【発明の詳細な説明】[Detailed description of the invention]
本発明は、少なくとも、ストレプトコツカス・
ミユータンスなどの口腔内細菌によるシユクロー
スの存在下不溶性グルカンの合成酵素であるグル
コシルトランスフエラーゼを阻害する作用を有す
る酸性蛋白質系のM5071様物質に関する。詳しく
は、少なくとも、グルコシルトランスフエラーゼ
を阻害する作用を有する酸性蛋白質系のM5071様
物質M5093物質に関する。
本発明者らは、先に、東京都下小笠原村父島に
て採取した植物の葉（樹種不明）より分離した不
完全菌アースリニウム・エス・ピーM5071株
（Arthrinium sp.M5071：FERM―ＰNo.5352）の
培養物中に、虫歯の原因菌の一種であるストレプ
トコツカス・ミユータンスなどによるシユクロー
スの存在下不溶性グルカンの合成酵素であるグル
コシルトランスフエラーゼを阻害する作用を有す
る酸性蛋白質系の新規物質を見い出し、本物質を
M5071物質と命名した（特願昭55―5128号）。
さらに本発明者らは、東京都下小笠原村母島に
て採取したトウモロコシの茎部より分離されたフ
ザリウム（Fusarium）属に属すると同定された
糸状菌M5084株（Fusarium solani M5084：
FERM―ＰNo.5546）の培養物中に、上記M5071
物質に類似する性状を有する、虫歯の原因菌の一
種であるストレプトコツカス・ミユータンスなど
によるジユクロースの存在下不溶性グルカンの合
成酵素であるグルコシルトランスフエラーゼを阻
害する作用を有する酸性蛋白質系の新規な物質２
種を見い出し、各々、M5071様物質M5084I物質、
M5071様物質M5084物質と命名した（特願昭55
―104056号）。
さらにまた本研究者らは、マクロフオーミナ・
ハゼオリー・IF07318株（Macrophomina
phaseoliIF07318：INSTITUTE FOR
FERMENTATION OSAKA.LIST OF CUL―
TURES 1978.SIXTH EDITION）の培養物中
に、同様に上記M5071物質と類似する性状を有す
る、シユクロースの存在下不溶性グルカンの合成
酵素であるグルコシルトランスフエラーゼを阻害
する作用を有する酸性蛋白質系の新規な物質を見
い出し、M5071様物質M4400物質と命名した（特
願昭55―104056号）。
さらに本発明者らは、石川県山中町にて採取さ
れた落葉（樹種不明）より分離されたグノモニエ
ラ（Gnomoniella）属に属すると同定された糸状
菌M5093株の各々の培養物中に、前記M5071物質
に類似する性質を有する、虫歯の原因菌の一種で
あるストレプトコツカス・ミユータンスなどによ
るシユクロースの存在下不溶性グルカンの合成酵
素であるグルコシルトランスフエラーゼの活性を
阻害する作用を有する酸性蛋白質系の新規物質を
見い出し、M5071様物質M5093物質と命名した。
本発明の糸状菌M5093株の培養物より得られた
M5071様物質M5093物質は、少なくとも、下記第
１表に示す理化学的性質を有する物質である（参
考として、特願昭55―5128号に記載のM5071物質
の理化学的性質を併記する）。
The present invention provides at least Streptococcus
This invention relates to an acidic protein-based M5071-like substance that has the effect of inhibiting glucosyltransferase, which is an enzyme that synthesizes insoluble glucan in the presence of sucrose, produced by oral bacteria such as P. myutans. Specifically, the present invention relates to M5093, an acidic protein-based M5071-like substance that has at least the effect of inhibiting glucosyltransferase. The present inventors previously discovered that the Deuteromycosis strain Arthrinium sp. ), a new acidic protein-based substance that has the effect of inhibiting glucosyltransferase, an insoluble glucan synthesizing enzyme, in the presence of sucrose produced by Streptococcus miutans, a type of cavity-causing bacteria, was added. Heading, this substance
The substance was named M5071 (Patent Application No. 5128-1983). Furthermore, the present inventors investigated the filamentous fungus strain M5084 (Fusarium solani M5084), which was isolated from the stalks of corn collected in Hahajima, Shimo-Ogasawara Village, Tokyo.
In the culture of FERM-P No. 5546), the above M5071
A novel acidic protein that has properties similar to those of Streptococcus miutans, a type of cavity-causing bacteria, which has the effect of inhibiting glucosyltransferase, an insoluble glucan synthesizing enzyme, in the presence of diucrose. substance 2
Found the species, respectively, M5071-like substance M5084I substance,
The M5071-like substance was named the M5084 substance (patent application 1983).
- No. 104056). Furthermore, the present researchers also
Haseolyi IF07318 strain (Macrophomina
phaseoliIF07318:INSTITUTE FOR
FERMENTATION OSAKA.LIST OF CUL―
TURES 1978.SIXTH EDITION), a novel acidic protein system that has properties similar to the above-mentioned substance M5071 and has the effect of inhibiting glucosyltransferase, an insoluble glucan synthesizing enzyme, in the presence of sucrose. discovered a substance that resembled M5071 and named it the M4400 substance (Patent Application No. 104056-1981). Furthermore, the present inventors found that the M5071 strain was isolated from fallen leaves (tree species unknown) collected in Yamanaka-cho, Ishikawa Prefecture, and was identified as belonging to the genus Gnomoniella. An acidic protein that has properties similar to substances that inhibit the activity of glucosyltransferase, an enzyme that synthesizes insoluble glucan in the presence of sucrose, which is produced by Streptococcus miutans, a type of cavity-causing bacteria. We discovered a new substance and named it the M5071-like substance M5093. Obtained from a culture of the filamentous fungus M5093 strain of the present invention
The M5071-like substance M5093 substance is a substance that has at least the physicochemical properties shown in Table 1 below (for reference, the physicochemical properties of the M5071 substance described in Japanese Patent Application No. 5128/1982 are also listed).
【表】【table】
【表】
また本発明のM5071様物質M5093物質の力価の
測定法としては、シユクロース存在下におけるグ
ルコシルトランスフエラーゼを用いた不溶性グル
カンの合成の阻害度を観察することによつて行な
われるもので、次の通りである。
ストレプトコツカス・ミユータンスOMZ176を
BHI培地で２日間培養し、除菌後、培養液を
硫安沈澱し、この沈澱物を集め、水に溶解し、透
析して、培養液の約50倍に濃縮した、ストレプ
トコツカス・ミユータンスによる不溶性グルカン
合成を触媒するグルコシルトランスフエラーゼ含
有液0.1ml、本発明の各M5071様物質含有液0.1
ml、0.5Mリン酸緩衝液0.1ml、1Mシユクロース
0.1mlからなる反応液を、37℃でインキユベイト
する。一方対照として、本発明のM5071様物質
M5093物質含有液の代りに水を使用する。また本
発明のM5071様物質M5093物質含有液は、あらか
じめ数段階に希釈しておく、２時間後、対照の場
合にて不溶性グルカンが合成されていることを確
認する。活性は、各希釈されたM5071様物質
M5093物質含有液の状態を観察し、不溶性グルカ
ンの合成が阻害された最高希釈度をもつてその力
価とする（例えば、100倍希釈で阻害作用を示し、
120倍希釈で阻害作用を示さない場合は、その力
価を100とする）。求める本発明のM5071様物質
M5093物質含有液の１ml当りの力価Ａは、
Ａ＝ａ×10（Unit／ml）
で求められる（ａはその最高希釈度を示す）。
上述の(1)〜(9)にて示す本発明のM5071様物質
M5093物質の理化学的性質より、グルコシルトラ
ンスフエラーゼによる不溶性グルカンの合成を阻
害する作用を有する酸性蛋白質系の物質と認めら
れ、先に見い出したM5071物質と類似するものと
認められる。また本発明のM5071様物質M5093物
質は、分子量、等電点などから、明らかに先の
M5071物質およびM5071様物質（M50841物質、
5084物質、4400物質）と異なる物質と認められ
る。
また本発明において見い出されたM5071様物質
M5093物質生産菌たるM5093株はグノモニエラ属
に属すると同定したもので、本菌をグノモニエ
ラ・エス・ピー・M5093（Gnomoniella sp・
M5093）と命名した（工業技術研究所、微生物受
託番号通知書受託番号「微工研菌寄第5799号
FERM―ＰNo.5799」）。
本菌M5093株の菌学的性状は、次の通りであ
る。
まずグノモニエラ・エス・ピー・M5093菌株に
ついて述べれば次の通りである。
(1) 各種培地における生育状態
麦芽エキス寒天培地
生育は非常に速く、26℃の場合１週間で内径85
mmのペトリ皿の全面に達する。菌叢は平担でやや
綿毛状。色はダーク・オリーブ・グレイ〔Dark
Olive Gray （near grays １ml）〕。集落周辺部
はほぼ滑らか。拡散性色素および浸出液は出さな
い。裏面はミツドナイト・ブルー（Mid−night
Blue（14Pn）〕。
バレイシヨ・ブドウ糖寒天培地
生育は普通で、26℃の場合１周間で30〜40mmに
達する。菌叢はやや厚く、表面も凹凸を有する。
色はダーク・オリーブ・グレイ（１ml）。周辺部
は極端なくもの単状（Arachnoid）。拡散性色素
および浸出液は出さない。裏面はダーク・ブルー
〔Dark Blue（13１／２Pn）〕。
ツアペツク寒天培地
生育はやや遅く、26℃の場合１週間で20〜28mm
に達する。菌叢は薄く平担。表面はビロード状。
色はダーク・オリーブ・グリーン〔Dark Olve
Green（24１／２pn）〕。周辺部は極端なくもの単
状。
拡散性色素および浸出液は出さない。裏面はダー
ク・オリーブ・グリーン（24１／２pn）。
(2) 顕微鏡的特色
子のう殻は寒天培地表面または内部に数個づつ
集まるかまたは単独で形成される。暗褐色ないし
黒色。子のう殻本体の直径は約200μ。子のう殻
本体とはつきり区別のつかない太く長い首を有す
る。その大きさは400〜900×70〜130μで基部ま
たは上部でときに二股に分れることもある。子の
うは子のう殻の壁より形成され、棍棒状で短い茎
を有する。40〜80×10〜13μ。子のう胞子は８個
で２列に形成される。頂部はメルツアー染色液
（Melger′s Reagent）で染色されない。子のう胞
子はやや不規則な紡錘形で、わずかに曲がる。１
細胞で無色ないし淡黄褐色、13〜20×５〜7μ。
壁は滑らか、ないしわずかにこぶ状の突起を有す
る。
(3) 生理的性状
生育し得るPH：３〜8.5
最適生育PH：４〜7.5
生育し得る温度：13〜38℃
最適生育温度：23〜28℃
上記の菌学的性状において、本菌は子のう胞子
が形成されることから子のう菌（Ascomycetes）
に属すると認められる。さらに長いしつかりした
首を持つ子のう殻が形成され、子のうは子のう殻
の壁から発生し、棍棒状であること、子のう胞子
は１細胞で、無色に近い色等の特色からグノモニ
エラ属に属するものと同定し、本菌をグノモニエ
ラ・エス・ピー・M5093と命名した。
なお本菌の同定に当つて、F.E.Clements.＆C.
L.Shear，1930、The Genera of Fungi，496pp.
Hafner Pub.Co.，USA，J.A.von Arx，1974，
The Genera of Fungi Sporulating in pure
Culture 315pp.Gramar，Germany，R.W.G.
Dennis，1968，British Ascomycetes，455pp.
Cramar，Germany，を引用した。
色の標示は、Color Harmony Manual
（Container Corporation of America1958）の
標示法に従つた。
次いで本発明のM5071様物質M5093物質を得る
に当つて、前記のM5071物質M5093物質生産菌で
あれば、天然または人工変異株などであつて使用
し得るものである。
また本発明を実施するに当つて例示すれば、グ
ノモニエラ属に属するM5071様物質M5093物質生
産菌好ましくは前記のグノモニエラ・エス・ピ
ー・M5093株を、抗生物質や酵素などを生産する
通常の方法で培養する。培養の形態としては、通
常液体培養で行なうのが有利である。
培地の栄養源としては、微生物の培養に通常用
いられているものが広く使用され得る。炭素源と
しては同化可能な炭素化合物であればよく、好ま
しくはシユクロースが用いられ、またグルコー
ス、ラクトース、マルトース、フラクトース、糖
蜜、デキストリンなどが用いられる。窒素源とし
ては利用可能な窒素化合物であればよく、例えば
ポリペプトリン、コーン・スチープ・リカー、肉
エキス、酵母エキス、大豆粉、カゼイン加水分解
物などが用いられる。その他、リン酸塩、炭酸
塩、硫酸塩、マグネシウム、カルシウム、カリウ
ム、ナトリウム、鉄、亜鉛、マンガンなどの塩類
が必要に応じて使用される。
培養温度は菌が発育し、本発明のM5071様物質
M5093物質を生産する範囲内で適宜変更し得る
が、通常26〜30℃程度、好ましくは26℃程度であ
り、また培養時間は条件によつて多少異なるが、
M5071様物質M5093物質が最高収量に達する時期
を見計つて適当な時期に培養を終了すればよく、
通常２〜４日程度である。
次いで、このようにして得られた培養物から
M5071様物質M5093物質を採取するのであるが、
まず得られた培養物を過または遠心分離などの
手段により、固形物を除去してその培養液を回
収する。得られた培養液よりM5071様物質
M5093物質を単離するに当つては、M5071様物質
M5093物質の溶媒に対する溶解性や塩析手段に基
いて行なうことが好ましく、例えば培養液に硫
酸アンモニウムを加えて塩析せしめ、それによつ
て生じた沈澱物を遠心分離などの手段にて回収す
ればよい。さらにこの沈澱物を、安定PH域を有す
る緩衝液に溶解後透析膜にて透析し、DEAE―セ
ルロース、DEAE―セフアデツクス、セフアデツ
クスなどの吸着クロマトグラフイーやゲル過手
段を用いて精製し、さらに等電点電気泳動法によ
り活性区分を回収し、単一成分まで精製された
M5071様物質M5093物質の精製物の区分を得、こ
れを凍結乾燥すればよい。
このようにして得られたM5071様物質M5093物
質は少なくともグルコシルトランスフエラーゼに
よる不溶性グルカンの合成の阻害作用を有してい
るもので、特に虫歯原因菌の一種である口腔内細
菌ストレプトコツカス・ミユータンスによるシユ
クロースの存在下で、歯表面等への粘着性物質た
る不溶性グルカンの生成を防止してなるもので、
そのため、不溶性グルカンの粘着性による種々の
虫歯原因菌の歯表面の付着を防止してなるもの
で、その結果、虫歯を予防してなる有用なもので
ある。
次に本発明の実施例を挙げて具体的に説明する
が、本発明は何んらこれによつて限定されるもの
ではない。
実施例 １
グルコース１％、プロトフラワー１％、ペプト
ン１％、コーン・スチープ・リカー１％、
KH2PO40.1％、MgSO4・7H2O0.1％、セライト
１％からなる培地100ml（PH6.5）を有する500ml
容三角フラスコ（120℃、20分間滅菌処理、各５
本）に、グノモニエラ・エス・ピー・M5093株を
接種し、26℃で４日間振盪培養した。次いでこの
種培養物各５mlを、シユクロース1.5％、デキス
トリン1.5％、ポリペプトン２％、コーン・スチ
ープ・リカー２％、KH2PO40.2％、MgSO4・
7H2O0.1％、FeSO4・7H2O0.01％、セライト１％
からなる培地100ml（PH6.5）を有する500ml容三
角フラスコ（120℃、20分間滅菌処理、各100本）
に移植し、26℃、３日間振盪培養した。培養後、
セライトを用いてこの培養物を過し、少量の水
で洗浄して、約10の培養液（蛋白量1611ｇ、
比活性0.19）を得た。得られた培養液に硫安
5.2Kgを加えて撹拌後、永室（４℃）に一晩放置
した。次いで生じた沈澱物を遠心分離して回収
し、これを0.01Mリン酸緩衝液（PH6.3）約500ml
に溶解した後、セロフアンチユーブを透析膜とし
て0.01Mリン酸緩衝液（PH6.3）に対して透析し
た。12時間おきに透析外液を替え、120の透析
液で72時間透析した。透析後さらに、あらかじめ
0.01Mリン酸緩衝液（PH6.3）で平衡化したDEAE
―セルロース（生化学工業社製）のカラム（径５
×40cm）にチヤージして吸着せしめ、0.01Mリン
酸緩衝液（PH6.3）で洗浄した後、0.01Mリン酸
緩衝液（PH6.3）２〜0.5MNaC含有0.01Mリ
ン酸緩衝液（PH6.3）２を用いて濃度勾配法で
溶出せしめ0.2MNaC含有0.01Mリン酸緩衝液
（PH6.3）近辺の溶出区分415ml（蛋白量1.81ｇ、
比活性91）を得、さらにメンブランPM―10（ア
ミコン社製）で濃縮した。さらに、この濃縮液
を、セロフアンチユーブを透析膜として0.01Mリ
ン酸緩衝液に対して透析せしめ、12時間おきに透
析外液を替え、80の透析液で48時間透析した液
は、あらかじめ0.01Mリン酸緩衝液（PH6.3）で
平衡化したDEAE―セフアデツクスＡ―25（生化
学工業社製）のカラム（径３×27cm）にチヤージ
して吸着せしめて、0.01Mリン酸緩衝液（PH6.3）
で洗浄した後、0.01Mリン酸緩衝液（PH6.3）２
〜0.3MNaCl含有0.01Mリン酸緩衝液（PH6.3）
２を用いて濃度勾配法で溶出して、0.1MNaCl
含有0.01Mリン酸緩衝液（PH6.3）近辺にて溶出
されるM5071様物質M5093物質含有活性区分208
ml（蛋白量93mg、比活性192を得、凍結乾燥した。
さらにこのM5071様物質M5093物質含有乾燥物を
少量の水に溶解させ、0.01Mリン酸緩衝液（PH
6.3）で平衡化したセフアデツクスＧ―100（生化
学工業社製）のカラム（径2.5×60cm）にチヤー
ジし、0.01Mリン酸緩衝液（PH6.3）にて１フラ
ンクシヨンNo.69〜80を回収し、併合し（蛋白量25
mg、比活性1330）、凍結乾燥した。次いでこの凍
結乾燥物を少量の水に溶解させ、あらかじめ水で
平衡化したセフアデツクスＧ―25コース（生化学
工業社製）で脱塩し、凍結乾燥して23mgを得た。
さらに、これを、少量の0.01Mリン酸緩衝液（PH
6.3）に溶解した後、グリセリン中でPH2.4〜４の
キヤリアーアンホライト（LKB社製）を用いて
なる等電点電気泳動（700V、24時間）を行ない、
泳動後、２mlずつ分画して、その活性区分を回収
し、さらに、あらかじめ水で平衡化したセフアデ
ツクスＧ―50フアイン（生化学工業社製）のカラ
ム（径2.4×40cm）にチヤージし、水で１フラク
シヨン4.8mlずつ溶出し、その活性フラクシヨン
No.21〜25を回収し、これを凍結乾燥して精製され
たM5071様物質M5093物質の白色粉末20mgを得た
（本品は、培養液のものに比べ比活性で約8200
倍上昇し、SDS―ポリアクリルアミド電気泳動
（PH９）にて単一バンドを示すものであつた）。[Table] Furthermore, the potency of the M5071-like substance M5093 of the present invention is measured by observing the degree of inhibition of insoluble glucan synthesis using glucosyltransferase in the presence of sucrose. , as follows. Streptococcus miutans OMZ176
Streptococcus miutans was cultured for 2 days in BHI medium, and after sterilization, the culture solution was precipitated with ammonium sulfate, and the precipitate was collected, dissolved in water, dialyzed, and concentrated to about 50 times the culture solution. 0.1 ml of a solution containing glucosyltransferase that catalyzes insoluble glucan synthesis, 0.1 ml of a solution containing each M5071-like substance of the present invention
ml, 0.5M phosphate buffer 0.1ml, 1M sucrose
Incubate 0.1 ml of the reaction mixture at 37°C. On the other hand, as a control, the M5071-like substance of the present invention
Use water instead of liquid containing M5093 substance. In addition, the solution containing the M5071-like substance M5093 of the present invention is diluted in several stages in advance, and after 2 hours, it is confirmed that insoluble glucan has been synthesized in the case of a control. Activity of each diluted M5071-like substance
Observe the state of the solution containing the M5093 substance, and determine its potency as the highest dilution at which the synthesis of insoluble glucan is inhibited (for example, it shows an inhibitory effect at 100-fold dilution,
If no inhibitory effect is shown at 120-fold dilution, the titer is set as 100). The desired M5071-like substance of the present invention
The potency A per ml of the M5093 substance-containing solution is determined as follows: A = a x 10 (Unit/ml) (a indicates its highest dilution). M5071-like substances of the present invention shown in (1) to (9) above
Based on the physical and chemical properties of substance M5093, it is recognized as an acidic protein-based substance that has the effect of inhibiting the synthesis of insoluble glucan by glucosyltransferase, and is recognized to be similar to the substance M5071 discovered earlier. Furthermore, the M5071-like substance M5093 substance of the present invention is clearly superior to the previous one due to its molecular weight, isoelectric point, etc.
M5071 substances and M5071-like substances (M50841 substances,
5084 substances, 4400 substances) are recognized as different substances. Also, the M5071-like substance discovered in the present invention
The strain M5093, which produces the M5093 substance, was identified as belonging to the genus Gnomoniella.
M5093）
FERM-P No. 5799”). The mycological properties of this strain M5093 are as follows. First, the Gnomoniella sp. M5093 strain will be described as follows. (1) Growth status on various media Malt extract agar medium Growth is very fast, reaching an inner diameter of 85 mm in one week at 26°C.
Reach the entire surface of the mm Petri dish. The bacterial flora is flat and slightly fluffy. The color is dark olive gray [Dark
Olive Gray (near grays 1ml)]. The area around the village is almost smooth. Does not release diffusible dyes or exudates. The back side is Mid-night blue.
Blue (14Pn)]. Potato Glucose Agar Medium Growth is normal, reaching 30-40 mm in one round at 26°C. The bacterial flora is somewhat thick and the surface is uneven.
The color is dark olive gray (1ml). The periphery is extremely Arachnoid. Does not release diffusible dyes or exudates. The back side is dark blue [Dark Blue (131/2Pn)]. Tuapetsk agar medium Growth is rather slow, 20-28mm in one week at 26℃
reach. The bacterial flora is thin and flat. The surface is velvety.
The color is dark olive green.
Green (241/2pn)]. The periphery is extremely spidery. Does not release diffusible dyes or exudates. The back side is dark olive green (241/2pn). (2) Microscopic characteristics The asci are formed singly or in clusters on the surface or inside the agar medium. Dark brown or black. The diameter of the ascus body is approximately 200μ. It has a thick and long neck that is indistinguishable from the ascus body. Its size is 400-900 x 70-130μ, and it sometimes bifurcates at the base or top. The ascus is formed from the wall of the asci and has a club-shaped short stalk. 40~80×10~13μ. The ascospores are eight in number and formed in two rows. The top is not stained with Melger's Reagent. The ascospores are somewhat irregular spindle-shaped and slightly curved. 1
Cells are colorless to pale yellowish brown, 13-20 x 5-7μ.
The walls are smooth or slightly knobby. (3) Physiological properties PH for growth: 3-8.5 Optimal growth PH: 4-7.5 Temperature for growth: 13-38°C Optimal growth temperature: 23-28°C In the above mycological properties, this fungus has Ascomycetes due to the formation of cysts
It is recognized that it belongs to. Furthermore, an ascospore with a long, stiff neck is formed, and the ascospore develops from the wall of the ascus and is club-shaped, and the ascospore is a single cell with a color that is almost colorless. Based on its characteristics, it was identified as belonging to the genus Gnomoniella, and the fungus was named Gnomoniella sp. M5093. For the identification of this bacterium, FEClements.&C.
L. Shear, 1930, The Genera of Fungi, 496pp.
Hafner Pub.Co., USA, JAvon Arx, 1974,
The Genera of Fungi Sporulating in pure
Culture 315pp. Grammar, Germany, RWG
Dennis, 1968, British Ascomycetes, 455pp.
Cited Cramar, Germany. Color markings are based on the Color Harmony Manual
(Container Corporation of America 1958) marking law was followed. Next, in obtaining the M5071-like substance M5093 substance of the present invention, any strain that produces the above-mentioned M5071 substance or M5093 substance, such as a natural or artificial mutant strain, can be used. Further, in carrying out the present invention, for example, the M5071-like substance M5093 substance-producing strain belonging to the genus Gnomoniera, preferably the Gnomoniera sp. Cultivate. As for the form of culture, it is usually advantageous to use liquid culture. As the nutrient source for the medium, a wide variety of nutrients commonly used for culturing microorganisms can be used. The carbon source may be any assimilable carbon compound, preferably sucrose, glucose, lactose, maltose, fructose, molasses, dextrin, etc. The nitrogen source may be any available nitrogen compound, such as polypeptrin, corn steep liquor, meat extract, yeast extract, soy flour, casein hydrolyzate, and the like. In addition, salts such as phosphates, carbonates, sulfates, magnesium, calcium, potassium, sodium, iron, zinc, and manganese are used as necessary. The culture temperature is such that the bacteria grow and the M5071-like substance of the present invention
Although it can be changed as appropriate within the range of producing the M5093 substance, it is usually about 26 to 30°C, preferably about 26°C, and the culture time varies depending on the conditions, but
All you have to do is find the time when the M5071-like substance M5093 substance reaches its maximum yield and terminate the culture at an appropriate time.
It usually takes about 2 to 4 days. Then, from the culture thus obtained
M5071-like substance M5093 substance is collected,
First, solid matter is removed from the obtained culture by means such as filtration or centrifugation, and the culture solution is recovered. M5071-like substance was detected from the obtained culture solution.
When isolating M5093 substance, M5071-like substance
It is preferable to conduct this based on the solubility of the M5093 substance in the solvent and the method of salting out. For example, ammonium sulfate may be added to the culture solution to cause salting out, and the resulting precipitate may be collected by means such as centrifugation. . Furthermore, this precipitate is dissolved in a buffer having a stable pH range, dialyzed using a dialysis membrane, purified using adsorption chromatography or gel filtration means such as DEAE-cellulose, DEAE-Sephadex, Sephadex, etc. The active fraction was collected by electrofocusing and purified to a single component.
A purified product of the M5071-like substance M5093 substance may be obtained and freeze-dried. The M5071-like substance M5093 thus obtained has at least an inhibitory effect on the synthesis of insoluble glucan by glucosyltransferase, and is particularly effective against the oral bacterium Streptococcus miutans, which is a type of cavity-causing bacterium. In the presence of sucrose, the formation of insoluble glucan, which is a sticky substance on the tooth surface, is prevented.
Therefore, the adhesiveness of insoluble glucan prevents various caries-causing bacteria from adhering to the tooth surface, and as a result, it is useful in preventing tooth caries. Next, the present invention will be specifically explained with reference to Examples, but the present invention is not limited thereto in any way. Example 1 Glucose 1%, Protoflour 1%, Peptone 1%, Corn Steep Liquor 1%,
500 ml with 100 ml of medium (PH6.5) consisting of KH 2 PO 4 0.1%, MgSO 4.7H 2 O 0.1%, Celite 1%
Erlenmeyer flasks (sterilized at 120℃ for 20 minutes, 5 each)
Gnomoniera sp. strain M5093 was inoculated into this strain, and cultured with shaking at 26°C for 4 days. 5 ml each of this seed culture was then mixed with 1.5% sucrose, 1.5% dextrin, 2% polypeptone, 2% corn steep liquor, 0.2% KH 2 PO 4 , MgSO 4 .
7H 2 O 0.1%, FeSO 4・7H 2 O 0.01%, Celite 1%
500ml Erlenmeyer flasks containing 100ml of medium (PH6.5) (sterilized at 120°C for 20 minutes, 100 flasks each)
and cultured with shaking at 26°C for 3 days. After culturing,
The culture was filtered through Celite, washed with a small amount of water, and diluted with approximately 10 culture solutions (protein content: 1611 g,
A specific activity of 0.19) was obtained. Add ammonium sulfate to the obtained culture solution.
After adding 5.2 kg and stirring, the mixture was left in a permanent room (4°C) overnight. Next, the resulting precipitate is collected by centrifugation, and added to approximately 500 ml of 0.01M phosphate buffer (PH6.3).
After dissolving in 0.01M phosphate buffer (PH6.3) using cellophane tube as a dialysis membrane. Dialysis was performed for 72 hours with 120 dialysis fluid, changing the external dialysis fluid every 12 hours. After dialysis and in advance
DEAE equilibrated with 0.01M phosphate buffer (PH6.3)
- Cellulose (Seikagaku Corporation) column (diameter 5
x 40cm), and washed with 0.01M phosphate buffer (PH6.3). .3) Elute using concentration gradient method using 415 ml of elution section near 0.01 M phosphate buffer (PH6.3) containing 0.2 M NaC (protein amount 1.81 g,
A specific activity of 91) was obtained, which was further concentrated using membrane PM-10 (manufactured by Amicon). Furthermore, this concentrated solution was dialyzed against 0.01M phosphate buffer using cellophane tube as a dialysis membrane, and the external dialysis solution was changed every 12 hours. Charge and adsorb onto a column (diameter 3 x 27 cm) of DEAE A-25 (manufactured by Seikagaku Corporation) equilibrated with M phosphate buffer (PH6.3). PH6.3)
After washing with 0.01M phosphate buffer (PH6.3) 2
0.01M phosphate buffer containing ~0.3M NaCl (PH6.3)
Elute with concentration gradient method using 0.1M NaCl
M5071-like substance eluted near 0.01M phosphate buffer (PH6.3) Containing M5093 substance Activity category 208
ml (protein amount 93 mg, specific activity 192 was obtained and freeze-dried.
Furthermore, this dried product containing M5071-like substance M5093 substance was dissolved in a small amount of water, and 0.01M phosphate buffer (PH
Charge a column (diameter 2.5 x 60 cm) of Sephadex G-100 (manufactured by Seikagaku Corporation) equilibrated with 6.3), and add 1 flank No. 69 to 80 with 0.01 M phosphate buffer (PH 6.3). was collected and merged (protein amount 25
mg, specific activity 1330), lyophilized. Next, this freeze-dried product was dissolved in a small amount of water, desalted using a Sephadex G-25 course (manufactured by Seikagaku Corporation) equilibrated with water, and freeze-dried to obtain 23 mg.
Furthermore, add a small amount of 0.01M phosphate buffer (PH
6.3), conduct isoelectric focusing (700V, 24 hours) using carrier amphorite (manufactured by LKB) with a pH of 2.4 to 4 in glycerin,
After electrophoresis, fractionate 2 ml each and collect the active fraction, charge it to a column (diameter 2.4 x 40 cm) of Sephadex G-50 Fine (manufactured by Seikagaku Corporation) that has been equilibrated with water, and Elute each fraction (4.8 ml) with
Nos. 21 to 25 were collected and lyophilized to obtain 20 mg of purified white powder of M5071-like substance M5093 (this product has a specific activity of about 8200 compared to that of the culture solution).
), and a single band was observed in SDS-polyacrylamide electrophoresis (PH9).
【図面の簡単な説明】[Brief explanation of the drawing]
第１図は本発明のM5071様物質M5093物質のPH
安定性曲線、第２図はM5071物質のPH安定性曲
線、第３図はM5071様物質M5093物質の熱安定性
曲線、第４図はM5071物質の熱安定性曲線を示
す。
Figure 1 shows the pH of the M5071-like substance M5093 of the present invention.
Stability curves: Figure 2 shows the PH stability curve of the M5071 substance, Figure 3 shows the thermal stability curve of the M5071-like substance M5093 substance, and Figure 4 shows the thermal stability curve of the M5071 substance.