JPS6357407B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

〔産業上の利用分野〕 本発明は修飾グルコサミノグルカン類を有効成
分として含む抗血栓剤に関する。 〔従来の技術〕 血栓は網状フイブリン中で血小板と多核白血球
の凝集であり、心臓梗塞（cardiac infarct）や
脳梗塞（cerefral infarct）、静脈血栓として知ら
れる重篤な血管病変をひきおこす重要な要因と考
えられている。 血栓は、凝固栓または凝固塊とよばれる凝固と
は構造的に異なるものであることを強調する必要
がある。実際、凝固栓などは血管病変の場所に形
成されるのに対して、真の血栓は血液循環中にも
形成され、必ずしも血管病変をひきおこすもので
はない。これらの凝集を混同することが過凝固性
に基づく凝固系の単純な変調が血栓を形成すると
いう誤まつた観念を産み出しそれゆえこの病変が
予知でき、また単に抗凝固剤を投与することによ
り治療できると信じられてきた。さらに、動脈血
栓と静脈血栓を区別する必要がある。というの
は、もし動脈に血栓が形成されると血流の静止が
おこり、それに伴つて梗塞がおこる。一方、静脈
に血栓が形成されると、そこが破れたり肺のレベ
ルで血栓が大きくなつて塞栓ができたりして、そ
こが死亡原因となる。 血栓予防においては血小板の抗凝集活性を有す
る物質がフイブリンを可溶性ペプチドに分解する
フイブリン溶解剤や網状フイブリンを形成するい
くつかの因子の阻害剤として働く薬剤などが使用
されている。これらの因子の中では内在性凝固子
の構成成分であるトロンビンとXaフアクター
（活性因子Ｘ）が開示されている。この２つの因
子の阻害剤として最も広く用いられているものの
１つがヘパリンである。 この薬剤の抗血栓活性は抗Xa活性が大きけれ
ば大きいほどその抗血栓活性が大きくなるという
意味においては、抗Xa活性であると表現するこ
ともできる。実際、ヘパリン製剤は高い抗凝固活
性とともに高い抗Xa活性をも示している。抗凝
固活性は一般に国際単位／mg（IU／mg）で表わ
されている。このヘパリンは投与した部位に血腫
を形成したり、またこの製剤の長期使用で低凝固
能という危険な状態をひきおこしたりするといつ
たきわめて重篤な副作用を有しいる。 さらに現在までになされた臨床研究に報告され
ているように、静脈血栓を予防することができて
もそれは静脈血栓にはあてはまらないという事実
も知られている。 〔発明が解決しようとする問題点〕 それゆえ、抗凝固活性、抗Xa活性およびある
種のフイブリン溶解活性を有しないかまたは殆ん
ど有しないような薬剤を使用することが、静脈血
栓も動脈血栓も防ぐためには非常に望ましい。こ
れらの理由から、高い抗Xa活性とより少ない抗
凝固活性を示すヘパリンフラクシヨン（これらは
ヘパリンからえられ、全体としてではさまざまな
構造異型および明らかな多分散系の分子量を示
す）の製法をめぐつて世界中で研究がなされてい
る（たとえばHolwerE.ら“Thrombos res.，”
25，475（1982））。 本発明者らは、イタリア特許出願第22851A／
80号明細書に記載されているヘパリン誘導体、す
なわちヘパリンのＮ−脱硫酸化とそれにつづくサ
クシニル化の過程をへてえられたヘパリン誘導体
が、驚くべきことに極めて低いかまたは全く抗凝
固活性を示さず、かつ少ないかまたは全く抗Xa
活性を示さず、原料物質であるヘパリンに関する
充分満足のいく脂肪分解活性にも示しており、さ
らに生体内で血栓の形成に対して有意な抑制活性
を示すことを見出し、本発明を完成した。 〔問題点を解決するための手段〕 すなわち本発明は、Ｎ−脱硫酸およびサクシニ
ル化することによつて修飾されているヘパリンの
フラクシヨンであつて、該フラクシヨンがＮ−硫
酸基を修飾前のヘパリンの10％未満含みかつ二糖
単位あたり0.6を超えるサクシニル基を含んでい
るヘパリンフラクシヨンを有効成分とする心臓梗
塞、脳梗塞および静脈血栓の予防および治療に有
用な抗血栓剤に関する。 〔作用および実施例〕 この化合物有する抗血栓活性は、その強さに関
する限り、その化合物が示した抗凝固活性と抗
Xa活性（それぞれ0.21U／mgおよび2U／mg）の
値（これらは０または殆んど０に近い）のみに基
いて説明することはできない。 前記ヘパリン誘導体の示す血栓形成を防ぐ働き
はこれまで指摘されておらず、またこれまでの技
術とはちがつた方法である。 Ｎ−脱硫酸化されたヘパリンのサクシニル誘導
体は、ルセル・ウクラフの西ドイツ特許第
1201322号明細書にも記載されている。しかしな
がらこの特許には同じ物質の抗脂肪血症活性のみ
が記載されており、その活性は低い抗凝固活性を
伴つている。 前記血栓形成の抑制活性のほかに、前記ヘパリ
ン誘導体はフイブリン溶解活性を示している。こ
れについては以下に示すのラツトでの生体内にお
けるF.D.P.（フイブリン溶解生成物）の測定やオ
イグロブリンの溶解時間の測定やヒトでの実験に
よつて示されている。本発明の製剤の有効成分と
して用いられているＮ−脱硫酸サクシニル化グル
コサミノグルカン誘導体はイタリア特許出願第
22851A／80号明細書に記載されている前記方法
によつてえられる。さらに詳しくは、ヘパリンを
70℃から100℃の間で３時間以上、少なくとも0.1
規定以上、なるべくなら0.5規定かそれ以上の強
酸を用いて加水分解し、その後PH7.0以上の無水
コハク酸を加水分解されたヘパリンとの重量比が
１：１から５：１程度になるように加えて加水分
解産物をサクシニル化する。 本発明の有効成分であるグリコサミノグルカン
誘導体は、原料物質であるヘパリンに存在するＮ
−硫酸基をもとの10％未満含み、サクシニル基を
二糖単位あたり0.6を超えて、望ましくは約1.2含
んでいる。 つぎに製造例および薬理試験例をあげて本発明
の抗血栓剤を説明する。 製造例 ３のフラスコに冷却器と撹拌棒をとりつけ、
また不活性雰囲気中で反応させるためにチツ素ガ
スを入れる入口を設けた。そのフラスコに２の
蒸溜水を入れ、ヘパリンのナトリウム塩200ｇを
加えた。ついで撹拌しながら室温で溶解し、２規
定塩酸400c.c.を加えた。えられた透明な溶液をチ
ツ素ガスによつて脱気し、そのままチツ素ガス中
においてこの溶液を沸騰した湯浴に静置し、６時
間反応させた。この溶液を反応後室温に冷却し、
氷冷却下で冷たい水酸化ナトリウム飽和溶液を添
加しPHを8.5に調製した。ついで温度を５〜10℃、
PHを水酸化ナトリウムで約８に調製した状態で無
水コハク酸400ｇを何回かに分けて加えた。無水
コハク酸400ｇを加えおわるとPHは約7.4〜7.5に
なつた。えられた冷たい溶液を30分間撹拌し、つ
いで95％エタノールをその３倍量加えた。生成し
た沈澱物は初めは油状であるが、しばらく放置す
ることにより次第に固形状となつた。これを吸引
濾過し、風乾し、ついでこの沈澱物を３の蒸溜
水に再び溶解し、公称約600ダルトンカツトオフ
の透析器により、蒸溜水を用いてコハク酸ナトリ
ウムがなくなるまで透析した。最後にえられた溶
液を凍結乾燥すると、針状結晶のＮ−脱硫酸サク
シニル化グルコサミノグルカン誘導体が200ｇえ
られた。 （ ¹³C−NMRスペクトル分析） ジオキサン−D₂O中で25.2MHzで測定し、内部
標準としてはジオキサン（ppm67.4）を用い、デ
ータはppmで表示した。実験方法はG.Gatti、B.
Casu、G.K.HamuおよびA.S.Perlinらが
Macromolewlcs12，1001（1979）に示した方法を
用いた。 えられたスペクトルをヘパリンナトリウム塩の
ヘパリンと比較したところ、同じ条件で測定する
とつぎのシグナルおよびヘパリンとの差異がえら
れた。 (1) 新しいシグナルが181.8に認められ、これは
コハク酸残基のCOO^-によるものと考えられ
る。 (2) 新しいシグナルが177に認められ、これはコ
ハク酸残基の−CONHによるものと考えられ
る。 (3) 176.7に認められるシグナルはイドロン酸残
基の−COOHによるものと考えられ、これは
ヘパリンのものと一致する。 (4) 102に認められる小さなシグナルは少量含ま
れているグルクロン酸残基のC₁によるものと
考えられ、これもヘパリンのものと一致する。 (5) 100に認められるシグナルはイドロン酸残基
のC₁によるものと考えられ、ヘパリンのもの
と一致する。 (6) 95.3に認められる新しいシグナルはＮ−サク
シニル−グルコサミンのユニツト中のC₁によ
るものと考えられる。同時に出発物質のヘパリ
ンがもつグルコサミン−Ｎ−硫酸残基のC₁に
よるものと考えられる97.7のシグナルの消失が
認められた。 (7) 72から76の間に新しい一連のシゲナルが認め
られたが、これはＮ−サクシニルグルコサミン
残基のC₂とC₄、またイドロン酸残基のC₂によ
るものと考えられる。これらのシグナルはヘパ
リンのスペクトルでは76に単一の強いシグナル
として現われる。 (8) 70と71に認められる２つのシグナルはＮ−サ
クシニルグルコサミン残基のC₃とC₅、イドロ
ン酸残基のC₃とC₅によるものと考えられる。
これらはヘパリンの同じ原子のシグナルと一致
する。 (9) 67に認められるシグナルはＮ−サクシニルグ
ルコサミン残基のC₆によるものと考えられる。
これはヘパリンのＮ−スルホニル残基のC₆の
シグナルと一致する。 (10) 54.5に認められる新しいシグナルはＮ−サク
シニルグルコサミン残基のC₂によるものと考
えられる。同時にヘパリンのスペクトルで見ら
れるＮ−スルホニルグルコサミン残基のC₂に
よる58.8のシグナルが消失する。 (11) 33.0と33.5に認められる２つの新しいシグナ
ルは、Ｎ−サクシニルヘパリン中のコハク酸残
基の−CH₂COO^-と−CH₂−CO−NH−による
ものと考えられる。 薬理試験 （抗血栓活性） (1) 活性の決定 実験はUmctzo（Teruhiro Umetzoら
“Thromb−osis and Haemostasis−Stuttg”
39、74（1978））の方法として知られている方法に
従つて行なつた。この方法はラツトの右のあご動
脈と左のあご静脈をシリコーンチユーブで接続
し、その中に巻いたシルクの糸であるエシコンの
糸を入れておく方法である。すなわち、チユーブ
でつないだために血流はチユーブを通過し、その
結果糸のまわりに血栓が形成される。そしてそれ
は抗血栓剤の非存在下ではその血栓重量が重く、
抗血栓剤が存在するばあいにはその活性と用量に
より、血栓重量は減少するか、消失する。 対照薬としてヘパリン（内部標準：抗凝固活性
155IU／mg、抗Xa活性168U／mgで、これらは比
色定量器Hepachrom×Stago−Diagnostic
Stago、パリ、フランスにより決定した）を用い
た。 部分的にＮ−脱硫酸化されたサクシニルグルコ
サミノグルカンのナトリウム塩（以下、GGMと
略す）の抗凝固活性は0.2IU／mg、抗Xa活性は
2U／mgであつた。これらの値はヘパリンと同様
の方法を用いて決定した。これらについては出発
物質として同じヘパリンを用いているイタリア特
許出願第22851A／80号明細書に記載されている。
実験には体重約350ｇの雄性アルビノ・ウイスタ
ー系ラツトを用い、ウレタン（1.25ｇ／Kg、ip）
麻酔下で行なつた。体外血液循環に供した材料は
内径2.5mm、重量６mgのエシコンであつた。 被検物質は体外血液循環を始める直前に生理食
塩水に溶解して１mg／Kgの割合でシリコーンチユ
ーブを通じて注入した。体外血液循環の時間は15
分間とした。血栓はシリコーンチユーブからシル
クの糸をひき抜き、直ちにその重量を測定した。
血栓の正確な重量は全重量から糸の重量を差し引
いて決定した。 動物の一群は、血栓抑制物質がないばあいの血
栓重量の平均値をうるために、生理食塩水のみを
１ml／Kgの割合で投与した。それぞれの処理動物
について、凝固系に対する処理の影響を調べるた
めに凝固時間を測定した。えられた結果を第１表
に示す。

【表】 なお、血栓形成の抑制率は生理食塩水のみを投
与した群の血栓重量と比較したばあいの血栓重量
の減少量に換算して計算した。生理食塩水のみに
投与したばあいにえられた血栓重量の平均値は30
匹の平均によると、101.93±6.38mgであつた。 凝固するまでの時間：生理食塩水を投与したば
あいの凝固に要する時間は、平均144.14±6.21秒
であつた。ヘパリンを投与するとその時間は用量
依存的に変化し、１mg／Kgの用量では521.40±
41.06秒にまで達した。しかしながらGCMを200
mg／Kgの用量まで投与しても時間は生理食塩水投
与時の時間を変わりがなく、400mg／Kgまで投与
して228.50±17.55秒となつた。 これらの結果は、明らかにGGMの抗血栓活性
が抗トロンビンを活性化することにより抗凝固活
性を現わしているのではないということを示して
いる。さらに抗Xa活性による値が低い点から考
えると、GGMの抗血栓活性はXaフアクターの直
接的な抑制活性によるものではない。 (2) 活性の接続時間 前記と同一の実験条件下で１群６匹のラツトに
実験開始時にヘパリンを77.5IU／Kgの用量で投与
し、GGMを115mg／Kgの用量で投与した。これ
らの用量は抗血栓活性において同じ活性をもつ用
量である。さらに第２表に示すように被検物質の
投与と体外血液循環の開始までの時間をさまざま
に変えて実験を行なつた。結果を第２表に示す。
データは各時間でえられた抑制率で示した。

【表】 なお、生理食塩水のみを処置した動物、すなわ
ち対照群の血栓平均重量は92.98±5.69mgであつ
た。 （フイブリン溶解活性） (1) ラツトに静脈内投与したばあいのF.D.P. 実験には平均体重約220ｇの雄性ウイスター系
ラツトを用いた。被検物質は無麻酔の動物に屠殺
前30分、60分、120分および240分の時点で静脈内
投与した。溶媒として蒸溜水を１mg／Kgの割合で
用いた。フイブリン分解生成物はBoehringer
Mannheim，Staphylococcal Clumping Testのキツトを用いて血漿から調
べた。対照群の値は生理食塩水を１mg／Kgの割合
で投与して算出した。結果を第３表に示す。

【表】 つぎにオイグロブリンの溶解に要する時間を調
べた。実験方法は以下に示すとおりである。血漿
中のオイグロブリン画分は、プラスミノーゲンア
クテイベーターやプラスミノーゲンとフイブリノ
ーゲンを含んでいる。オイグロブリンを含んでい
る画分はトロンビンによつて凝固し、その凝固物
の溶解に要する時間をGGM存在下または非存在
下で算出した。ウイスター系ラツトの血漿を用い
てGGMの３つの用量についてEuglobulin Lysis
Reagents−Dade Diagnostics、アグアダ
（Aguada）、プエルトリコのキツトを用いて調べ
た。用いたGGMの用量は25μｇ、50μｇおよび
100μｇとした。結果を第４表に示す。

【表】 （ヒトでの試験） オイグロブリン溶解に要する時間を調べた。健
康なボランテイアからのヒト血漿を実験に供し
た。実験はEuglobulin lysis Reagent−Dade
Diagnostics、アクアダ（Aguada）、プエルトリ
コのキツトを用いた。先の実験で用いたGGMの
25μｇ、50μｇ、100μｇの用量について調べた。
結果を第５表に示す。

【表】 本発明は、グルコサミノグルカン誘導体の抗血
栓剤としての使用、とくにある一定量の臨床的に
有効なグルコサミノグルカン誘導体の少なくとも
１種を有効成分とし、さらに調剤上よく用いられ
る賦形剤を含む製剤に関するすべての工業的用途
に関するものである。製剤は筋肉内および静脈内
注射剤、湿布剤、錠剤、カプセル剤などの剤形で
使用される。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ Ｎ−脱硫酸およびサクシニル化することによ
   つて修飾されているヘパリンのフラクシヨンであ
   つて、該フラクシヨンがＮ−硫酸基を修飾前のヘ
   パリンの10％未満含みかつ二糖単位あたり0.6を
   超えるサクシニル基を含んでいるヘパリンフラク
   シヨンを有効成分とする心臓梗塞、脳梗塞および
   静脈血栓の予防および治療に有用な抗血栓剤。 ２ 修飾されたヘパリンが二糖単位あたりサクシ
   ニル基を約1.2含んでいる特許請求の範囲第１項
   記載の抗血栓剤。 ３ 静脈内投与、腸管外投与または経口投与用の
   単位製剤の形に製剤化されてなる特許請求の範囲
   第１項記載の抗血栓剤。 ４ 前記有効成分を0.5〜300mg／Kg体重含有して
   なる特許請求の範囲第１項記載の抗血栓剤。 ５ 前記有効成分を５〜30mg／Kg体重含有してな
   る特許請求の範囲第１項記載の抗血栓剤。