ｇの湿潤菌体
を得た。 次に、この菌体を0.1M燐酸緩衝液（PH6.5）で
洗浄後、5mMのメルカプトエタノール及び1mM
EDTAを含む同一の燐酸緩衝液にけん濁し、ブ
ラウン・セル・ホモゲナイザー（メルシユンゲン
社製、西独）を用いて、液体CO2冷却下で破砕し
た。（以下全ての操作は０〜４℃で行なつた。） こうして出来たホモジエネートを8000Gで15〜
20分遠心分離して上澄部を取り、これを更に
230000Gで１時間超遠心して、その沈澱部分を取
り、前述の濃度の緩衝液、２―メルカプトエタノ
ール EDTAを含む液にけん濁した。（全量72
ml、蛋白濃度46mg／ml、この画分を顆粒画分と呼
ぶ。） 次に、このけん濁液を活性剤Ｔ，PH7.4燐酸緩
衝液、２―メルカプトエタノール、EDTAを含
む液と混合し、それぞれの終濃度が5mM、
50mM、5mM、0.5mMとなる様にした。 （蛋白濃度11mg／ml） 混合液を１時間静置後230000Gで１時間超遠心
してその上澄液265mlを集めた。 次に、この上澄液を1.5倍量の2mM活性剤Ｔ及
び5mM ２―メルカプト エタノール水溶液で希
釈した後、2mM活性剤Ｔ及び5mM2―メルカプ
トエタノールを含む20mM燐酸緩衝液（これを緩
衝液Ａという）で平衡化したホスホ・セルロース
ｐ―11（商標名：フアツトマン社製）のカラム
（52mm×75mm）に吸着させた。カラムを２倍量の
緩衝液Ａで洗つた後、カラムの2.5倍量の緩衝液
Ａ及び同量の0.5M燐酸緩衝液（PH7.4）（2mM活
性剤Ｔ及び5mMのメルカプトエタノール含有）
の間で、直線的にグラジエントをかけた溶出液で
溶出を行なつた。この時の流速は約90ml／hr、分
画は15mlであつた。該酵素は燐酸イオン濃度が
0.05〜0.15Mの間に単一ピークとして現れたので
比活性が0.28U／mg以上を示すフラクシヨン90ml
を集めた。 次に、この画分を脱塩する目的で緩衝液Ａで平
衡化したセフアデツクスＧ―50（商標名：フアー
マシアフアインケミカルズ社製）のカラム（38mm
×350mm）を通して溶出する全蛋白画分を合した
後、同じ緩衝液で平衡化したB.S.のカラム（16mm
×100mm）にかけた。カラムをカラム容量と等し
い緩衝液Ａで洗浄後、10mM ATPを含むカラム
容量の２倍量の緩衝液Ａで洗浄した。次いで
10mM ATPを含む3.75倍量の緩衝液及びこの組
成に更に1.5M NaClを添加した同量の液を用い
た直線的なグラジエント条件下で流速30ml／hr，
10ml分画で該酵素の溶出を行なつた。 該酵素はNaCl濃度0.1〜0.3Mの間で単一ピーク
となつて溶出した。比活性2.6U／mg以上の分画
50mlを合せた。 次に、この溶出液の分画をダイヤフロー・メン
ブラン・フイルターPM―30（アミコン・フア
ー・イースト社製東京）を用いて10ml迄限外過
濃縮を行なつた後、緩衝液Ａで平衡化したＧ―
100のカラム（27mm×870mm）にかけ緩衝液Ａを流
速30ml／hrで流して溶出液を10mlずつ分画した。
溶出パターンは第１図の通りで、酵素活性は２番
目のピークと一致した。比活性が9U／mg以上を
示す分画40mlを集めた。この分画はSDS―ポリア
クリルアミド・ゲル電気泳動において完全に単一
なパンドを示し、純粋なアシルCoAシンセター
ゼであることがわかつた。 表１に上記方法における各精製段階でのデータ
を示す。
２ コフアクターの要求性
ATP Mg++CoA
３ 基質特異性 表―２
４ 至適PH 7.1〜9.6
【表】
参考例 １
実施例１の方法で精製されたアシルCoAシン
セターゼを用いて脂肪酸量を測定した。反応液１
ml当り、所定量のオレイン酸カリウム，100μmol
トリスHCl緩衝液（PH7.4）、5μmolジチオスライ
トール、1.6μmol活性剤Ｔ、7.5μmolATP、
10μmolMgCl2，0.2μmolホスホ・エノール・ピル
ビン酸カリ0.15μmolNADH、20μｇアデニレート
キナーゼ、30μｇパイルベート・キナーゼ、30μ
ｇラクテート・デヒドロゲナーゼ、精製アシル
CoAシンセターゼ4μｇを含む液を分光光度計
（エツペンドルフ社製1101M型）のセルに入れ25
℃、１分間予熱した後、0.5μmolのCoA溶液を添
加して（全液量0.5ml）反応を開始しNADHの減
少に伴なうO.D.334nmの変化をレコーダーの記録
から読み取つた。反応液中のオレイン酸カリウム
と△O.D.334nmの関係は第２図の如く、オレイン
酸量０〜25nmolesの間では良い直線性が得られ
た。 参考例 ２ 参考例１と同様の方法を用いて10nmol量の各
種長鎖脂肪酸と△O.D.334nmの関係を求めた。 結果は、表―３の如く△O.D.334nmの理論値
0.246（アツシユ・ウー・ベルグメイヤー（H.U.
Bergmeyer），ツマイトシユリフト・ヒユア・ク
リニツシエ・ヘミー・ウント・クリニツシユ・ビ
オヘミー（Zeitschrift fu¨r Klinische Chemie.
und Klinische Biochemie）13巻507〜508ページ
（1975年）に対し、良く一致していた。
セターゼを用いて脂肪酸量を測定した。反応液１
ml当り、所定量のオレイン酸カリウム，100μmol
トリスHCl緩衝液（PH7.4）、5μmolジチオスライ
トール、1.6μmol活性剤Ｔ、7.5μmolATP、
10μmolMgCl2，0.2μmolホスホ・エノール・ピル
ビン酸カリ0.15μmolNADH、20μｇアデニレート
キナーゼ、30μｇパイルベート・キナーゼ、30μ
ｇラクテート・デヒドロゲナーゼ、精製アシル
CoAシンセターゼ4μｇを含む液を分光光度計
（エツペンドルフ社製1101M型）のセルに入れ25
℃、１分間予熱した後、0.5μmolのCoA溶液を添
加して（全液量0.5ml）反応を開始しNADHの減
少に伴なうO.D.334nmの変化をレコーダーの記録
から読み取つた。反応液中のオレイン酸カリウム
と△O.D.334nmの関係は第２図の如く、オレイン
酸量０〜25nmolesの間では良い直線性が得られ
た。 参考例 ２ 参考例１と同様の方法を用いて10nmol量の各
種長鎖脂肪酸と△O.D.334nmの関係を求めた。 結果は、表―３の如く△O.D.334nmの理論値
0.246（アツシユ・ウー・ベルグメイヤー（H.U.
Bergmeyer），ツマイトシユリフト・ヒユア・ク
リニツシエ・ヘミー・ウント・クリニツシユ・ビ
オヘミー（Zeitschrift fu¨r Klinische Chemie.
und Klinische Biochemie）13巻507〜508ページ
（1975年）に対し、良く一致していた。
第１図は、実施例１におけるアシルCoAシン
セターゼの溶出を示すグラフで、横軸は流出液量
（ml）、縦軸はアシルCoAシンセターゼの活性
（Ｕ／ml）（左側）および蛋白質（mg／ml）（右側）
であり、●印がアシルCoAシンセターゼの活性、
〇印が蛋白量を示す。第２図は、参考側１の脂肪
酸量とODの関係を表わすグラフで、横軸は脂肪
酸量（nmole）縦軸は△O.D.334nmである。
セターゼの溶出を示すグラフで、横軸は流出液量
（ml）、縦軸はアシルCoAシンセターゼの活性
（Ｕ／ml）（左側）および蛋白質（mg／ml）（右側）
であり、●印がアシルCoAシンセターゼの活性、
〇印が蛋白量を示す。第２図は、参考側１の脂肪
酸量とODの関係を表わすグラフで、横軸は脂肪
酸量（nmole）縦軸は△O.D.334nmである。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ 長鎖アシルCoAシンセターゼ含有キヤンデ
イダ リポリテイカ NRRL Ｙ―6795株を粉砕
後、ポリオキシエチレンアルキルフエノール・エ
ーテル類により膜に結合した該酵素を可溶化する
工程及び可溶化した該酵素をアフイニテイー・ク
ロマトグラフイーにより爽雑蛋白質より分離する
工程を含むことを特徴とする長鎖アシルCoAシ
ンセターゼの精製方法。 ２ 特許請求の範囲第１項記載の長鎖アシル
CoAシンセターゼの精製方法において、アフイ
ニテイー・クロマトグラフイーがADP、ATPお
よび／またはCoAの構造類似体をリガンドとす
るアフイニテイー・クロマトグラフイーであるこ
とを特徴とする方法。 ３ 特許請求の範囲第２項記載の長鎖アシル
CoAシンセターゼの精製方法において、リガン
ドが一般式（） （式中、R1およびR2は、何れか１つが水素原
子、残りの１つが―SO3Na基を表わすものとす
る。） で示されるものであることを特徴とする方法。 ４ 特許請求の範囲第２項記載の長鎖アシル
CoAシンセターゼの精製方法において、アフイ
ニテイー・クロマトグラフイーの吸着体が一般式
（） （式中、R1およびR2は、何れか１つが水素原
子、残りの１つが―SO3Na基を、Ｘは多糖残基
を表わすものとする。） で示されるものであることを特徴とする方法。
Priority Applications (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP12011878A JPS5548390A (en) | 1978-09-29 | 1978-09-29 | Purification of long-chain acyl coa synthetase |
| DE7979103706T DE2962521D1 (en) | 1978-09-29 | 1979-09-28 | Process for the purification of long-chain acyl-coenzyme-a synthetase and the enzyme, acyl-coa synthetase, purified thereby |
| EP79103706A EP0009781B2 (en) | 1978-09-29 | 1979-09-28 | Process for the purification of long-chain acyl-coenzyme-a synthetase and the enzyme, acyl-coa synthetase, purified thereby |
| DK410179A DK151634C (da) | 1978-09-29 | 1979-09-28 | Fremgangsmaade til rensning af langkaedet acyl-coenzym-a-syntetase |
| US06/080,218 US4304864A (en) | 1978-09-29 | 1979-10-01 | Long-chain acyl-coenzyme-A synthetase |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP12011878A JPS5548390A (en) | 1978-09-29 | 1978-09-29 | Purification of long-chain acyl coa synthetase |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS5548390A JPS5548390A (en) | 1980-04-07 |
| JPS6339230B2 true JPS6339230B2 (ja) | 1988-08-04 |
Family
ID=14778394
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP12011878A Granted JPS5548390A (en) | 1978-09-29 | 1978-09-29 | Purification of long-chain acyl coa synthetase |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS5548390A (ja) |
-
1978
- 1978-09-29 JP JP12011878A patent/JPS5548390A/ja active Granted
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS5548390A (en) | 1980-04-07 |
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