JPS637348B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は液体そして特には（しかし限定的では
なく）生物学的液体たとえば血清または尿を分析
して抗原、抗体および抗原抗体複合体の存在を確
かめる分析に関する。本明細書では『Ag』、
『Ab』および『Ab：Ag』という符号で各各『抗
原』（抗体によつて結合されるハプテン等の物質
または同様な結合性たん白質を含む）、『抗体』
（同様な結合性たん白質を含む）および『抗原抗
体複合体』を表わす。

良く知られているように液体とくに生物学的液
体を分析してAb，AgまたはAb：Agの存在を調
べることは重要である。たとえば多くの疾病が循
環系中のAb：Agの存在によつて特徴付けられて
おり、それらの探知と特定とが疾病の診断におい
て価値ある情報を提供することができる。Ag，
AbおよびAb：Agの探知と定量とのための、そ
して特に存在するAgの性質および量を測定する
ための、技術はいくつか知られている。これらの
定量技術は免疫分析法と呼ばれている。

免疫学会誌（Journal of Immunology）第84
巻（1959）第514頁においてLieberman等は種種
の材料から誘導された抗原性材料を注射すること
によつてマウスの腹膜中にたまつた腹水の性質を
示している。彼らは腹水が高収量たとえば１匹当
り12〜15ml量で得られ、しかも各種の保護性およ
び凝集性抗体、生活性白血球およびガンマグロブ
リンを含んでいることを見出した。その凝集性抗
体はマウスに各種バクテリアを注射することによ
つて形成され、こうして腹水中に、形成された抗
体はその形成を起させるような特定のバクテリア
性抗原を凝集させることができる。本発明者等は
研究の結果、意外にもマウスの腹水はAb：Agと
は結合するが遊離のAbまたはAgとは結合しない
という特性をもち従つて免疫分析において非常に
有用な試剤であることを見出した。またそれは重
合したIgG3とは反応しないが、熱集合とかラテ
ツクス結合とかその他の方法で変性されると各種
の免疫グロブリンを凝集させることがわかつた。
これらの性質は前記腹水中に前記の抗体、白血球
またはガンマグロブリンのいずれでもない、名付
けて『活性フラクシヨヨン』が存在することによ
る。

本発明はかくして試料に他の試剤を加える前ま
たは加えた後にマウス腹水の活性フラクシヨンを
加えて試料中に存在するまたは生成されるAb：
Agと結合させる工程を含む、液体試料中のAb，
AgまたはAb：Agの分析方法を提供するもので
ある。

本発明で使用する腹水活性フラクシヨンはオイ
グロブリンである。その特性のあるものについて
は、人間のClqとよく似ている点がある。たとえ
ばAb：Agとは結合するが遊離のAbまたはAgと
は結合しない点、沈降定数が10Sである点、IgG
およびIgMとは選択的に結合するがIgAとはしな
い点、IgGまたはIgMで被覆したラテツクス粒子
を凝集させる点、および人間のClqが取付く部分
と同一の部分のIgGのFc鎖に取付く点等である。
しかし他の点では前記腹水活性フラクシヨンは人
間のClqとは全く異なる性質をもつている。たと
えば高PH値において、たとえば８より高いそして
特には9.2より高いPH値においても活性を持続す
る（このようなPH値においては人間のClqは不活
性である）点、およびその活性が0.1Mプトレツ
シンまたは0.1Mヒドラジンによつて破壊されな
い点等である。またClqとは異なり、腹水活性フ
ラクシヨンは電気泳動によつて各各pI5.6および
6.5をもつ２個の相αおよびβ₂に分離する。

腹水活性フラクシヨンは当該技術分野において
通常使われる分離技術たとえば人間の血清から人
間のClqを得る方法に似た方法によつて得ること
ができる。すなわちたとえば人間のIgGを（グル
タルアルデヒドによつて）カツプリングしたアミ
ノ化アガロースのクロマトグラフカラムにマウス
腹水液を通すことによつて、腹水活性フラクシヨ
ンは吸着される。このフラクシヨンは1M塩化ナ
トリウム溶液で溶離することができる。溶離液か
ら塩化ナトリウムを除くために透析にかけ、最後
に活性フラクシヨンはGBS（0.1Mグリシン―HCl
緩衝液、PH9.2）中に取出される。

マウス腹水の活性画分が人間のClqに似ている
限り、それは人間のClqと同様に分析中で使用で
きる。分析における人間のClqの使用は英国特許
第1508133号明細書に記載されており、詳しくは
該明細書を参照されたい。

分析において人間のClqを使う代りにマウス腹
水活性フラクシヨンを使うことの重要な利点は、
活性フラクシヨンを分離せずにマウス腹水全体を
使えるという点である。分離は必須ではなく、ま
た通常の場合不必要なのである。一方人間のClq
を試剤として使う分析のほとんどにおいては人間
の血清全体を使うことは不可能であり、Clqを分
離して使わねばならない。このような分離工程が
除かれることは非常に有利である。また、マウス
腹水は分離した人間のClqと比べて遥かに入手し
易く、従つてより経済的な試剤である。もう１つ
の利点は腹水の反応は人間のClqが干渉できない
ようなPH値9.2という条件下で行うことができる
点である。さらにもう１つの（人間のClqと比べ
ての）腹水の利点は、人間の血しよう中に存在す
るDNA、エンドトキシンまたはヘパリンのよう
な潜在干渉物質と反応しない点である。

マウス腹水活性フラクシヨンはその性質の多く
において、米国特許第4162895号明細書に免疫分
析に使うことが記載されているマウス血清フラク
シヨンに似ている。しかしマウス腹水活性フラク
シヨンとマウス血清フラクシヨンとは同じではな
い。たとえば電気泳動において両者は２要素の濃
度が互いに相異なる。腹水活性フラクシヨンは免
疫分析においてマウス血清フラクシヨンと同様に
使うことができ、その意味で前記米国特許明細書
が参照されるべきである。マウス血清の代りにマ
ウス腹水を使うことの特別なそして重要な利点
は、腹水の方が遥かに容易に手に入る点である。
マウス血清はマウス１匹から１度に１mlしかとれ
ないのに対して、マウス腹水は15〜20mlもとれ、
しかも驚くべきことに腹水のポテンシヤルは（活
性フラクシヨンに関する限り）血清のそれに非常
に近いのである。

本発明の好ましい分析方法の中には次のような
ものがある。

(1) 液体中のAgまたはAbを分析する方法で、そ
れは (a) 液体中の分析下で、それぞれAbまたはAg
に対して特異的なAgまたはAbを、それらに
より、Ab：Agを形成するように液体に加え
る工程、 (b) 工程(a)からの混合物に既知量の分析すべき
AbまたはAg（その量は同定ラベルをもつも
のとする）を加える工程、 (c) 工程(b)で作られる混合物中のすべての
Ab：Agと少くとも結合するに足る量で前記
活性フラクシヨンを工程(b)で作られる混合物
に加える工程、 (d) 混合物中に遊離して残つているまたは前記
活性フラクシヨンに結合したラベル付きの
AbまたはAgの量を測定する工程。

とから成るものである。

この同定ラベルは、例えば酵素または補酵素
の活性がAb：Agまたはラベル付きのAb：Ag
が前記活性フラクシヨンに結合する際に阻止さ
れ、そして遊離のラベル付きAbまたはAgの量
が活性フラクシヨンに結合しているAb：Agを
先ず除くことなしに混合物の酵素または補酵素
の活性を測ることによつて定量されるそのよう
な酵素たは補酵素であることができる。適当な
このような酵素はカタラーゼとアミラーゼであ
る。

この替りとして上記方法(1)において、活性フ
ラクシヨンに結合したAb：Agを混合物から除
去し、そして次に混合物中に残存するラベル付
きのAgまたはAbの量を測定する。

(2) 液体中のAb：Agの存在または不存在を定量
する方法であるがそれは、その液体に前記の活
性フラクシヨンとAb：Agに結合していない活
性フラクシヨンのいずれかに接触して凝集を起
こす物質を加えることおよびその物質の凝集が
起きたかどうかを検出することから成る方法で
ある。好ましくはその物質は免疫グロブリン
（IgGまたはIgM）の被覆をもつラテツクスの
ような不活性担体粒子から成るものである。

(3) 液体中の特殊なAbまたはAgの存在を検出す
る方法であるが、それはその存在を定量すべき
特殊なAbまたはAgに対して特異的なAgまた
はAbを、存在するこの特殊なAbまたはAgの
いずれかとAb：Agを作るようにその液体に加
えること、そして上記の方法(2)によつてこのよ
うなAb：Agの存否を定量することから成る方
法である。

(4) Ab：Ag複合体を定量する液体の分析方法で
あるが、それはAb：Ag複合体に接触した際お
よび前記の活性フラクシヨンに接触した際に凝
集することができる粒子であるところのIgGま
たはIgMで被覆された不活性粒子の既知量をそ
の液体に加えることと、そしてまたその活性フ
ラクシヨンのある量をも液体に加え、こうして
作られる混合物をインキユベイシヨンするこ
と、凝集しなかつた粒子の数を計数することお
よびそれによつてその液体中の複合体の量を計
算することから成る方法である。

液体中のAb：Agは定量されるべきAbまた
はAgを含む液体に、Ab：Agを含む液体を作
るようにそれぞれAgまたはAbを加えることに
よつて作ることができたものであり、分析下に
あるAbまたはAgの量は複合体の計算された量
から導かれる。

(5) 液体中のAgを分析する方法であるが、それ
はこのAgに対するAbを被覆した不活性担体粒
子の既知量を液体に加えること、そしてこの粒
子はAgと接触した際および前記活性フラクシ
ヨンと接触した際に凝集することができるもの
であり、そしてまた液体にはある量の活性フラ
クシヨンも加え、そしてこうして作られる混合
物をインキユベイシヨンし、凝集しなかつた粒
子の数を計数し、そしてそれによつて試料中の
Agの量を計算することから成る方法である。

(6) 液体中のAbを分析する方法であるが、それ
はAbに対するAgを被覆した不活性担体の既知
量を液体に加え、この粒子はAbと接触した際
および前記活性フラクシヨンと接触した際に凝
集することができるものであり、こうして作ら
れた混合物をインキユベイシヨンし、そして凝
集しなかつた粒子の数を計数し、そしてそれに
よつて試料中のAbの量を計算することから成
る方法である。

(5)および(6)の両方法においては、この不活性担
体粒子は好ましくはラテツクス粒子であり、その
寸法は約0.8〜1.1ミクロンであることが好まし
い。

人のClqを用いる人の血清試料の分析では、そ
の血清自体が人の補体Clを含むものである事実を
考慮に入れなければならない。添加された試剤と
して人のClqを用いる血清の分析においては、生
成するClqからの妨害を避けるように、血清は先
ず生来のClqを不活性化するように処理されなけ
ればならない。このため１つの技術は血清を約56
℃に加熱し、そしてそれを約30分間その温度に保
つことである。しかしこの処理は血清中の生来の
Clqを不活性化する一方で、続いて行う分析の精
度を低下させるという血清に対する他の作用をも
もつている。

本発明による試剤としてマウスの腹水（または
それの分離された活性フラクシヨン）を使うこと
によつて、人の血清を分析する際のこの加熱工程
の必要性を例えば9.2のような高いPHで分析を行
うことによつて避けることができる。高いPH値で
は、分析される血清中のどんな人の血清のClqも
不活性であるのに、マウスの腹水の活性は残る。
この替りとして0.1Mヒドラジンまたは0.1Mプト
レシンの存在下で分析を行うことができる。この
条件下では人のClqは不活性であるが、しかしマ
ウスの腹水はそうではない。このようにしてマウ
スの腹水のこれらの性質が生来のClqからの妨害
を避けることを可能にする。すなわちマウスの腹
水は、患者の血清からの補体によつてラテツクス
粒子の凝集の妨害を除くに足るPHとイオン強度に
おいて、人のIgGでコーチングされた粒子を凝集
させることができるのである。

これは人の血清の分析においてマウスの腹水
（またはその活性フラクシヨン）を使う非常に有
利な特徴であることが評価されるであろう。

本発明の方法は当業界で知られている連続流れ
式技法によつて有利に行うことができる。連続流
れ式分析においては、マウスの腹水は人のClqよ
りも試剤として、より便宜に使うことができる
が、それは人のリウマトイド因子に対するマニホ
ルド系やインキユベイシヨン系が、マウスの腹水
使用にも適するが、人のClqの使用には適さない
からである。

TungらがJournal of Immunology，Vol.116
（1976），p.676に書いているように、完全なフロ
インド（Freund）補助液を弱く腹腔内に注射す
ることによつて腹水を得るのがよいと思われる。
この技法を使つて、１匹のマウスから３〜７日毎
に腹水10〜20mlを繰返して集めることが可能であ
る。

例 １ マウスの腹水は、その腹水の活性フラクシヨン
が熱集合化IgGと優先的に反応し、IgG被覆ラテ
ツクス粒子の凝集および熱集合化IgGの凝集を起
こす。

そこで、マウスの腹水の一定量をIgG被覆ラテツ
クス（ラテツクス―IgG）粒子と混合すれば粒子
の集合が起こる。ここで熱集合化IgGを加えれ
ば、腹水からの活性フラクシヨンは、ラテツクス
の集合が結局残らなくなるまで熱集合化IgGの凝
集に吸収される。腹水の活性はラテツクスの集合
を妨げるのに必要な熱集合化IgGの量で表現する
ことができる。同様に、人間の血清の活性はラテ
ツクスIgGの凝集を同程度に妨げるのに必要であ
る熱集合化IgGの量で表現することができる。健
康な血液供給者50体からの血清について試験を行
なつたところ、前記活性は熱集合化IgG当量
（EHAIgG）たかだか30μｇ／mlであつた。

多発性硬化症患者（75体）および甲状腺障害患
者（58体）からの人間の血清の活性も測定した。
多発性硬化症の患者の中では30％が27μｇ／ml
（EHAIgG）以上の血清活性をもち、甲状腺障害
患者の中では65.5％が27μｇ／ml（EHAIgG）以
上の血清活性をもつていた。このことから、高い
活性値は免疫複合体（これらは健康体中には存在
しないかまたは単に低レベルで存在する）が血清
中に存在することを示していると理解できよう。

腹水は他のものと比べ、何種かの免疫複合体に
対し大きなアビジチーをもつている。RFも同様
に免疫複合体に対し一様でないアビジチーをもつ
ている。従つて人間に血清について免疫複合体の
存在を試験する際は、マウス腹水試験およびRF
試験の両者を平行して行なうことが撰賞される。
RFの使用に関する情報については英国特許出願
21619／75を参照されたい。

例 ２ (1) 全マウス腹水の調製 全腹水は前記の方法によりNMR1マウスから
得られる。これをGBS（0.17M・NaC_lを含み、PH
9.2の0.1Mグリシン―HCl緩衝液）中に希釈する。
希釈範囲は1/50〜1/80である。

(2) 分析前の患者の血清の調製 血清50μ容量を50mM・EDTA（PH9.2）含有
GBS170μに加え、続いて37℃で15分間ジチオ
トレイツト（5μｇ／ml）15μを使つて還元す
る。次に試料を0.2％H₂O₂15μによつて再酸化
してジチオトレイツトを分解する。血清試料の前
記還元の目的は阻害工程を妨害する可能性のある
凝集素を全て除去するためのものである。マウス
の腹水の凝集素を分解する可能性のある残存ジチ
オトレイツトを不活性化するために前記の再酸化
が必要となる。前記の処理が血清中の内因性Clq
を限られた程度にしても不活性化してしまうとは
いつても、その主目的は他の凝集素例えばRFを
不活性化することにある点に注意されたい。

Clqの完全不活性化はPH9.2で分析を行なうこと
によつて達成される。これらの前処理により、血
清は５倍に希釈される。

(3) ラテツクスの調製 Dow Chemical社（米国、インデイアナポリ
ス）のポリスチレン粒子（0.794μ）を以下のよう
にして人間のIgGで被覆する。５倍に希釈された
GBS400μに、IgGの１％（ｗ／ｖ）溶液25μ、
人間の血清アルブミンの１％（ｗ／ｖ）溶液（西
独マールブルクのBehringwerke社）150μおよ
び続いて10％（ｗ／ｖ）ラテツクス懸濁液50μ
を加える。数秒間渦でかきまぜ、45分間室温でイ
ンキユベイシヨンしてから、懸濁液を５分間
10000回／分で遠心分離し、粒子を希GBS1mlで
１回洗い、最後に１％（ｗ／ｖ）の牛の血清アル
ブミンを含むGBS10ml中に再懸濁させる。

(4) 自動分析 同容量（50μ）の前記血清試料、希釈したマ
ウスの腹水およびラテツクス懸濁液を共にマニホ
ルドにアスピレートする。10分間インキユベイシ
ヨンする。インキユベイシヨン後、0.1％
Tween20を含有するGBSで混合物を自動的に
2000倍に希釈し、非凝集ラテツクス粒子を低およ
び高限界値によりTechnicon光学セルカウンター
（Auto counter）中で計数する。この実験では最
大計数を4000粒子／秒に制限するためにラテツク
ス懸濁液を2000倍に希釈することが必要である。

(5) 結果 マウスの腹水の連続２倍希釈は第１図に示した
凝集曲線を与える。縦軸は記録計での最高の高度
を表わす。その高度は遊離（非凝集）粒子の数と
正比例している。ラテツクスは粒子当りIgG約
16000分子を含む。

標準曲線（第２図）はGBS中の熱集合化IgGの
濃度範囲で決定される。その結果は熱重合した人
間のIgGの当量をμｇ／mlで示してある。熱集合
した人間のIgGは人間の血清プールからDEAEセ
ルロース・クロマトグラフイ処理により調製し、
63℃で30分間加熱することによつて重合化したも
のである。

第３図は健康体血液供給者、全身系紅斑性狼瘡
（SLE）患者、ライ患者、変形関節炎患者、クロ
ーン病患者および乳ガン患者の血清によるマウス
の血清の阻害の結果を表わすものである。正常値
の上限は熱集合化IgG当量約30μｇ／mlである。

本発明方法は人間由来の液体の生体外分析例え
ば病気の診断に特に有用である。また多方面の産
業的応用例えば血液銀行における血液中の異常検
出にも有用である。

【図面の簡単な説明】

第１図はマウスの腹水の連続２倍希釈における
凝集曲線を示す線図である。第２図はGBS中の
熱集合IgGの濃度範囲によつて決定する標準曲線
を示す線図である。第３図は人間の各種血清によ
るマウスの血清阻害の結果を示す分布図である。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 試料に他の試剤を加える前または加えた後に
   マウスからの腹水の活性フラクシヨンを加え試料
   中に存在するかまたは生成されるAb：Ag（抗
   体：抗原複合体）と結合させる工程を含むことを
   特徴とする、液体試料中のAb（抗体）、Ag（抗原）
   またはAb：Agの分析法。 ２ 前記活性フラクシヨンを全腹水の形で加える
   前項１に記載の方法。 ３ その存在を決定すべき特定のAbまたはAgに
   対して特異的なAgまたはAbを液体試料に加え
   て、存在する前記特定AbまたはAgのいずれかと
   Ab：Agを形成させ、前記Ab：Agの存在または
   不存在を決定することから成る、液体試料中の特
   定AbまたはAgの存在を検査する前項１に記載の
   方法。 ４ 分析対象であるAbに対するAbで被覆されて
   おり、該Abと接触しそして前記活性フラクシヨ
   ンと接触すると凝集することのできる不活性担体
   粒子の既知量を液体試料に加え、そして前記活性
   フラクシヨンの一定量も前記液体試料に加え、こ
   うして形成される混合物をインキユベイシヨン
   し、凝集しない粒子の数を計数し、その計数によ
   つて液体試料中のAb量を計量することから成る、
   Abを分析する前項１に記載の方法。 ５ 前記液体試料が人間由来の生物学的流体であ
   る前項１に記載の方法。 ６ 前記活性フラクシヨンを0.1Mプトレツシン
   または0.1Mヒドラジンの存在下でAb：Agと結
   合させる前項１に記載の方法。 ７ 基本的に連続流で行なう前項１に記載の方
   法。 ８ Ab：Agと結合していない前記活性フラクシ
   ヨンがあればそれと接触して凝集を起こす材料を
   液体試料中に加え、前記材料の凝集が起こるか起
   こらないかを検査することから成る、液体試料中
   のAb：Agの存在または不存在を決定する前項１
   に記載の方法。 ９ 前記材料として不活性担体粒子上にIgGまた
   はIgM被覆を施したものを使う、前項８に記載の
   方法。 １０ 前記粒子としてラテツクス粒子を使う、前
   項９に記載の方法。 １１ 前記粒子として寸法が約0.8―1.1ミクロン
   であるものを使う、前項１０に記載の方法。 １２ Ab：Ag複合体と接触しそして前記活性フ
   ラクシヨンと接触すると凝集することができ、
   IgGまたはIgMで被覆された不活性担体粒子の既
   知量を液体試料に加え、そして前記活性フラクシ
   ヨンの一定量も前記液体試料に加え、こうして形
   成される混合物をインキユベイシヨンし、凝集し
   ない粒子の数を計数し、そしてその計数によつて
   液体中の複合体の量を計算することから成る、
   Ab：Abを分析する前項１に記載の方法。 １３ 分析対象であるAbまたはAgを含む液体試
   料にそれぞれAgまたはAbを加えてAb：Ag含有
   液体を形成することによつて液体試料中のAb：
   Agを形成し、そして分析下のAbまたはAgの量
   を複合体の前記計算量から導く前項１２に記載の
   方法。 １４ 前記不活性担体粒子としてラテツクス粒子
   を使う、前項１２に記載の方法。 １５ 粒子として寸法が約0.8〜1.1ミクロンであ
   るものを使う前項１４に記載の方法。 １６ 分析対象であるAgに対するAbで被覆され
   ており、該Agと接触しそして前記活性フラクシ
   ヨンと接触すると凝集することのできる不活性担
   体粒子の既知量を液体試料に加え、そして前記活
   性フラクシヨンの一定量も前記液体試料に加え、
   こうして形成される混合物をインキユベイシヨン
   し、凝集しない粒子の数を計数し、その計数によ
   つて試料中のAg量を計算することから成る、Ag
   を分析する前項１に記載の方法。 １７ 前記不活性粒子としてラテツクス粒子を使
   う前項１６に記載の方法。 １８ 前記活性フラクシヨンをPH少くとも８で
   Ab：Agと結合させる前項１に記載の方法。 １９ PHが少くとも9.2で結合させる前項１８に
   記載の方法。