JPS636049B2

JPS636049B2 -

Info

Publication number: JPS636049B2
Application number: JP54076462A
Authority: JP
Inventors: Saiki Senoo; Kyomatsu Nakai; Tatsukage Mori
Original assignee: Green Cross Corp Korea
Current assignee: GC Biopharma Corp
Priority date: 1979-06-18
Filing date: 1979-06-18
Publication date: 1988-02-08
Also published as: JPS55167229A

Description

【発明の詳細な説明】本発明は、人尿中に含有されるカリジノゲナー
ゼの濃縮方法に関する。さらに詳しくは人尿中の
カリジノゲナーゼを他の生物活性物質から効率的
に分離するためのカリジノゲナーゼの濃縮方法に
関するものである。

カリジノゲナーゼは、血漿中のキニノーゲンに
作用して特異的にキニンを遊離させる酵素であ
り、種々の組織や体液、すなわち顎下腺、汗腺、
唾液腺、肝蔵、小腸、血清、尿などにも分布して
いることが知られている。その薬理作用は、平滑
筋収縮作用、毛細結管透過性亢進作用、血管拡張
作用、血圧降下作用、白血球凝集作用、疼痛誘発
作用、カテコールアミン分泌作用等を示す。従つ
て現在カリジノゲナーゼ製剤は、内科領域では脳
血管障害、冠動脈性心蔵疾患及び高血圧症治療用
に、外科領域では種々原因に依る四肢末梢血行障
害治療用に、眼科領域では網膜末梢血管拡張及び
眼底血圧降下等用に使用され、更には耳鼻科領域
ではメニエル症候群、神経性耳鳴等の治療用に汎
く用いられている有用な医薬品である。

カリジノゲナーゼを含めて人尿中に存在する生
理活性物質の精製・回収法は従来よりきわめて多
数のものが提案されてきた。しかしかかる従来方
法は、多種の生理活性物質の混合物から個々の生
理活性物質の精製及び回収を特異的に行なうもの
であつたが、人尿中に存在する多種の医療上有用
な生理活性物質相互の関連性を考慮した効率的な
分離方法の確立はなされていなかつた。

そのため従来技術においては、人尿からの多種
有効生理活性物質の回収において、その操作が面
倒であつたり、純度や回収率の低減がおこり、該
製剤が比較的高価になるなど、工業的にきわめて
好ましからざる状態であつた。

本発明の目的は、人尿の存在する生理活性物質
の効率のよい工業的製造方法の提供にある。すな
わち人尿中に存在するカリジノゲナーゼを効果的
に精製、回収すると共に他の生理活性物質の分
離、回収をも容易にするための方法の提供にあ
る。

本発明により人尿とコロイド性含水ケイ酸とを
PH5.5〜９において接触させ、カリジノゲナーゼ
以外の生理活性物質の大部分を吸着させ、上清と
ケイ素を含む吸着剤とをPH3.0〜5.2において接触
させカリジノゲナーゼを吸着させ、吸着したカリ
ジノゲナーゼを溶離することを特徴とする人尿中
のカリジノゲナーゼの濃縮方法が提供される。

本発明者らはコロイド性含水ケイ酸アルミニウ
ムが、人尿よりカリジノゲナーゼを選択的に吸着
することを見出し本発明に到達した。即ちPH3.0
〜5.2において人尿中のカリジノゲナーゼはその
約30〜約70％が選択的に吸着されるのに対し、重
要な生理活性物質であるリゾチームなどはPHが上
限よりも高い場合にその大部分が吸着されること
が判明した。

本発明において、使用する人尿は勿論腐敗して
いない新鮮なものが好ましい。尿はそのPHが5.5
〜９である以上そのまま用いてもよいが、その範
囲に更に好ましくは5.7〜8.5に調整して用いても
よい。またPH調整時に生ずることのある沈澱物あ
るいは尿中の浮遊物は常法例えば遠心分離・濾
過・透析などで除去することが好ましい。

本発明で用いるコロイド性含水ケイ酸アルミニ
ウムとは、SiO₂とAl₂O₃を主としSiO₂／Al₂O₃の
比が4.4〜7.7（平均5.9）からなる化合物である。
使用するコロイド性含水ケイ酸アルミニウムの添
加量は原尿の１に対して50〜500mgで十分であ
るが、これ以上多い場合も収量の問題を別にすれ
ば特に限定されるものではない。

このコロイド性含水ケイ酸アルミニウムは、前
処理としての洗浄後、必要量を尿中に添加し、尿
中に含有される生理活性物質と接触させ、リゾチ
ームなどカリジノゲナーゼ以外の物質を吸着させ
る。接触時間は、約30分から５時間であり、バツ
チ法の場合はより好ましくは撹拌する。処理法
は、バツチ法で十分であるが、カラムクロマト法
でもよい。処理温度は特に限定されるものではな
く、室温で十分であるが、より好ましくは、５〜
30℃である。吸着が十分おこなわれた後、吸着剤
と上清部とを分離する。この分離は、傾斜法でも
よいが、遠心分離でもよく、特に限定されない。
分離されたコロイド性含水ケイ酸アルミニウム
は、洗浄後該吸着剤への吸着した生理活性物質を
溶出回収することができる。

該吸着剤に吸着することなく残つた上清部は、
カリジノゲナーゼの製造原料として利用される。

上清は、そのまま、好ましくは遠心分離をおこ
なつた後、PHを3.0〜5.2、好ましくは４〜５に調
整する。この水溶液から含有するカリジノゲナー
ゼを回収するためには、ケイ素を含有する吸着剤
と接触させ、該吸着体にカリジノゲナーゼを吸着
し回収する。ケイ素を含有する吸着剤としては、
コロイド性含水ケイ酸アルミニウム、シリカゲ
ル、ケイ酸アルミン酸マグネシウム、シリカガラ
スおよび珪藻土等が利用できる。これら吸着剤
は、洗浄し、PH３〜5.2に調整、好ましくはこの
範囲のPHを有する緩衝液で平衡化した後、バツチ
法又はカラムクロマトグラフイ法によつて、前記
カリジノゲナーゼを含有する水溶液と接触させ
る。接触条件として時間は約30分間から５時間、
温度は室温で十分であるが、好ましくは５〜30℃
である。吸着剤の添加量は、カリジノゲナーゼを
含む水溶液１に対して50〜1000mgであり、カリ
ジノゲナーゼの吸着後、バツチ法の場合は、傾斜
又は遠心して分離し、吸着剤を回収し、カラムク
ロマト法の場合はそのまま、該吸着剤を洗浄後溶
離用緩衝液でカリジノゲナーゼを溶出させる。

溶出は、PH９〜12のアルカリ性水溶液、0.3M
以上の塩濃度を含む電解質溶液、又はこれらの組
合せからなる水溶液で行われる。例示すれば、
NaClを0.1M〜0.5M含有するPH10の0.15〜0.2Mリ
ン酸塩緩衝液、0.5M〜2Mの塩基性アミノ酸を含
むアルカリ性溶液、約２％濃度以上のアンモニア
水、PH10以上とした1M濃度以上の食塩水溶液、
あるいはPH10以上とした0.5M濃度以上の硫安水
溶液、５〜10％の中性アミノ酸水溶液等が用いら
れる。

かくして得た水溶液中には、カリジノゲナーゼ
が濃縮した状態で回収され、さらにこのものは公
知の方法に従つて高度精製される。例えば、弱塩
基性陰イオン交換樹脂を用いる方法（特開昭50−
155608）、固定化コンカナバリンＡをもちいる方
法（特開昭52−18883）、さらに、２種以上の陰イ
オン交換体、ゲル濾過等を組合わせる方法〔J.
Biochem.80 671（1976）〕等が利用される。以下
周知の医薬品製造の慣用技術に従つて医療用に供
することのできるカリジノゲナーゼ製剤が得られ
る。なお精製工程においてウイルス不活化のため
の加熱処理を行うことができる。

以上からなる本発明の方法は、ヒトの尿からの
カリジノゲナーゼの回収を効率的に実施可能にす
るばかりでなく他の生理活性物質の取得も容易に
するものであつて、その商業的価値はきわめて高
い。

以下に本発明を更に詳細に説明するため実施例
を挙げる。

実施例において、カリジノゲナーゼ活性の測定
法（血流増加測定法）はモリヤら（Moriya et
al）〔H.Moriya、K.Yamazaki、and H.
Fukushima、J.Biochem.、58、201（1965）〕らの
方法に準じて行つた。すなわち、体重10Kg程度の
雑種成犬を用いて、ペントバルビタール（25〜50
mg／Kg）の腹腔内注射により麻酔し、股動脈を露
出させ、ヘパリンを静注した（3000〜5000単位）
後、股動脈にカニユーレを挿入して、電磁流量計
（日本光電MF−２型）を経て、股動脈末梢側に
還流した。電磁流量計で捕えた微量の血流変化は
直流増幅器を経て記録計（日本光電RJG−3022）
に記録させた。

標準カリジノゲナーゼには、発明者らにより精
製したブタ膵臓性カリジノゲナーゼ751−Ｍ
（26.7KU／mg）を用いた。なお、活性はKU（カ
リジノゲナーゼ単位）で表記した。

実施例１コロイド性含水ケイ酸アルミニウム50ｇを十分
量の蒸留水で洗浄した後、0.1Mリン酸塩緩衝液
PH6.0で平衡化する。成人男子より採集した新鮮
尿約100をPH6.0に調整し、コロイド性含水ケイ
酸アルミニウムと接触させる。約２時間撹拌接触
させた後、静置させ上清と吸着剤とに分離する。
吸着剤に吸着された生理活性物質は別途回収す
る。上清を5N HClによつて、PHを4.5に調整し、
これにコロイド性含水ケイ酸アルミニウムを100
ｇ添加し、カリジノゲナーゼを含む水溶液との接
触をおこなう。約２時間撹拌後静置し、コロイド
性含水ケイ酸アルミニウムを分離する。これを十
分量の冷水で洗浄した後、10％Ｗ／Ｖ硫安水溶液
（PHをNaOHによつて約11に調整）によつてカリ
ジノゲナーゼを溶出する。溶出液を約75％硫安飽
和にし、沈澱物を回収する。沈澱物を水に溶解
後、PH7.5の0.1Mリン酸塩緩衝液に対して透析・
脱塩をおこない濃縮液を得た。

得られた濃縮液に、セフアデツクスＧ−100を、
生理食塩液に懸濁して膨潤させた後、溶媒を
0.05Mリン酸緩衝液（PH7.0）に置換し、さらに
膨潤させ、カラム（2.5×90cm）に充填し、同緩
衝液で一夜平衡化したカラムによつてゲル濾過
し、カリジノゲナーゼ画分を回収した。

QAE−セフアデツクスＡ−50を、0.5N水酸化
トリウム水溶液、精製水、0.5N塩酸溶液中で交
互に数回洗い、最後に精製水で洗滌液が中性附近
になるまで洗滌した。次に、0.05Mリン酸緩衝液
（PH7.0）で平衡化した後、カラム（2.5×90cm）
に充填し一夜同緩衝液で平衡化した。前記カリジ
ノゲナーゼ画分を２回に分けてこのカラムに添加
した。溶出は、０〜0.5Mの食塩水溶液の濃度勾
配により行つた。この結果、カリジノゲナーゼは
0.3M附近で溶出された。

この有効分画を、濃縮後、セフアデツクスＧ−
100（十分量の水によつて洗浄した2.5×90cmカラ
ム）をもちいてゲル濾過脱塩を行い、カリジノゲ
ナーゼ活性分画を回収し、凍結乾燥をおこない最
終精製標品とした。この標品の比活性は、
20KU／A280であり、尿からの回収率は50％であ
つた。

実施例２実施例１のQAE−セフアデツクス処理後のカ
リジノゲナーゼ有効画分を精製水に対して一夜透
析した後、0.05Mリン酸緩衝液（PH7.0）で平衡
化したDEAE−セルロースカラム（5.0×70cm）
に充填し、吸着を行つた。溶出は０〜0.5Mの食
塩水溶液の濃度勾配により行い、カリジノゲナー
ゼ活性画分を分取した。このものを精製水に対し
て一夜透析後、除菌濾過をなし、凍結乾燥をおこ
ない最終精製標品とした。この標品の比活性は、
30KU／A280であつた。

実施例３実施例１のカリジノゲナーゼ濃縮における上清
と接触されるコロイド性含水ケイ酸アルミニウム
の代りに、カラムライト（富士化学株式会社・硅
酸アルミン酸マグネシウム〕を使用する以外は実
施例１を繰り返しほぼ同様の結果をえた。

実施例４実施例２のQAE−セフアデツクス処理後のカ
リジノゲナーゼ有効画分の精製水に対しての透析
に先だつて60℃、10時間の加熱処理を施すこと以
外は実施例２と繰り返しほぼ同様の結果を得た。

Claims

【特許請求の範囲】

１人尿とコロイド性含水ケイ酸アルミニウムと
をPH5.5〜９において接触させ、カリジノゲナー
ゼ以外の生理活性物質の大部分を吸着させ、上清
とケイ素を含む吸着剤とをPH3.0〜5.2において接
触させカリジノゲナーゼを吸着させ、吸着したカ
リジノゲナーゼを溶離することを特徴とする人尿
中のカリジノゲナーゼの濃縮方法。