JPS635075B2 - - Google Patents
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- JPS635075B2 JPS635075B2 JP59249322A JP24932284A JPS635075B2 JP S635075 B2 JPS635075 B2 JP S635075B2 JP 59249322 A JP59249322 A JP 59249322A JP 24932284 A JP24932284 A JP 24932284A JP S635075 B2 JPS635075 B2 JP S635075B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- enzyme
- aqueous solution
- gel particles
- gel
- polyvinyl alcohol
- Prior art date
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- Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】
産業上の利用分野
本発明は、酵素を固定したゲル粒子の製造方
法、さらに詳しくいえば光架橋性樹脂を用いて、
ゲル状態で酵素を包括させることにより、優れた
酵素活性をもつ酵素包括ゲル粒子を製造する方法
に関するものである。
法、さらに詳しくいえば光架橋性樹脂を用いて、
ゲル状態で酵素を包括させることにより、優れた
酵素活性をもつ酵素包括ゲル粒子を製造する方法
に関するものである。
従来の技術
これまで、酵素を固定したゲル粒子を製造する
方法としては、ポリビニルアルコール又はその誘
導体の水溶液に酵素を溶解させ、放射線を照射し
てポリビニルアルコール又はその誘導体を架橋さ
せると同時に酵素を固定する方法が知られている
（特公昭56−33号公報、特公昭59−13189号公報）。
方法としては、ポリビニルアルコール又はその誘
導体の水溶液に酵素を溶解させ、放射線を照射し
てポリビニルアルコール又はその誘導体を架橋さ
せると同時に酵素を固定する方法が知られている
（特公昭56−33号公報、特公昭59−13189号公報）。
またポリビニルアルコール系に限らず、水溶性
モノマーあるいはポリマーの単独または混合物の
水溶液一般に対して放射線を作用させる方法も知
られている（特開昭50−157587）。
モノマーあるいはポリマーの単独または混合物の
水溶液一般に対して放射線を作用させる方法も知
られている（特開昭50−157587）。
しかしながら、これらの方法は、放射線を用い
なければならないため、特殊な設備を必要とする
上に、酵素を変質するおそれがあり、実用化に際
して種々の問題がある。
なければならないため、特殊な設備を必要とする
上に、酵素を変質するおそれがあり、実用化に際
して種々の問題がある。
他方、感光性樹脂を用いて酵素を固定化する方
法もいつくか知られている（特開昭53−142594号
公報、特開昭55−15703号公報など）。
法もいつくか知られている（特開昭53−142594号
公報、特開昭55−15703号公報など）。
しかしながら、これらの方法によれば、フイル
ム状、粒子状、繊維状の樹脂中に酵素が固定され
るため、反応に関与する酵素はこれらの表面に露
出しているもののみに限られ、固定された酵素の
量に比較して利用される酵素の量が著しく少なく
なるのを免れない。これにはフイルムの厚さ、粒
子の径、繊維の大きさが影響し、それぞれ大きく
なるにしたがい酵素の効率は低下するが、酵素包
括ゲル粒子の製造方法として従来より知られてい
る方法は比較的大粒径の粒子を得る方法である
（特開昭50−157587）。
ム状、粒子状、繊維状の樹脂中に酵素が固定され
るため、反応に関与する酵素はこれらの表面に露
出しているもののみに限られ、固定された酵素の
量に比較して利用される酵素の量が著しく少なく
なるのを免れない。これにはフイルムの厚さ、粒
子の径、繊維の大きさが影響し、それぞれ大きく
なるにしたがい酵素の効率は低下するが、酵素包
括ゲル粒子の製造方法として従来より知られてい
る方法は比較的大粒径の粒子を得る方法である
（特開昭50−157587）。
発明が解決しようとする問題点
本発明の第１の目的は、酵素を、その作用をそ
こなうことなく、しかも効率よく機能を発揮でき
る状態で固定化する方法を提供することである。
本発明の第２の目的は、酵素反応に必要な水分を
含み、したがつて基質に対して円滑に反応しうる
酵素包括ゲル粒子を製造する方法を提供すること
である。
こなうことなく、しかも効率よく機能を発揮でき
る状態で固定化する方法を提供することである。
本発明の第２の目的は、酵素反応に必要な水分を
含み、したがつて基質に対して円滑に反応しうる
酵素包括ゲル粒子を製造する方法を提供すること
である。
問題点を解決するための手段
本発明者らは、上記の目的を達成するために鋭
意研究を重ねた結果、水溶性感光性樹脂の１種で
あるスチルバゾリウム基をもつポリビニルアルコ
ールを用い、これと酵素とを含有する水溶液を疎
水性媒質中に細かく分散させた状態で光架橋させ
て、比較的小粒径の粒状酵素包括ゲルを形成させ
ることによりその目的を達成しうることを見出
し、この知見に基づいて本発明をなすに至つた。
意研究を重ねた結果、水溶性感光性樹脂の１種で
あるスチルバゾリウム基をもつポリビニルアルコ
ールを用い、これと酵素とを含有する水溶液を疎
水性媒質中に細かく分散させた状態で光架橋させ
て、比較的小粒径の粒状酵素包括ゲルを形成させ
ることによりその目的を達成しうることを見出
し、この知見に基づいて本発明をなすに至つた。
すなわち本発明は、スチルバゾリウム基をもつ
ポリビニルアルコールの水溶液中に酵素を溶解
し、次いでこの水溶液を疎水性媒質中に加え細か
く分散させてエマルジヨンを形成させたのち活性
光を照射して光架橋させることを特徴とする、平
均粒径20〜100μｍの粒状酵素包括ゲルの製造方
法を提供するものである。
ポリビニルアルコールの水溶液中に酵素を溶解
し、次いでこの水溶液を疎水性媒質中に加え細か
く分散させてエマルジヨンを形成させたのち活性
光を照射して光架橋させることを特徴とする、平
均粒径20〜100μｍの粒状酵素包括ゲルの製造方
法を提供するものである。
本発明で用いるスチルバゾリウム基をもつポリ
ビニルアルコールは、公知であり、例えばポリビ
ニルアルコール又は部分けん化ポリ酢酸ビニル
と、一般式 （式中のＲは水素原子、アルキル基又は低級ヒド
ロキシアルキル基を示し、X-は強酸の陰イオン
を示す） で表わされるスチリルピリジニウム塩を反応させ
ることによつて得ることができる（特公昭56−
5761号公報参照）。
ビニルアルコールは、公知であり、例えばポリビ
ニルアルコール又は部分けん化ポリ酢酸ビニル
と、一般式 （式中のＲは水素原子、アルキル基又は低級ヒド
ロキシアルキル基を示し、X-は強酸の陰イオン
を示す） で表わされるスチリルピリジニウム塩を反応させ
ることによつて得ることができる（特公昭56−
5761号公報参照）。
この際のポリビニルアルコール又は部分けん化
ポリ酢酸ビニルとしては、重合度500〜3000の範
囲のものが適当であり、また部分けん化ポリ酢酸
ビニルを用いる場合には、けん化率70〜88％のも
のを用いるのが望ましい。重合度が500よりも少
ないと光架橋されも好適なゲルを生成しないし、
また重合度が3000よりも大きくなつたり、ポリ酢
酸ビニルのけん化度が70％よりも少ないと不溶化
樹脂となりゲルが得られない。同様にスチルバゾ
リウム基は、ビニルアルコール単位当り、0.5〜
８モル％の範囲で導入されたものが好ましい。
ポリ酢酸ビニルとしては、重合度500〜3000の範
囲のものが適当であり、また部分けん化ポリ酢酸
ビニルを用いる場合には、けん化率70〜88％のも
のを用いるのが望ましい。重合度が500よりも少
ないと光架橋されも好適なゲルを生成しないし、
また重合度が3000よりも大きくなつたり、ポリ酢
酸ビニルのけん化度が70％よりも少ないと不溶化
樹脂となりゲルが得られない。同様にスチルバゾ
リウム基は、ビニルアルコール単位当り、0.5〜
８モル％の範囲で導入されたものが好ましい。
次に、本発明方法における固定化には、放射線
照射、加熱、架橋剤の使用など酵素に悪影響を与
えるような条件を必要としないので、固定化され
る酵素は特に制限されない。例えば、アミラー
ゼ、プロテアーゼ、セルラーゼ、ヘミセルラー
ゼ、リパーゼ、ペクチナーゼ、リゾチーム、ナリ
ンジナーゼ、ヘスペリジナーゼ、アントシアナー
ゼ、アミノアシラーゼ、ウレアーゼ、インベルタ
ーゼ、メリビアーゼ、デキストラナーゼ、ペプチ
ダーゼ、リボヌクレアーゼ、ラクターゼのような
加水分解酵素、グルコースオキシダーゼ、ウリカ
ーゼ、カタラーゼ、リボキシゲナーゼ、チトクロ
ムＣ、ペルオキシダーゼのような酸化還元酵素、
グルコースイソメラーゼのような異性化酵素、シ
クロデキストリングルコーシルトランスフエラー
ゼ、トランスアミナーゼのような転移酵素、アス
パルターゼ、ヒアロウロンダーゼ、コンドロイチ
ナーゼ、ペクチンエリミナーゼのような脱離酵素
などを固定化することができる。
照射、加熱、架橋剤の使用など酵素に悪影響を与
えるような条件を必要としないので、固定化され
る酵素は特に制限されない。例えば、アミラー
ゼ、プロテアーゼ、セルラーゼ、ヘミセルラー
ゼ、リパーゼ、ペクチナーゼ、リゾチーム、ナリ
ンジナーゼ、ヘスペリジナーゼ、アントシアナー
ゼ、アミノアシラーゼ、ウレアーゼ、インベルタ
ーゼ、メリビアーゼ、デキストラナーゼ、ペプチ
ダーゼ、リボヌクレアーゼ、ラクターゼのような
加水分解酵素、グルコースオキシダーゼ、ウリカ
ーゼ、カタラーゼ、リボキシゲナーゼ、チトクロ
ムＣ、ペルオキシダーゼのような酸化還元酵素、
グルコースイソメラーゼのような異性化酵素、シ
クロデキストリングルコーシルトランスフエラー
ゼ、トランスアミナーゼのような転移酵素、アス
パルターゼ、ヒアロウロンダーゼ、コンドロイチ
ナーゼ、ペクチンエリミナーゼのような脱離酵素
などを固定化することができる。
また、本発明において水溶液を分散するのに用
いる疎水性媒質としては、水と混和しない不活性
溶媒が用いられる。このようなものの例として
は、シリコーンオイル、各種炭化水素油、液状パ
ラフインなどを挙げることができる。
いる疎水性媒質としては、水と混和しない不活性
溶媒が用いられる。このようなものの例として
は、シリコーンオイル、各種炭化水素油、液状パ
ラフインなどを挙げることができる。
本発明方法を好適に実施するには、スチルバゾ
リウム基をもつポリビニルアルコールを５〜20％
の濃度で水に溶かし、さらに所定の酵素を加え、
十分に混合する。次にこの水溶液を５〜20倍容の
疎水性媒質中に加え、透明容器中で激しくかきま
ぜることによつて細かく分散させＷ／Ｏ型エマル
ジヨンを形成させ、この状態を維持しながら、室
温で全体にわたつて活性光を照射する。この際の
活性光照射は、通常の感光材料の光硬化に使用さ
れている光源、例えば高圧水銀灯、キセノンラン
プ、メタルハライドランプ、アーク灯、けい光
灯、タングステンランプ、アルゴンイオンレー
ザ、ヘリウムカドミウムレーザなどを用いて行う
ことができる。この活性光の照射により、スチル
バゾリウム基をもつポリビニルアルコールは光架
橋し、ゲル粒子を形成する。この光架橋反応は、
使用する樹脂の種類、架橋化条件により若干異な
るが、通常数分間ないし数十分間で完了する。
リウム基をもつポリビニルアルコールを５〜20％
の濃度で水に溶かし、さらに所定の酵素を加え、
十分に混合する。次にこの水溶液を５〜20倍容の
疎水性媒質中に加え、透明容器中で激しくかきま
ぜることによつて細かく分散させＷ／Ｏ型エマル
ジヨンを形成させ、この状態を維持しながら、室
温で全体にわたつて活性光を照射する。この際の
活性光照射は、通常の感光材料の光硬化に使用さ
れている光源、例えば高圧水銀灯、キセノンラン
プ、メタルハライドランプ、アーク灯、けい光
灯、タングステンランプ、アルゴンイオンレー
ザ、ヘリウムカドミウムレーザなどを用いて行う
ことができる。この活性光の照射により、スチル
バゾリウム基をもつポリビニルアルコールは光架
橋し、ゲル粒子を形成する。この光架橋反応は、
使用する樹脂の種類、架橋化条件により若干異な
るが、通常数分間ないし数十分間で完了する。
光架橋反応が完了したならば、疎水性媒質を酵
素に対し不活性な溶剤例えばｎ−ヘキサンで洗浄
除去する。このようにして平均粒径20〜100μｍ、
含水率60〜85％の酵素包括ゲル粒子が得られる。
素に対し不活性な溶剤例えばｎ−ヘキサンで洗浄
除去する。このようにして平均粒径20〜100μｍ、
含水率60〜85％の酵素包括ゲル粒子が得られる。
このようにして得られる酵素包括ゲルは、従来
の固定化酵素と同様に、カラムに充てんし基質含
有溶液を流下させる方法、基質含有溶液に加えか
きまぜる方法などによつて種々の酵素反応に供す
ることができる。
の固定化酵素と同様に、カラムに充てんし基質含
有溶液を流下させる方法、基質含有溶液に加えか
きまぜる方法などによつて種々の酵素反応に供す
ることができる。
発明の効果
本発明方法によれば、長期間にわたつて安定し
た酵素活性を示し、かつ基質の拡散速度が大きく
て反応性が高い、しかも取り扱いの容易な酵素包
括ゲル粒子を簡単に得ることができるので、工業
的な酵素固定化方法として広く利用することがで
きる。
た酵素活性を示し、かつ基質の拡散速度が大きく
て反応性が高い、しかも取り扱いの容易な酵素包
括ゲル粒子を簡単に得ることができるので、工業
的な酵素固定化方法として広く利用することがで
きる。
実施例
次に実施例により本発明をさらに詳細に説明す
る。
る。
各例で用いた光架橋性樹脂は、式
で示されるスチルバゾリウム基をビニルアルコー
ル単位に基づき3.95モル％導入した平均重合度
500、けん化率88％の部分けん化ポリ酢酸ビニル
（以下PVA−SbQと略記する）であつた。
ル単位に基づき3.95モル％導入した平均重合度
500、けん化率88％の部分けん化ポリ酢酸ビニル
（以下PVA−SbQと略記する）であつた。
実施例 １
PVA−SbQを水に溶かし、濃度9.9％、PH6.3の
水溶液を調製する。この水溶液18mlを分取し、こ
れにリゾパスリパーゼ（生化学工業社製、
6000V／mg）10mgを蒸留水に溶かして加え、十分
にかきまぜることにより酵素含有PVA−SbQ水
溶液20mlを得た。
水溶液を調製する。この水溶液18mlを分取し、こ
れにリゾパスリパーゼ（生化学工業社製、
6000V／mg）10mgを蒸留水に溶かして加え、十分
にかきまぜることにより酵素含有PVA−SbQ水
溶液20mlを得た。
次に、300ml容量のガラス製ビーカーにシリコ
ーンオイル（信越化学工業社製、信越KF96、粘
度10cs／25℃）200mlを入れ、デイスク径30mmの
６枚羽根標準型タービンを用い、回転数1600rpm
でかきまぜながら、これに前記のようにして調製
した酸素含有PVA−SbQ水溶液を投入して懸濁
したのち、直射日光下で30分間かきまぜながら光
照射架橋を行つた。次いで生成したゲル粒子を遠
心ろ過器を用いてろ別したのち、付着したシリコ
ンオイルをｎ−ヘキサンを用いて洗浄、除去し、
酵素を包括固定化したゲル粒子を得た。
ーンオイル（信越化学工業社製、信越KF96、粘
度10cs／25℃）200mlを入れ、デイスク径30mmの
６枚羽根標準型タービンを用い、回転数1600rpm
でかきまぜながら、これに前記のようにして調製
した酸素含有PVA−SbQ水溶液を投入して懸濁
したのち、直射日光下で30分間かきまぜながら光
照射架橋を行つた。次いで生成したゲル粒子を遠
心ろ過器を用いてろ別したのち、付着したシリコ
ンオイルをｎ−ヘキサンを用いて洗浄、除去し、
酵素を包括固定化したゲル粒子を得た。
このようにして得られたゲル粒子は、粒径が20
〜100μｍの範囲のものであり、代表粒径は50μｍ
であつた。また含水率は82重量％であつた。
〜100μｍの範囲のものであり、代表粒径は50μｍ
であつた。また含水率は82重量％であつた。
次に、100mlの三角フラスコに、前記のように
して得られたリパーゼ1.4mgを含むPVA−SbQゲ
ル粒子1.34ｇとオリーブ油100mlとを入れ、マグ
ネチツクスターラを用いてかきまぜながら35℃で
加水分解反応を行い、水の消費速度から反応初速
度を求めた。その結果、反応初速度は500μM−
トリグリセライド／min・mg酵素であつた。
して得られたリパーゼ1.4mgを含むPVA−SbQゲ
ル粒子1.34ｇとオリーブ油100mlとを入れ、マグ
ネチツクスターラを用いてかきまぜながら35℃で
加水分解反応を行い、水の消費速度から反応初速
度を求めた。その結果、反応初速度は500μM−
トリグリセライド／min・mg酵素であつた。
実施例 ２
実施例１における酵素・リゾパスリパーゼの代
りにインベルターゼ（生化学工業社製、124V／
mg）120mgを用いる以外は、実施例１と全く同様
にして酵素を包括固定化したPVA−SbQゲル粒
子を得た。このものの粒径は実施例１のものとほ
とんど同じであり、またその含有率は79重量％で
あつた。
りにインベルターゼ（生化学工業社製、124V／
mg）120mgを用いる以外は、実施例１と全く同様
にして酵素を包括固定化したPVA−SbQゲル粒
子を得た。このものの粒径は実施例１のものとほ
とんど同じであり、またその含有率は79重量％で
あつた。
次に、100mlの三角フラスコに、このようにし
て得られたインベルターゼ10.5mgを含むPVA−
SbQゲル粒子1.00ｇとシヨ糖0.5M（100ml）とを入
れ、塩酸でPH4.5に調整しマグネチツクスターラ
を用いてかきまぜながら加水分解反応を行い、そ
の反応初速度を求めた。その結果、反応初速度は
37.3μM−シヨ糖／min・mg酵素であつた。
て得られたインベルターゼ10.5mgを含むPVA−
SbQゲル粒子1.00ｇとシヨ糖0.5M（100ml）とを入
れ、塩酸でPH4.5に調整しマグネチツクスターラ
を用いてかきまぜながら加水分解反応を行い、そ
の反応初速度を求めた。その結果、反応初速度は
37.3μM−シヨ糖／min・mg酵素であつた。
実施例 ３
実施例１における酵素・リゾパスリパーゼを用
いる代りにβ−ガラクトシダーゼ（シグマ社製、
0.11V／mg）448mgを用いる以外は、実施例１と
全く同様にして酵素を包括固定化したPVA−
SbQゲル粒子を得た。このものの粒径は実施例１
のものとほとんど同じであり、またその含水率は
88重量％であつた。
いる代りにβ−ガラクトシダーゼ（シグマ社製、
0.11V／mg）448mgを用いる以外は、実施例１と
全く同様にして酵素を包括固定化したPVA−
SbQゲル粒子を得た。このものの粒径は実施例１
のものとほとんど同じであり、またその含水率は
88重量％であつた。
次に、100mlの三角フラスコに、このようにし
て得られたβ−ガラクトシダーゼ13.0mgを含む
PVA−SbQゲル粒子1.00ｇとＯ−ニトロフエニ
ル−β−Ｄ−ガラクトペラノシド33ｍＭ（100ml）
とを入れ、リン酸緩衝液でPH7.5に調整し、マグ
ネチツクスターラを用いてかきまぜながら加水分
解反応を行い、その反応初速度を求めた。その結
果、反応初速度は６×10-3μM−Ｏ−ニトロフエ
ニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド／min・mg酵
素であつた。
て得られたβ−ガラクトシダーゼ13.0mgを含む
PVA−SbQゲル粒子1.00ｇとＯ−ニトロフエニ
ル−β−Ｄ−ガラクトペラノシド33ｍＭ（100ml）
とを入れ、リン酸緩衝液でPH7.5に調整し、マグ
ネチツクスターラを用いてかきまぜながら加水分
解反応を行い、その反応初速度を求めた。その結
果、反応初速度は６×10-3μM−Ｏ−ニトロフエ
ニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド／min・mg酵
素であつた。
Claims (1)
- １ スチルバゾリウム基をもつポリビニルアルコ
ールの水溶液中に酵素を溶解し、次いでこの水溶
液を疎水性媒質中に加え細かく分散させてエマル
ジヨンを形成させたのち活性光を照射して光架橋
させることを特徴とする、平均粒径20〜100μｍ
の粒状酵素包括ゲルの製造方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP24932284A JPS61128888A (ja) | 1984-11-26 | 1984-11-26 | 酵素包括ゲル粒子の製造方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP24932284A JPS61128888A (ja) | 1984-11-26 | 1984-11-26 | 酵素包括ゲル粒子の製造方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS61128888A JPS61128888A (ja) | 1986-06-16 |
| JPS635075B2 true JPS635075B2 (ja) | 1988-02-02 |
Family
ID=17191274
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP24932284A Granted JPS61128888A (ja) | 1984-11-26 | 1984-11-26 | 酵素包括ゲル粒子の製造方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS61128888A (ja) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS6317691A (ja) * | 1986-07-09 | 1988-01-25 | Agency Of Ind Science & Technol | アスパルテ−ム製造用固定化酵素 |
| JP2562624B2 (ja) * | 1986-11-07 | 1996-12-11 | 昭和電工株式会社 | 水溶性マイクロカプセルおよび液体洗剤組成物 |
| JPH069511B2 (ja) * | 1988-03-31 | 1994-02-09 | 工業技術院長 | 酵素包括ゲル粒子の製造方法 |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5312994B2 (ja) * | 1974-06-15 | 1978-05-06 | ||
| JPS54107590A (en) * | 1978-02-13 | 1979-08-23 | Agency Of Ind Science & Technol | Photo-chemical immobilization of enzyme |
-
1984
- 1984-11-26 JP JP24932284A patent/JPS61128888A/ja active Granted
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS61128888A (ja) | 1986-06-16 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| EXPY | Cancellation because of completion of term |