JPS635133B2 - - Google Patents

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Publication number: JPS635133B2
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Prior art date: 1978-01-24
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Ansonii Atokinson

Maikeru Jon Haauei

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PABURITSUKU HERUSU RABORATARII SAAUISU BOODO

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PABURITSUKU HERUSU RABORATARII SAAUISU BOODO

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1978-01-24

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1979-01-22

Publication date

1988-02-02

1979-01-22 Application filed by PABURITSUKU HERUSU RABORATARII SAAUISU BOODO filed Critical PABURITSUKU HERUSU RABORATARII SAAUISU BOODO

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1988-02-02 Publication of JPS635133B2 publication Critical patent/JPS635133B2/ja

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Description

請求の範囲１ PHが少なくとも８の水性媒質中で、クロロ―
トリアジニル基またはこれに関連する基を含有す
る蛋白結合性リガンド物質のクロライド基を、遊
離のヒドロキシ基またはアミノ基を含有する非セ
ルロース系マトリツクスの前記遊離のヒドロキシ
基またはアミノ基と反応させることにより、前記
リガンド物質を前記マトリツクスに結合させて蛋
白結合性固体媒体を製造する方法であつて、水性
媒質中にアルカリ金属水酸化物を存在させること
によつて所要のPHを得ることを特徴とする方法。２リガンドが次の構造［式中、R¹はアントラキノン、置換アントラキ
ノン、芳香族アゾ化合物またはフタロシアニン化
合物から誘導されたスルホン化残基を示し、R²
は(a)有機残基または(b)塩素原子のいずれかを示
す］を有する請求の範囲１の方法。３ R¹が次の構造［式中、R³、R⁴、R⁵は各々スルホニル基または
水素原子を示す］または上記構造のアルキルもし
くはアミノ置換誘導体構造を有する請求の範囲２
の方法。４ R¹が次の構造［式中、R⁶、R⁷、R⁸はスルホニル基または水素
原子を示し、トリアジニル環に結合する点は〓印
で示した点のいずれでもよい］または上記構造の
置換誘導体構造を有する請求の範囲２の方法。５ R²がスルホン化されたフエニル基である請
求の範囲２から４のいずれかの方法。６リガンドがモノクロロ―トリアジニル基を含
有し、前記リガンド物質とマトリツクスの結合反
応を少なくとも9.5のPHで行なう請求の範囲１か
ら５のいずれかの方法。７前記結合反応を室温で40〜60時間かけて行な
う請求の範囲６の方法。８前記結合反応を40〜60℃の温度で行なう請求
の範囲６の方法。９リガンドがジクロロ―トリアジニル基を含有
し、前記リガンド物質とマトリツクスの結合反応
を８〜12.5のPHで行なう請求の範囲１から５のい
ずれかの方法。１０水性媒質が塩化ナトリウムを含有する請求
の範囲１から９のいずれかの方法。１１塩化ナトリウムの濃度が0.25〜0.5M（モル
濃度）である請求の範囲１０の方法。１２マトリツクスがアガロース、デキストロー
ス、デキストランまたはアクリルアミドのポリマ
ーまたはコポリマーである請求の範囲１から１１
のいずれかの方法。１３ PHが少なくとも８の水性媒質中で、クロロ
―トリアジニル基またはこれに関連する基を含有
する蛋白結合性リガンド物質のクロライド基を、
遊離のヒドロキシ基またはアミノ基を含有する非
セルロース系マトリツクスの前記遊離のヒドロキ
シ基またはアミノ基と反応させることにより、前
記リガンド物質を前記マトリツクスに結合させる
ステツプを含んでおり、水性媒質中にアルカリ金
属水酸化物を存在させることによつて所要のPHを
得ることを特徴とする方法によつて製造された蛋
白結合性固体媒体。１４ヒドロキシ基またはアミノ基を含有するマ
トリツクスに直接結合したトリアジニル基を含有
する蛋白結合性リガンドからなつており、乾燥マ
トリツクス１ｇ当たり少なくとも7.5mgのリガン
ドを含有しており、かつ次の構造［式中、Ｘは―Ｏ―または―NH―を示し、R¹は
アントラキノン、置換アントラキノン、芳香族ア
ゾ化合物またはフタロシアニン化合物から誘導さ
れたスルホン化残基を示し、R²は(a)有機残基ま
たは(b)塩素原子のいずれかを示す］を有すること
を特徴とする請求の範囲１３の蛋白結合性固体媒
体。１５乾燥マトリツクス１ｇ当たり少なくとも15
mgのリガンドを含有する請求の範囲１４の蛋白結
合性固体媒体。明細書本発明はアフイニテイークロマトグラフイー用
の蛋白結合性媒体（担体）に関し、特に高い特異
的蛋白結合能を有する固体媒体に関する。アフイニテイークロマトグラフイーでは、通常
カラムの形態の固体媒体で選択的吸着及び／又は
溶離（溶出）を行なつて蛋白質を分離する。一般に固体媒体は、一定条件下で所要の蛋白質
（一種又は複数種）を同一のサンプル中に存在す
る他の蛋白質よりも優先的に結合する能力をもつ
リガンド（配位子）が結びついた不活性担体マト
リツクスであり、ある場合にはマトリツクス自体
が前記の選択的結合能力を持ちうる。リガンド
は、抗原と抗体のように分離されるべき蛋白質に
対して生物学的に相補的であつてもよく、もしく
は、活性基の種類及び立体関係によつて蛋白質に
結合することができる生物学的には関連のないど
んな分子でもよい。たとえば米国特許第4016149号やBairdらによ
る“Febs Letters”、70巻（1976）61頁には、リ
ガンドがモノ―クロロ―トリアジニル染料であ
り、クロライド基（塩素原子）のところでの置換
によつてデキストランもしくはアガロースマトリ
ツクスに結合されている固体媒体が記載されてい
る。このような結合を得るにはアルカリ性の炭酸
ソーダもしくは重炭酸ソーダ緩衝媒質中で処理す
るが、これらの染料はセルロースの染色を目的と
したものであるので非セルロース系マトリツクス
上に結合した染料の濃度は一般に極めて低く、そ
の結果蛋白結合能は低い。アガロースマトリツク
スの臭化シアン活性化によつて染料結合を増加す
ることが可能である。しかし、臭化シアン活性化
は特に工業的使用に関して重大な不利を呈する。
すなわち、物質の毒性が高く、従つて危険である
ので工業的規模では使用できない。又、臭化シア
ン活性化によつてマトリツクスとの間に炭酸アミ
ド結合とカルバミン酸アミド結合が生成するが、
これらは不安定で長期間の使用中にカラム活性を
徐々に低下させる。さらに臭化シアン活性化によ
つて、染料上のヒドロキシ基及びアミン基が活性
化され、その結果染料―染料結合及びトリアジン
基を介しない染料―マトリツクス結合が生じ、し
たがつて、蛋白質を結合するのに有効に利用でき
るのは結合した染料分子の極く一部のみとなり、
その蛋白結合特性はまちまちである。加えて、結
合した染料の含量が非常に高いカラムでは蛋白質
が非常に固く結合する結果、溶離の行なわれない
場合が時々ある。さらに又、臭化シアン活性化
は、ジクロロ―トリアジニル染料の固定化には用
いることができない。別の類の固体媒体はモノクロロ―トリアジニル
染料をデキストランに結合し、次いでアガロース
支持体に結合することによつて製造される。この
場合、トリアジン環上の塩素置換基は―Ｏ―デキ
ストラン結合によつて置き換えられ、支持体への
結合はもつぱら、臭化シアン活性化の後染料上の
他の反応性残基特にアミン基を介して行なわれ
る。従つて、結合特異性も、結合がトリアジン環
を介して行なわれる媒体とは異なつており、しか
もこの媒体は臭化シアン活性化に関して上に述べ
たすべての不利を蒙る。従つて臭化シアンを使用せずに有用で適度に調
節されたレベルの染料結合を達成する方法が求め
られている。本発明は蛋白結合性固体媒体を製造する方法を
提供する。本発明の方法は、PHが少なくとも８の
アルカリ金属水酸化物の存在下で、クロロ―トリ
アジニル基またはこれに関連する（類似した）基
を含む蛋白結合性リガンド物質を、遊離のヒドロ
キシ基またはアミノ基を含む非セルロース系マト
リツクスの水性懸濁液と反応させ、次いで、得ら
れた固体媒体を洗浄して未反応染料を除去するこ
とからなる。ここで使われる用語“関連する（類似した）
基”とは、染料技術で重要性が認められている
基、例えばクロロ―ピリミジニルアミノもしくは
カルボニルアミノ基、

【式】もしくは

【式】又は、次式のごときカルボニルアミノ基含有残
基を示す。

【式】

【式】驚くべきことに、この反応に於いてアルカリ金
属水酸化物を使用すると、蛋白結合性リガンドと
マトリツクスの結合割合は、温度、時間及びアル
カリ濃度の同一条件下で炭酸ナトリウムやその他
の塩基を用いて得られるよりも極めて高いことが
わかつた。更に本発明は類似の条件下で従来技術
の媒体よりも厳密な溶離性（プロフイール）を示
す媒体の製造が可能である。蛋白結合性リガンドはモノもしくはジクロロ―
トリアジニル基または類似の基を含むものであれ
ばいずれの蛋白結合性リガンドでもよいが、
“Cibacron”及び“Procion”という商標で販売
されているような所謂“トリアジニル染料”が好
ましい。これらは普通、スルホン化されたアントラキノ
ン類、フタロシアニン類（thalocyanines）もし
くはポリ芳香族アゾ化合物のトリアジニル誘導体
である。これらの化合物は次の構造を有する。式中、R¹はアントラキノン、置換されたアン
トラキノン、芳香族アゾ化合物もしくはフタロシ
アニン化合物から誘導され、スルホン化されてい
る残基であり、R²は(a)有機基、一般にはスルホ
ン化された芳香族残基、特にスルホン化フエニル
基であるか、または(b)塩素原子である。代表的な
R¹は次の構造を有し得る。式中、R³、R⁴、R⁵は各々スルホニル基もしく
は水素原子を示す。またR¹はこのような構造の
アルキルもしくはアミノで置換された誘導体造を
有し得る。あるいは、R¹は次の構造を有してい
てもよい。式中、R⁶、R⁷、R⁸はスルホニル基もしくは水
素原子であり、トリアジニル環への結合点は
“〓”印の点のいずれでもよい。またR¹は、上記
式の構造の置換された誘導体構造も有し得る。一
方、他の多くの同様な化合物が知られている。市
販の染料を使用する場合、例えばエーテルもしく
はアセトンで洗浄することにより湿潤剤（wet―
ting agent）を除去する必要がありうる。マトリツクスは、アフイニテイークロマトグラ
フイー媒体（担体）として一般に用いられている
いずれの支持体でもよく、例えば、アガロース、
デキストロース、デキストラン及びアミド特にア
クリルアミドの重合体（ポリマー）及び共重合体
（コポリマー）がある。ガラスビーズもしくはナ
イロンマトリツクスも又使用しうる。セレロース
（cellulose）及び置換されたセルロースは重量の
大きい染料を結合させるがこの染料は蛋白質に近
付きがたく、したがつて蛋白結合能が弱いため、
これらセルロース類は一般に不適である。マトリ
ツクスは、アガロースの重合体もしくは共重合体
が好ましい。アルカリ金属水酸化物の最適濃度はリガンド
（配位子）の構造に依る。たとえば、モノクロロ
―トリアジニル誘導体（R²＝有機基）の場合最
適カツプリングを得るためにはPHを少なくとも
9.5にするべきである。一般に、アルカリ濃度は
0.02乃至0.4N、好ましくは0.05乃至0.2Nであるべ
きだが、上限は特に限定的でない。ジクロロ―トリアジニル誘導体（R²＝塩素）
を用いる場合、アルカリ濃度は約0.002乃至0.1N、
好ましくは0.005乃至0.01N（PHは約８乃至12.5）
であるべきで、最適アルカリ濃度を越えるとリガ
ンド結合が急激に減少するのが見られる。リガンドとマトリツクスのカツプリング（結
合）反応は、リガンドの結合量に重大な影響を与
えることなく、両反応体の安定な範囲以内で広い
温度範囲に亘つて行なえる。しかし、モノ―クロ
ロトリアジニルリガンドはゆつくりにしか結合し
ないため、周囲温度（15―25℃）の場合最適の反
応には40乃至60時間が必要になり、40乃至60℃の
高温にすると反応速度が速くなると共に厳格な溶
離プロフイールを示す媒体が得られるのでこのよ
うな温度が好ましい。ジクロロトリアジニルリガ
ンドは普通周囲温度の場合１乃至４時間以内で反
応し、高めの温度を用いても重要な利点はみられ
ない。反応スラリー中に塩化ナトリウムが、典型
的には0.25乃至0.5モル濃度（Ｍ）で存在すると、
共通イオン効果によつて染料導入が助長されるの
が見られる。普通、塩化ナトリウムが存在すると
染料の結合はほぼ２倍になるが、過剰になるとこ
の効果が逆転する。固体媒体中にクロライド基が存在すると蛋白結
合に悪影響がでたりするので、ジクロロリガンド
を使用する場合、好ましくは、上記のプロセスの
後に遊離のクロライド基をすべてアミノ基のよう
な害の少ない基に変換するための追加のステツプ
を実施すべきである。本発明の方法によれば、臭化シアンを用いない
従来の公知の方法で可能であつたよりも著しく高
濃度の染料がマトリツクスに結合可能となる。こ
うして、本発明の別の面に従えば、マトリツクス
に直接結合したトリアジニル基を含有する蛋白結
合性リガンド（配位子）を有し、実質的に下記の
構造を有する蛋白結合性固体媒体が提供される。式中、Ｘは―Ｏ―もしくは―NH―を示し、R¹
及びR²は上記で定義したとおりである。前記リ
ガンドは乾燥マトリツクス１ｇあたり少なくとも
7.5mg、好ましくは少なくとも15mgの割合で存在
する。これらの数字は、50％(V/V)酢酸の温浸
（digestion）の後分光光度法によつて測定され
る、実際に結合したリガンドに対するものであ
る。それらは、先行技術で時に引用された結合反
応で使用された量よりもかなり低い。マトリツク
スはアガロース重合体が好ましい。本発明の更に別の面によると、本発明の蛋白結
合性固体媒体は従来の方法でアフイニテイークロ
マトグラフイーによる蛋白質の分離及び精製に使
用しうる。すなわち、一般には１mlあたりの蛋白
質が１乃至20、例外的には100mgまでの濃度の緩
衝溶液としての未処置（粗製）もしくは半精製生
物学的材料を、一般にカラムに入れた固体媒体に
接触させる。媒体を洗浄後、保持された蛋白質
を、PH、緩衝組成もしくはイオン強度の異なる溶
液、または共基質（co―substrate）、補因子、阻
害剤、アロステリツクエフエクター、非結合リガ
ンドもしくはカオトロピツク（chaotrophic）試
薬を含む溶液を用いるか、あるいはまた電気泳動
によるような標準的技術によつて溶離しうる。本発明の媒体は動物とバクテリア両者の広範囲
の蛋白質、特に血液蛋白質及び酵素の簡単で高特
異的な精製を行なうことができる。例えば、アル
ブミン、グリセロキナーゼおよび特にウロキナー
ゼのようなキナーゼ、制限エンドヌクレアーゼを
含めたヌクレアーゼ、グリセルアルデヒド―３―
リン酸デヒドロゲナーゼもしくはβ―ヒドロキシ
酪酸デヒトロゲナーゼのような脱水素酵素、コリ
ンエステラーゼのようなエステラーゼ、または
DNAリガーゼのようなDNAもしくはRNA結合
蛋白質を精製するのに選択した媒体を用いうる。
媒体に結合したリガンドの含量が高いため、媒体
１ｇあたり分離されうる蛋白量は従来可能であつ
たよりも著しく多い。しかしある場合には、リガ
ンド含量が高いが故に蛋白質が過剰に結合し、そ
の結果、先行技術が達成できたリガンド濃度では
みられなかつた影響である溶離困難をもたらす。
従つて、これらの場合リガンド含量の最適化が必
要である。以下に蛋白結合性固体媒体の製造及び使用の特
定実施例を参照しながら本発明のさまざまな面を
例示する。ここで結合したリガンド量はすべて、
濾過ロート上で吸引乾燥した媒体の重量を基準に
している。たとえば15ｇの吸引乾燥媒体は固定容
量（settled volume）約25mlおよび完全に乾燥し
た材料１ｇに等しい。リガンドの結合の程度は染
料のバツチ間で、そして染料の材齢（age）によ
つて変化するため、異なる時間で行なわれた実験
の結果が必ずしも完全に同等ではないという点に
注意すべきである。これらの実施例で使用したリガンドは下記表１
の典型的な構造及び色指数構成数（Colour
Index Constitution Number）（CICN）を有す
る市販染料である。いずれの場合も、Ｍは水素原
子を示すこともあるが、一般にはアルカリ金属イ
オン、通常はナトリウムイオンを示す。染料はす
べて使用前にエーテルで洗浄した。

【表】

【表】固体媒体の製造実施例１〜８未架橋のアガロースゲル（Pharmacia Ltdが
“Sepharose 4B”という商標で供給）の試料を１
ｇずつ3.5mlの水に懸濁してスラリーとし、10mg/
mlのリガンドＡ水溶液を１mlずつ各試料に加え
た。５分間懸濁液を混合した後200ｇ/の塩化ナ
トリウム水溶液を0.5ml加えた。更に30分間混合
した後、5Nの水酸化ナトリウムを最終アルカリ
濃度が0.4、0.1、0.05、0.02、0.01、0.005、0.002
及び0.001Nになるように加えた。この懸濁液を
室温で更に19時間混合した後濾過した。固形分を
水で十分に洗浄し、試料１ｇ（濾過したままの湿
潤重量）を80〜90℃の50％(V/V)酢酸２ml中で温
浸した。リガンド含量は520nmの光学密度から推
定した。結果は後記第２表に示す。実施例９リガンドＢを用い、最終NaOH濃度を0.025N
として実施例１乃至８の手順を繰返した。結果は
後記第２表に示す。実施例 10〜14（比較例）アルカリとして最終濃度が0.002乃至0.2Nの炭
酸ナトリウムを使用し、BairdらがFebs
Letters，November（1976）、61〜66頁に記載し
た方法を用いて、リガンドＢを実施例９のマトリ
ツクスに結合した。固定時間（Standing time）
及び分析方法は実施例９と同様であつた。結果は
第２表に示す。

【表】

【表】実施例 15〜22 本発明もしくはBairdら（supra）の方法によ
り、各系に最適な最終アルカリ濃度でリガンドＥ
及びＨをSepharose 4B（アガロース）もしくは
Cellulose（セルロース）のいずれかに結合した。
結果を第３表に示す。

【表】実施例 23〜30 リガンド濃度を変えるために水及び10mg/mlの
リガンド溶液の量をいろいろに変えて実施例１の
手順を繰返した。最終アルカリ濃度は0.025Nと
し、インキユベーシヨン期間は19時間から17時間
に短縮した。結果を第４表に示す。

【表】実施例 31〜32 モノクロロ―トリアジンリガンド（リガンド
Ａ）及びジクロロ―トリアジンリガンド（リガン
ドＤ）を用い、最終アルカリ濃度を0.025Nとし
て実施例１の手順を繰返した。アルカリ添加後
様々な間隔で試料を取り、リガンド含量を分析し
た。結果を第５表に示す。

【表】実施例 33〜38 水酸化ナトリウムもしくは炭酸ナトリウムのい
ずれかを様々な最終濃度で存在させ、実施例１の
方法を用いてナイロンシート（多孔度30ミクロ
ン）の試料１ｇにリガンドＥを結合した。酢酸温
浸（digestion）方法はナイロンには適用できな
いので、結合したリガンドの量は反応液の残留リ
ガンド含量から推定した。結果を第６表に示す。

【表】実施例 39〜42 水酸化ナトリウムの最終濃度を0.025Nとし、
種々のマトリツクスとリガンドＢを使用し、74時
間混合を行つて実施例１の方法を繰り返した。結
合したリガンドの重量を第７表に示す。

【表】名である。
比較テスト比較のためにリガンドＥ，Ｈ及びＩを、本発明
の方法（最終アルカリ濃度は、リガンドＥでは
0.025Nとし、リガンドＨ及びＩでは0.1Nとし
た）、米国特許4016149の方法、及びドイツ特許出
願（DOS）P2722970.5の方法でSepharose 4Bに
結合する。前記方法の各々に於て臭化シアン活性
化をした場合としない場々とを検討した。結果を
第８表に示す。

【表】かくして、本発明の方法によれば臭化シアン活
性化をしないで先行技術のどの方法よりも高いリ
ガンド濃度が得られる。又このリガンド結合は、
臭化シアン活性化によつて得ることができるリガ
ンドの結合に匹敵するものである。種々の方法でマトリツクスに結合したリガンド
ＥとＩを含むカラムの安定性を比較するために、
10mMのリン酸カリウム（PH7.5）中でカラム２
mlを調製し、室温（18―22℃）でこれらを保存し
た。これらのカラムを同じバツフアー20〜35mlで
周期的に洗浄し、洗液のリガンド含有量を分光測
光で測定した。カラムに残存するリガンドのパー
センテージを算定した。結果を添付図面に示す。縦軸の「％保留配位
子」はカラムに残存するリガンドの割合（％）を
示す。線ａ，ｂは、本発明の方法で結合したリガ
ンドＥ，Ｉのカラムからの浸出パターンを示し、
線ｃ，ｄは、臭化シアン活性化を用いた
USP4016149の方法で結合したリガンドＥ，Ｉの
カラムの同様なパターンを示す。固体媒体を使用した蛋白質の精製下記実施例に於て使用した媒体は下記の一般手
順に従つて製造した。未架橋アガロースゲル（Sepharose 4B）800ｇ
を脱イオン水で洗浄し、脱イオン水2.8中に懸
濁した。これに、脱イオン水800ml中にリガンド
16〜20ｇを含有する溶液を添加した。この混合物
を５分間撹拌してから200ｇ/の塩化ナトリウム
溶液200mlを添加した。さらに30分間撹拌した後、
10Nの水酸化ナトリウムをモノクロロ―トリアジ
ンリガンドに対しては40ml、ジクロロ―リガンド
に対しては５ml添加した。その後、室温でそれぞ
れ48時間（又は耐熱マトリツクス、例えば架橋し
たマトリツクスでは60℃で16時間）、もしくは４
時間（30℃で２時間）静かに撹拌する。次に、混
合物を濾過し、固体を水、20％エタノール水中の
1M塩化ナトリウム、1Mの塩化ナトリウム水、次
いで水で順次洗浄した。ジクロロ―トリアジニル
リガンド場合、媒体を0.1M NaOH／1M塩化ア
ンモニウム（PH8.6）と共に撹拌して、残存する
クロライド基をアミン基に変換する。実施例 43〜46 本発明の方法によつて濃度0.81、0.52及び0.23
mg／ｇでSepharose 4Bに結合させたリガンドＥを
有する媒体と、Bairdらの方法（前述のFebs
Letters）によつて濃度0.09mg/ｇでSepharose
4Bに結合させたリガンドＥを含む媒体とを使用
して、グリセロキナーゼを精製した。 Bacillus stearothermophilusから誘導された、
蛋白１mg当り25ユニツト(U/mg)の活性を有する部
分的に精製されたグリセロキナーゼを10mMのリ
ン酸カリウム（KP）バツフア（PH7.5）中に５〜
15mg/mlの濃度で溶解し、上記固体媒体のカラム
に流した。次にカラムをバツフアで洗浄、結合し
た酵素を同じバツフア中の5mM MgCl₂、
5mMATPの溶液で溶離（溶出）した。種々の媒
体に結合され、回収された酵素の量を後記第９表
に示す。実施例40の生成物は120U/mgの比活性を有し、
SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動（PAGE）
で58000ダルトンに単一のバンドを示した。実施例 47〜52 Sepharose 4B上に種々の濃度のリガンドＥを
含有する媒体を使用し、且つ同じバツフア中の
1MKCl／2mM MgCl₂／2mM ATPで溶出させ
て実施例43を繰り返した。結果を後記第９表に示
す。実施例 53 臭化シアン活性化を伴つてSepharose 4B １ｇ
当りリガンドE5.6mg含有の媒体を使用して実施例
47を繰り返した。結果を第９表に示す。

【表】実施例 54、55 実施例43〜46で使用した部分的に精製された酵
素をPH5.5の10mM KPバツフアに溶解し、
Sepharose 4B上にリガンドＦを0.2mg/ｇ及び0.7
mg／ｇで含有するカラムに流した。結合量は100及
び200ユニツト（飽和してない）であつた。PH7.5
の50mM KPで洗浄したところ、0.2mg/ｇのカラ
ムからは結合した酵素の実質的に全てが溶離した
が、0.7mg/ｇのカラムからは全く溶離しなかつ
た。1M塩化カリウムではどちらのカラムからも
全ての酵素が溶離した。実施例 56 カルボキシ―ペプチダーゼＧを蛋白１mg当たり
24ユニツト含有するPsudomonas菌由来の部分精
製細胞抽出物をPH7.0の25mMトリス―アセテー
トバツフアに約10mg/mlで溶解し、Sepharose 4B
上にリガンドＧを0.39mg/ｇ含有するカラムに流
した。そのカラムを同じバツフアで洗浄し、
2mMのパラ―アミノベンゾイルグルタミン酸
（PABA―Ｇ）で酵素を溶離した。この生成物は
150ユニツト／mgの比活性を有していた。溶離は
1M KClでもできた。実施例 57、58 Sepharose 4B上にリガンドＢを0.1mg/ｇと
0.65mg/ｇで含有するカラムを使用して実施例56
を繰り返した。2mM PABA―Ｇでは0.65mg/ｇ
のカラムから酵素を溶離できなかつた。しかし、
2M KClではいずれのカラムからも溶離できた。実施例 59 β―ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼを蛋白１
mg当たり約0.1U含有するRhodopseudomonas
spheroidesの細胞１Kgから抽出した粗細胞抽出物
をPH7.5の10M KPバツフアに蛋白30〜40mg/mlで
懸濁した。これをSepharose 4B上にリガンドＡ
を0.44mg/ｇ含む２カラムに流した。カラムを
同じバツフアで洗浄し、次いでPH7.5の10mM
KP中1M KClで溶離した。95％以上が回収され、
比活性は３―４U/mgであつた。この生成物を10mM KPバツフア（PH7.5）に
対して透析した後、Sepharose 4B上にリガンド
Ｆを0.57mg/ｇ有する900mlのカラムに流した。こ
のカラムをバツフアで洗浄し、次に10mM KP／
1M KClバツフア（PH7.5）で洗浄した後、PH7.5
の10mM KP／1M KCl／5mM NADHで溶離し
て20〜25U/mgの比活性を有する生成物を得た。
この生成物はSDSPAGEでサブ―ユニツト分子量
23000に単一のバンドを示した。全回収率は80％
以上であつた。実施例 60〜63 実施例39〜42で製造した媒体を使用して実施例
56の方法を繰り返した。結合した酵素の量を第10表に示す。1M KClで
の溶離回収率は、あらゆる場合に85〜95％であつ
た。

【表】ス
実施例 64 遠心分離したウマ血清をDEAEセルロースに吸
着させて部分的に精製して、蛋白１mg当りコリン
エステラーゼ0.08U含有の蛋白試料を生成した。
これを凍結乾燥し、次いでPH6.8の10mM KPバ
ツフア中に蛋白20mg/mlで溶解し、0.58mg/ｇのリ
ガンドＣをSepharose 4B上に有するカラムに流
した。充填カラム１ml当たり14Uが結合した。カ
ラムをバツフアで洗浄し、1M KCl含有の同じバ
ツフアで溶離すると収量80％の蛋白製剤が得られ
た。この蛋白製剤は、蛋白１mg当たり、4Uのコ
リンエステラーゼ比活性を有していた。実施例 65 粗製人尿を中空フアイバーユニツト（商品名
“Amicon”HIDP 10型）を用いて限外過する
ことによつて約20〜40倍に濃縮した。この濃縮物
（蛋白2.5mg/ml含有）をPH7.5の10mM KPバツフ
アで予め平衡化したSepharose 4B上にリガンド
Ｆを0.6mg/ｇ含むカラムに流した。カラムを同じ
バツフアで洗浄し、PH7.5の1M KClで溶離して
ウロキナーゼ製剤を得た。このウロキナーゼ製剤
は前記濃縮物の200〜300倍の比活性を有してい
た。実施例 66、67 リガンドＢ，Ｅを使用して実施例65を繰り返し
た。両方の場合に於て満足し得る分離が得られ
た。

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