JPS64930B2 - - Google Patents
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Description
本発明は、百日ぜき菌の感染防御抗原HA画分
（Ｆ―HA：Filamentous Hemagglutininおよび
LPF―HA：Leucocytosis―Promoting Faotr
Hemagglutininを含んだ画分）の製造方法、さら
に詳しくは、百日ぜき菌をシクロデキストリンま
たはその誘導体を添加した液状倍地にて通気撹拌
培養するに際し、培養温度および溶存酸素量を特
定範囲に制御しかつ消泡条件下で行なうことによ
り百日ぜき菌の感染防御抗原HA画分を大量に製
造する方法に関する。 産業上の利用分野 百日ぜきは我が国では屈出伝染病に指定されて
おり、乳児〜幼児に多発する公衆衛生上重要な感
染症である。とくに乳児では重症経過をたどるこ
とが多く、時には死亡例もみられる。この疾病は
古くからワクチンによる予防が効果的であること
が知られており、原因菌である百日ぜき菌相菌
の全菌体の不活性ワクチンが広く用いられてい
た。しかし、このような菌体不活化ワクチンは副
作用が強く、そのため一時期にはワクチンの接種
が中止されていた。その一方、百日ぜきによる乳
幼児の疾病は大きな問題となつており、副作用の
ないワクチンの製造が熱望されていた。 従来技術 先に、佐藤らは感染防御抗原に関する基礎的研
究をもとにして画期的なコンポーネントワクチン
である沈降百日ぜき精製ワクチンの製造に成功し
た（特公昭57−5203号を参照）。このワクチンは
Ｆ―HAおよびLPF―HAを含んだHA画分を主
な感染防御抗原とし、副作用をほとんど示すこと
がなく優れた予防効果を有するものであつてすで
に実用化されている。 この実用化されているワクチンの製造には、百
日ぜき相菌を適当な培地に接種し、35℃前後で
５日間静置培養し、培養液を遠心し、その上清に
硫酸アンモニウムを約50％飽和になるように加え
るかアルコール添加し、生じた沈殿を1000rpm、
30分間遠心して分離し、この沈殿を塩化ナトリウ
ム添加緩衝液にて抽出し、その抽出画分を常法に
よりシヨ糖密度勾配遠心にかけて百日ぜきHA画
分を回収し、ホルマリンで無毒化処理してワクチ
ンとしており、所望によりこれにジフテリアトキ
ソイド、破傷風トキイソドを加え、さらに必要に
よりアルミニウムアジユバンド処理し、ゼラチ
ン、グルコースなどの安定剤を添加して沈降精製
百日ぜき・ジフテリア・破傷風混合ワクチンとし
ている。 しかしながら、この方法ではとくに培養に難点
があり、大規模な培養が不可能でワクチンの量産
が困難である。すなわち、この公知の沈降百日ぜ
き精製ワクチンの製造法では、ルー瓶などの小容
器の液状培地を100〜300ml程度入れて横臥位置で
35℃前後にて５日間静置培養するもので、きわめ
て小規模でかつ長期間を要する。一般に微生物の
大量培養には液状倍地による撹拌培養方式が採用
されることが多い。百日ぜき菌は液状倍地による
振盪培養を行なうと菌自身の増殖はある程度まで
は達成されるが、たとえばＦ―HA画分の産生は
きわめて低いといわれている（Arai，Ｈ ＆
Munoz，J.J.，Infect.Immun.25764―767，，1976
を参照）。このことは精製ワクチンの構成成分の
少なくとも一方は量産し難いことを示唆するもの
である。したがつて、この佐藤らの百日ぜきワク
チンは画期的なワクチンであるがその製造には小
規模で長時間を要する静置培養に頼らざるを得
ず、製造の改良が熱望されている。 最近、鈴木らは百日ぜき相菌の増殖を促進し
かつLPR―HAの産生を促進しうる添加物の検索
を試み、シクロデキストリンおよびその誘導体、
とくにメチル化β―シクロデキストリン（２，６
―ジ（Ｏ―メチル）―β―シクロデキストリン、
以下メチル化β―CDと略称する）の添加が百日
ぜき相菌のステイナーシヨルテ液状倍地
（Stainer，D.W.＆Scholte，M.J.；J.Gen.
Microbiol.63，211―220，1971を参照）を用いた
撹拌培養における菌増殖およびLPF―HA産生を
促進すること、さらに培養液中でのLPF―HAの
安定性にも寄与することを報告している（鈴木
ら、第29回毒素シンポジウム予稿集、１〜５、
1982を参照）。 しかしながら、かかる方法を10あるいはそれ
以上のスケールの発酵槽を用いる工業的規模の百
日ぜき菌の感染防御抗原の製造に適用した場合に
は、従来の撹拌培養にもとづく知見からは全く類
推できない結果が得られた。すなわち、撹拌条件
を一定とする振盪培養が撹拌培養系では菌数の増
加は知られる場合もあるが、LPF―HAの産出量
は充分でないことを知つたのである。 また、WHOの1977年刊行の資料（Manual
for the production and control of vaccine、
Pertussis vaccine、WHOを参照）によれば、百
日ぜきワクチンの製造に関して発酵槽を用いた百
日ぜき菌の大量培養について記載されており、空
気を上方からの表面通気によりあるいはグリツド
を通して培地中に入れ、特殊な羽根で撹拌して培
養液内に巻込む方式で、一定の通気撹拌によつて
百日ぜき菌菌体を得ることができるとしている。
しかしながら、本発明者らは、ステイナー・シヨ
ルテ培地あるいは後述のその改良培地10の培養
規模においてWHOの記述に準じ、槽底からの通
気量を0.2VVM（空気流量（）／培地容量
（）／時間（分））、羽根の回転数を500あるいは
600rpmの一定とし、いわゆる槽底からの一定通
気撹拌培養系について検討を加えたところ、菌数
の増加は期待できるが、百日ぜき菌HA画分の産
生は不充分であり、到底、精製百日ぜきワクチン
の工業的生産には適さないことを知つた。 そこで、本発明者らは、大規模な培養装置、と
くに通常の醗酵槽を用いた通気撹拌培養において
も菌の増殖とともに所望のHA画分の大量生産に
適した培養条件を見い出すべく種々研究を重ねた
結果、ある範囲の培養温度において溶存酸素量
（以下、DOと略記することがある）を特定の範
囲に制御しかつ消泡処理をしながら、さらに望ま
しくは、PHの制御条件下に培養することにより、
大規模な培養、とくに通常の醗酵槽を用いた通気
撹拌培養においても、百日ぜき菌の著しい増殖と
ともに、百日ぜき菌HA画分を著しく増大しうる
ことを見い出し、本発明を完成するに至つた。 発明の構成および効果 本発明によれば、百日ぜき菌をシクロデキスト
リンまたはその誘導体を添加した液状倍地に接種
し、消泡処理しながら、培養温度20〜37℃におい
て溶存酸素量を0.7〜6.0ppmの範囲に保ち、さら
に望ましくはPHをたとえば6.0〜9.0にて通気撹拌
培養し、対数増殖期ないし定常期の菌発育段階で
感染防御抗原HA画分を採取することにより、所
望の百日ぜき菌の感染防御抗原HA画分を工業的
規模にて量産される。 本発明で用いられる百日ぜき菌株としては、通
常ワクチン株として知られているものであればい
ずれでもよく、一般にその相菌のボルデ・ジヤ
ング培地継代菌あるいは振盪培養菌が用いられ、
これを種菌として液状倍地に接種する。なお、百
日ぜき菌相菌も適用することができる。接種量
はとくに限定されないが、通常、最終濃度が0.2
〜10IOU／ml（IOU：International opacity
unit，生物学的製剤基準、238，1979、厚生省を
参照）、好ましくは約1.0IOU／mlとなる程度であ
る。 液状倍地としては公知のいずれの培地も用いら
れるが、好ましくはステイナー・シヨルテ培地、
とくに好ましくか該ステイナー・シヨルテ培地を
基本とし、これがカザミノ酸を0.1〜20ｇ／添
加し、アスコルビン酸を0.01〜１ｇ／、グルタ
チオンを0.1〜５ｇ／の範囲に調整したステイ
ナー・シヨルテ改良培地（以下、単に改良培地と
いう）が用あられる。 培地に添加されるシクロデキストリンまたはそ
の誘導体としては、前記メチル化β―CDのほか、
メチル化α―シクロデキストリン、メチル化γ―
シクロデキストリンなどのエーテル誘導体、α―
シクロデキストリン、β―シクロデキストリンお
よびγ―シクロデキストリンなどの異性体のほか
アミノ化誘導体やエステル化誘導体などが挙げら
れ、それらは単独でまたは２種以上を併用して用
いられる。これらのうち、メチル化β―CDがも
つとも良好な添加効果を示す。その添加量はとく
に限定されないが、通常、0.001〜５ｇ／、好
ましくは約0.5〜2.5ｇ／である。 本発明者らは百日ぜき菌の大規模培養における
菌増殖、Ｆ―HAおよびLPF―HA産生量の増大
には培養温度ならびにDOの制御が大きな要因と
なることを初めて認め、かつ消泡操作の有無さら
に培地のPHの制御も大きく影響することを明らか
にした。これらの成績について以下説明する。 培養温度については、百日ぜき菌相菌東浜株
をボルデ・ジヤング培地で継代したものを種菌と
し、メチル化β―CD1.0ｇ／を添加した改良培
地10mlに0.2IOU／mlになるように接種し、温度
勾配培養装置TN112D（東洋科学産業製）を用い、
培養温度を17℃から42℃の範囲で振盪培養60回／
分にて48時間振盪培養して至適範囲を調べた。増
殖した菌数は光電比色計コールマンジユニア6D
型（コールマン社製）を用い、OD650における
測定値から換算して求めた。なお、この実験は実
験室的小規模にて振盪培養で行なつたが、培養温
度に関しては大規模な通気撹拌培養でも同傾向を
示す。 その結果を第１図に示したが、菌の増殖は20〜
37℃の範囲が望ましく、より好ましくは23〜37℃
であつた。 培地の溶存酸素量（DO）は0.7〜6.0ppm、好
ましくは1.0〜5.5ppmの範囲に保持される。この
範囲内に制御することにより、百日ぜき菌の増殖
が増大するとともに、所望のLPF―HAおよびＦ
―HAの産生も著しく増大する。 なお、DO制御には通気量と撹拌速度の制御を
組合せて行なうのがもつともよく、通気量を撹拌
速度はとくに限定されないが、通常の通気撹拌槽
を用いた場合には、空気の通気量は3VVM以下、
通常0.1〜2VVM、好ましくは0.1〜1.5VVMの範
囲であり、撹拌速度は600rpm以下、通常50〜
350rpm、好ましくは100〜250rpmの範囲である。
ただし、純酸素を併用する場合は通気量あるいは
撹拌速度は減ずることができる。 また、消泡操作の有無によつても培養液中の菌
数増加およびＦ―HA、LPF―HA量の収率が大
きく影響され、後述の実施例１と同様の実験条件
で培養した場合、消泡を行わないときには泡に付
着した菌体がそのまま槽壁に累積されたり、排気
ノズルから流出されたりして培養液中の菌数、Ｆ
―HAおよびLPF―HA量ともに数〜80％程度の
減弱が認められた。なお、消泡は機械的消泡と化
学的消泡剤のいずれも適用され、例えば回転デイ
スク式、スプレーノズル方式などの公知の消泡用
装置を用いるか、あるいは通常の脂肪酸エステル
系、シリコン系、アルコール系などの化学的消泡
剤を用いることができる。なお、培養液からの
HA画分の採取、精製等の点からは機械的消泡手
段を用いるのがより好ましい。 培地PHの至適範囲を知るため、PHを種々に変え
て菌の増殖を調べた。DOを2.5ppmと一定にした
以外は後述の実施例１と同様の実験条件で培養し
た。PH6.0〜9.0の範囲ではいずれも菌増殖は達せ
られ、PH6.5〜8.5、とくにPH6.8〜7.5の範囲では
菌増殖速度が若干増大することが認められた。 本発明による培養温度、溶存酸素量さらには消
泡、PHなどの制御は自動制御および手動制御のい
ずれも採用される。 また、目的とするHA画分を高収率で得るには
菌の培養状態のチエツクが重要であり、対数増殖
期から転換期を経て定常期に至るまでの菌発育段
階において採取するのがもつとも望ましく、それ
は接種菌によつて変るが、通常７〜40時間に相当
し、例えば、1.0IOU／mlの接種菌量の場合には
通常24〜35時間である。 実施例 つぎに実施例を挙げて本発明をさらに具体的に
説明するが本発明はこれらに限定されない。 実施例 １ 50の醗酵槽（丸菱理化(株)製）に、下記第１表
に示す組成を有する改良培地にメチル化β―CD
を終濃度1.0ｇ／になるように添加した培地35
を加え、百日ぜき菌相菌を1.0IOU／mlの量
で接種し、スパージヤーによる槽底からの通気撹
拌培養系でDOの制御範囲を種々変え、温度35
℃、PH7.2に制御し、消泡手段として機械的消泡
を用い、それぞれ24時間培養を行なつた。
（Ｆ―HA：Filamentous Hemagglutininおよび
LPF―HA：Leucocytosis―Promoting Faotr
Hemagglutininを含んだ画分）の製造方法、さら
に詳しくは、百日ぜき菌をシクロデキストリンま
たはその誘導体を添加した液状倍地にて通気撹拌
培養するに際し、培養温度および溶存酸素量を特
定範囲に制御しかつ消泡条件下で行なうことによ
り百日ぜき菌の感染防御抗原HA画分を大量に製
造する方法に関する。 産業上の利用分野 百日ぜきは我が国では屈出伝染病に指定されて
おり、乳児〜幼児に多発する公衆衛生上重要な感
染症である。とくに乳児では重症経過をたどるこ
とが多く、時には死亡例もみられる。この疾病は
古くからワクチンによる予防が効果的であること
が知られており、原因菌である百日ぜき菌相菌
の全菌体の不活性ワクチンが広く用いられてい
た。しかし、このような菌体不活化ワクチンは副
作用が強く、そのため一時期にはワクチンの接種
が中止されていた。その一方、百日ぜきによる乳
幼児の疾病は大きな問題となつており、副作用の
ないワクチンの製造が熱望されていた。 従来技術 先に、佐藤らは感染防御抗原に関する基礎的研
究をもとにして画期的なコンポーネントワクチン
である沈降百日ぜき精製ワクチンの製造に成功し
た（特公昭57−5203号を参照）。このワクチンは
Ｆ―HAおよびLPF―HAを含んだHA画分を主
な感染防御抗原とし、副作用をほとんど示すこと
がなく優れた予防効果を有するものであつてすで
に実用化されている。 この実用化されているワクチンの製造には、百
日ぜき相菌を適当な培地に接種し、35℃前後で
５日間静置培養し、培養液を遠心し、その上清に
硫酸アンモニウムを約50％飽和になるように加え
るかアルコール添加し、生じた沈殿を1000rpm、
30分間遠心して分離し、この沈殿を塩化ナトリウ
ム添加緩衝液にて抽出し、その抽出画分を常法に
よりシヨ糖密度勾配遠心にかけて百日ぜきHA画
分を回収し、ホルマリンで無毒化処理してワクチ
ンとしており、所望によりこれにジフテリアトキ
ソイド、破傷風トキイソドを加え、さらに必要に
よりアルミニウムアジユバンド処理し、ゼラチ
ン、グルコースなどの安定剤を添加して沈降精製
百日ぜき・ジフテリア・破傷風混合ワクチンとし
ている。 しかしながら、この方法ではとくに培養に難点
があり、大規模な培養が不可能でワクチンの量産
が困難である。すなわち、この公知の沈降百日ぜ
き精製ワクチンの製造法では、ルー瓶などの小容
器の液状培地を100〜300ml程度入れて横臥位置で
35℃前後にて５日間静置培養するもので、きわめ
て小規模でかつ長期間を要する。一般に微生物の
大量培養には液状倍地による撹拌培養方式が採用
されることが多い。百日ぜき菌は液状倍地による
振盪培養を行なうと菌自身の増殖はある程度まで
は達成されるが、たとえばＦ―HA画分の産生は
きわめて低いといわれている（Arai，Ｈ ＆
Munoz，J.J.，Infect.Immun.25764―767，，1976
を参照）。このことは精製ワクチンの構成成分の
少なくとも一方は量産し難いことを示唆するもの
である。したがつて、この佐藤らの百日ぜきワク
チンは画期的なワクチンであるがその製造には小
規模で長時間を要する静置培養に頼らざるを得
ず、製造の改良が熱望されている。 最近、鈴木らは百日ぜき相菌の増殖を促進し
かつLPR―HAの産生を促進しうる添加物の検索
を試み、シクロデキストリンおよびその誘導体、
とくにメチル化β―シクロデキストリン（２，６
―ジ（Ｏ―メチル）―β―シクロデキストリン、
以下メチル化β―CDと略称する）の添加が百日
ぜき相菌のステイナーシヨルテ液状倍地
（Stainer，D.W.＆Scholte，M.J.；J.Gen.
Microbiol.63，211―220，1971を参照）を用いた
撹拌培養における菌増殖およびLPF―HA産生を
促進すること、さらに培養液中でのLPF―HAの
安定性にも寄与することを報告している（鈴木
ら、第29回毒素シンポジウム予稿集、１〜５、
1982を参照）。 しかしながら、かかる方法を10あるいはそれ
以上のスケールの発酵槽を用いる工業的規模の百
日ぜき菌の感染防御抗原の製造に適用した場合に
は、従来の撹拌培養にもとづく知見からは全く類
推できない結果が得られた。すなわち、撹拌条件
を一定とする振盪培養が撹拌培養系では菌数の増
加は知られる場合もあるが、LPF―HAの産出量
は充分でないことを知つたのである。 また、WHOの1977年刊行の資料（Manual
for the production and control of vaccine、
Pertussis vaccine、WHOを参照）によれば、百
日ぜきワクチンの製造に関して発酵槽を用いた百
日ぜき菌の大量培養について記載されており、空
気を上方からの表面通気によりあるいはグリツド
を通して培地中に入れ、特殊な羽根で撹拌して培
養液内に巻込む方式で、一定の通気撹拌によつて
百日ぜき菌菌体を得ることができるとしている。
しかしながら、本発明者らは、ステイナー・シヨ
ルテ培地あるいは後述のその改良培地10の培養
規模においてWHOの記述に準じ、槽底からの通
気量を0.2VVM（空気流量（）／培地容量
（）／時間（分））、羽根の回転数を500あるいは
600rpmの一定とし、いわゆる槽底からの一定通
気撹拌培養系について検討を加えたところ、菌数
の増加は期待できるが、百日ぜき菌HA画分の産
生は不充分であり、到底、精製百日ぜきワクチン
の工業的生産には適さないことを知つた。 そこで、本発明者らは、大規模な培養装置、と
くに通常の醗酵槽を用いた通気撹拌培養において
も菌の増殖とともに所望のHA画分の大量生産に
適した培養条件を見い出すべく種々研究を重ねた
結果、ある範囲の培養温度において溶存酸素量
（以下、DOと略記することがある）を特定の範
囲に制御しかつ消泡処理をしながら、さらに望ま
しくは、PHの制御条件下に培養することにより、
大規模な培養、とくに通常の醗酵槽を用いた通気
撹拌培養においても、百日ぜき菌の著しい増殖と
ともに、百日ぜき菌HA画分を著しく増大しうる
ことを見い出し、本発明を完成するに至つた。 発明の構成および効果 本発明によれば、百日ぜき菌をシクロデキスト
リンまたはその誘導体を添加した液状倍地に接種
し、消泡処理しながら、培養温度20〜37℃におい
て溶存酸素量を0.7〜6.0ppmの範囲に保ち、さら
に望ましくはPHをたとえば6.0〜9.0にて通気撹拌
培養し、対数増殖期ないし定常期の菌発育段階で
感染防御抗原HA画分を採取することにより、所
望の百日ぜき菌の感染防御抗原HA画分を工業的
規模にて量産される。 本発明で用いられる百日ぜき菌株としては、通
常ワクチン株として知られているものであればい
ずれでもよく、一般にその相菌のボルデ・ジヤ
ング培地継代菌あるいは振盪培養菌が用いられ、
これを種菌として液状倍地に接種する。なお、百
日ぜき菌相菌も適用することができる。接種量
はとくに限定されないが、通常、最終濃度が0.2
〜10IOU／ml（IOU：International opacity
unit，生物学的製剤基準、238，1979、厚生省を
参照）、好ましくは約1.0IOU／mlとなる程度であ
る。 液状倍地としては公知のいずれの培地も用いら
れるが、好ましくはステイナー・シヨルテ培地、
とくに好ましくか該ステイナー・シヨルテ培地を
基本とし、これがカザミノ酸を0.1〜20ｇ／添
加し、アスコルビン酸を0.01〜１ｇ／、グルタ
チオンを0.1〜５ｇ／の範囲に調整したステイ
ナー・シヨルテ改良培地（以下、単に改良培地と
いう）が用あられる。 培地に添加されるシクロデキストリンまたはそ
の誘導体としては、前記メチル化β―CDのほか、
メチル化α―シクロデキストリン、メチル化γ―
シクロデキストリンなどのエーテル誘導体、α―
シクロデキストリン、β―シクロデキストリンお
よびγ―シクロデキストリンなどの異性体のほか
アミノ化誘導体やエステル化誘導体などが挙げら
れ、それらは単独でまたは２種以上を併用して用
いられる。これらのうち、メチル化β―CDがも
つとも良好な添加効果を示す。その添加量はとく
に限定されないが、通常、0.001〜５ｇ／、好
ましくは約0.5〜2.5ｇ／である。 本発明者らは百日ぜき菌の大規模培養における
菌増殖、Ｆ―HAおよびLPF―HA産生量の増大
には培養温度ならびにDOの制御が大きな要因と
なることを初めて認め、かつ消泡操作の有無さら
に培地のPHの制御も大きく影響することを明らか
にした。これらの成績について以下説明する。 培養温度については、百日ぜき菌相菌東浜株
をボルデ・ジヤング培地で継代したものを種菌と
し、メチル化β―CD1.0ｇ／を添加した改良培
地10mlに0.2IOU／mlになるように接種し、温度
勾配培養装置TN112D（東洋科学産業製）を用い、
培養温度を17℃から42℃の範囲で振盪培養60回／
分にて48時間振盪培養して至適範囲を調べた。増
殖した菌数は光電比色計コールマンジユニア6D
型（コールマン社製）を用い、OD650における
測定値から換算して求めた。なお、この実験は実
験室的小規模にて振盪培養で行なつたが、培養温
度に関しては大規模な通気撹拌培養でも同傾向を
示す。 その結果を第１図に示したが、菌の増殖は20〜
37℃の範囲が望ましく、より好ましくは23〜37℃
であつた。 培地の溶存酸素量（DO）は0.7〜6.0ppm、好
ましくは1.0〜5.5ppmの範囲に保持される。この
範囲内に制御することにより、百日ぜき菌の増殖
が増大するとともに、所望のLPF―HAおよびＦ
―HAの産生も著しく増大する。 なお、DO制御には通気量と撹拌速度の制御を
組合せて行なうのがもつともよく、通気量を撹拌
速度はとくに限定されないが、通常の通気撹拌槽
を用いた場合には、空気の通気量は3VVM以下、
通常0.1〜2VVM、好ましくは0.1〜1.5VVMの範
囲であり、撹拌速度は600rpm以下、通常50〜
350rpm、好ましくは100〜250rpmの範囲である。
ただし、純酸素を併用する場合は通気量あるいは
撹拌速度は減ずることができる。 また、消泡操作の有無によつても培養液中の菌
数増加およびＦ―HA、LPF―HA量の収率が大
きく影響され、後述の実施例１と同様の実験条件
で培養した場合、消泡を行わないときには泡に付
着した菌体がそのまま槽壁に累積されたり、排気
ノズルから流出されたりして培養液中の菌数、Ｆ
―HAおよびLPF―HA量ともに数〜80％程度の
減弱が認められた。なお、消泡は機械的消泡と化
学的消泡剤のいずれも適用され、例えば回転デイ
スク式、スプレーノズル方式などの公知の消泡用
装置を用いるか、あるいは通常の脂肪酸エステル
系、シリコン系、アルコール系などの化学的消泡
剤を用いることができる。なお、培養液からの
HA画分の採取、精製等の点からは機械的消泡手
段を用いるのがより好ましい。 培地PHの至適範囲を知るため、PHを種々に変え
て菌の増殖を調べた。DOを2.5ppmと一定にした
以外は後述の実施例１と同様の実験条件で培養し
た。PH6.0〜9.0の範囲ではいずれも菌増殖は達せ
られ、PH6.5〜8.5、とくにPH6.8〜7.5の範囲では
菌増殖速度が若干増大することが認められた。 本発明による培養温度、溶存酸素量さらには消
泡、PHなどの制御は自動制御および手動制御のい
ずれも採用される。 また、目的とするHA画分を高収率で得るには
菌の培養状態のチエツクが重要であり、対数増殖
期から転換期を経て定常期に至るまでの菌発育段
階において採取するのがもつとも望ましく、それ
は接種菌によつて変るが、通常７〜40時間に相当
し、例えば、1.0IOU／mlの接種菌量の場合には
通常24〜35時間である。 実施例 つぎに実施例を挙げて本発明をさらに具体的に
説明するが本発明はこれらに限定されない。 実施例 １ 50の醗酵槽（丸菱理化(株)製）に、下記第１表
に示す組成を有する改良培地にメチル化β―CD
を終濃度1.0ｇ／になるように添加した培地35
を加え、百日ぜき菌相菌を1.0IOU／mlの量
で接種し、スパージヤーによる槽底からの通気撹
拌培養系でDOの制御範囲を種々変え、温度35
℃、PH7.2に制御し、消泡手段として機械的消泡
を用い、それぞれ24時間培養を行なつた。
【表】
して用いる。
得られた培養液について、先と同様にして菌数
を測定し、またＦ―HAを血球凝集試験（Sato，
Y.et.al.Infect.Immun.７，929〜999、1973を参
照）により測定、LPF―HAをin vitroではHp―
ELISA法（左藤ら、第28回毒素シンポジウム予
稿集、141〜144、1981を参照）による単位
（LPEu／mlと略記する）を測定し、in vivoでは
dd／Ｙマウス（４週令、雌）を用いてLPF―HA
静注３日後の白血球数をカウントする方法（鈴木
ら、第29回毒素シンポジウム予稿集、１〜５、
1982を参照）によつて測定した。その結果を第２
図に示す。 第２図から明らかなように、菌増殖ならびに
HA画分の高単位の産生が見られるのはDOが0.7
〜6.0ppmであり、DO1.0〜5.5ppmでは、とくに
良好な結果が得られた。 比較例１〜10および実施例２〜５ 培養条件を種々かえて百日ぜき菌HA画分の産
生量を比較検討した。すなわち、従来の通気撹拌
を一定とする方法と本発明に基づく通気撹拌を連
続的に変化させる方法について比較した。 14の通気撹拌培養装置（NBS社製）に、実
施例１で用いたものと同じメチル化β―CDを最
終濃度1.0ｇ／添加した改良培地10を加え、
百日ぜき菌相菌を1.0IOU／mlの量で接種し、
スパージヤーによる槽底からの通気撹拌培養系
で、第２表に示す条件下に、すべて35℃で36時間
培養した。 通気撹拌を一定とし消泡処理を行なわない培養
は第２表中の比較例１〜５，７および８である。
その中では比較例５の100rpmで0.5rrmという条
件がHA画分の産生量は良好であつた。しかしな
がら、その場合においても培養10時間まではある
程度の対数増殖（約10IOU／ml）を示したが、そ
の後急激に増殖速度が減じ36時間後においても約
15IOU／mlにとどまり、HA画分産生量はＦ―
HAが16HA／ml、LPF―HAが100IOU／mlでき
わめて低く、48時間後まで培養を続けた場合にお
いてもほとんど増加しなかつた。 また、0.2vvmで通気し、撹拌を500rpmあるい
は600rpmの一定とし、消泡処理をしない培養系
は、比較例７，８であるが、いずれの場合も培養
５〜10時間で、激しい発泡のために菌体が槽壁上
部に付着するか培養液が槽外へ流失し、それを36
時間後にすべて回収混合した場合においてもHA
画分量はきわめて低かつた。 DOを制御する消泡処理を行なわない培養系の
比較例10においても、同様の培養液の流失や菌体
の槽壁への付着がおこり、HA画分量は低かつ
た。 通気撹拌を一定とし、かつ消泡処理を行なう培
養系は比較例６および９である。いずれの場合
も、培養初期のDOがHA画分産生にとつて不適
当な6.0ppm以上にあり、培養の進行に併ないDO
は連続的に下降しつづける36時間以前に菌増殖お
よびHA産生に不適当な0.7ppm以下の状態に達し
ていた。本発明の方法を一部加味して化学的消泡
処理を行なつた比較例９では、36時間培養後にお
いて80IUO／mlに達したが、Ｆ―HAは128HA／
ml、LPF―HAは500LPEU／ml程度であつた。
得られた培養液について、先と同様にして菌数
を測定し、またＦ―HAを血球凝集試験（Sato，
Y.et.al.Infect.Immun.７，929〜999、1973を参
照）により測定、LPF―HAをin vitroではHp―
ELISA法（左藤ら、第28回毒素シンポジウム予
稿集、141〜144、1981を参照）による単位
（LPEu／mlと略記する）を測定し、in vivoでは
dd／Ｙマウス（４週令、雌）を用いてLPF―HA
静注３日後の白血球数をカウントする方法（鈴木
ら、第29回毒素シンポジウム予稿集、１〜５、
1982を参照）によつて測定した。その結果を第２
図に示す。 第２図から明らかなように、菌増殖ならびに
HA画分の高単位の産生が見られるのはDOが0.7
〜6.0ppmであり、DO1.0〜5.5ppmでは、とくに
良好な結果が得られた。 比較例１〜10および実施例２〜５ 培養条件を種々かえて百日ぜき菌HA画分の産
生量を比較検討した。すなわち、従来の通気撹拌
を一定とする方法と本発明に基づく通気撹拌を連
続的に変化させる方法について比較した。 14の通気撹拌培養装置（NBS社製）に、実
施例１で用いたものと同じメチル化β―CDを最
終濃度1.0ｇ／添加した改良培地10を加え、
百日ぜき菌相菌を1.0IOU／mlの量で接種し、
スパージヤーによる槽底からの通気撹拌培養系
で、第２表に示す条件下に、すべて35℃で36時間
培養した。 通気撹拌を一定とし消泡処理を行なわない培養
は第２表中の比較例１〜５，７および８である。
その中では比較例５の100rpmで0.5rrmという条
件がHA画分の産生量は良好であつた。しかしな
がら、その場合においても培養10時間まではある
程度の対数増殖（約10IOU／ml）を示したが、そ
の後急激に増殖速度が減じ36時間後においても約
15IOU／mlにとどまり、HA画分産生量はＦ―
HAが16HA／ml、LPF―HAが100IOU／mlでき
わめて低く、48時間後まで培養を続けた場合にお
いてもほとんど増加しなかつた。 また、0.2vvmで通気し、撹拌を500rpmあるい
は600rpmの一定とし、消泡処理をしない培養系
は、比較例７，８であるが、いずれの場合も培養
５〜10時間で、激しい発泡のために菌体が槽壁上
部に付着するか培養液が槽外へ流失し、それを36
時間後にすべて回収混合した場合においてもHA
画分量はきわめて低かつた。 DOを制御する消泡処理を行なわない培養系の
比較例10においても、同様の培養液の流失や菌体
の槽壁への付着がおこり、HA画分量は低かつ
た。 通気撹拌を一定とし、かつ消泡処理を行なう培
養系は比較例６および９である。いずれの場合
も、培養初期のDOがHA画分産生にとつて不適
当な6.0ppm以上にあり、培養の進行に併ないDO
は連続的に下降しつづける36時間以前に菌増殖お
よびHA産生に不適当な0.7ppm以下の状態に達し
ていた。本発明の方法を一部加味して化学的消泡
処理を行なつた比較例９では、36時間培養後にお
いて80IUO／mlに達したが、Ｆ―HAは128HA／
ml、LPF―HAは500LPEU／ml程度であつた。
【表】
【表】
一方、培養液中のDOをDOコントローラ
（NBS社製）を用いて自動的に連続的に通気量あ
るいは撹拌速度を変化させて、1.6〜3.5ppmとな
るように制御しかつ消泡処理をしながら培養を行
なつたものが実施例２〜５であるが、それらは培
養10時間後においても対数増殖を維持し、最終的
には36時間できわめて高い菌数、Ｆ―HA量およ
びLPF―HA量を得ることができた。 なお、上方からの表面通気による方法では、
HA画分の産生は全く認められなかつた。 これらの成績から明らかなように、発酵槽を用
いた通気撹拌培養では、DO非制御下においては
消泡処理をした場合に菌増殖は認められるが、そ
れらの例ではＦ―HAおよびLPF―HAはいずれ
も産生量が低いことがわかつた。一方、DO制御
下で行つた場合には菌増殖のみならずＦ―HA量
およびLPF―HA量とも著しく増大した。このよ
うに発酵槽を用いた通気撹拌培養では、DO制御
によつて菌増殖は勿論、目的とする百日ぜき菌
HA産生量の著しい増大が図れることが判明し
た。 比較例11ならびに実施例６および７ 上述のように、本発明による特定の条件制御下
に培養することにより目的とする百日ぜき菌HA
画分の大量産生が達成されるが、これを従来公知
の静置培養における場合と比較すると第３表に示
すとおりである。なお、表に示す各培養の条件は
下記のとおりである。ただし、菌接種量と培養温
度はそれぞれ1.0IOU／ml、および35℃で共通と
した。 (A) 静置培養（比較例11） 培養容器：ルー瓶、1.5容 培地：実施例１で用いたものと同じ改良培地
0.2 培養時間：120時間 (B) 制御培養（本発明の方法）（実施例６および
７） 培養容器：300容醗酵槽（丸菱理化製） 培地：実施例１で用いたものと同じ改良培地、
200；メチル化β―CD（実施例６）ま
たはメチル化α―CD（実施例７）1.0
ｇ／を添加 DO制御：2.2―2.4ppm 消泡：機械的消泡手段（回転デイスク方式によ
る） PH制御：PH7.3 培養時間：35時間 上記結果を第３表に示す。
（NBS社製）を用いて自動的に連続的に通気量あ
るいは撹拌速度を変化させて、1.6〜3.5ppmとな
るように制御しかつ消泡処理をしながら培養を行
なつたものが実施例２〜５であるが、それらは培
養10時間後においても対数増殖を維持し、最終的
には36時間できわめて高い菌数、Ｆ―HA量およ
びLPF―HA量を得ることができた。 なお、上方からの表面通気による方法では、
HA画分の産生は全く認められなかつた。 これらの成績から明らかなように、発酵槽を用
いた通気撹拌培養では、DO非制御下においては
消泡処理をした場合に菌増殖は認められるが、そ
れらの例ではＦ―HAおよびLPF―HAはいずれ
も産生量が低いことがわかつた。一方、DO制御
下で行つた場合には菌増殖のみならずＦ―HA量
およびLPF―HA量とも著しく増大した。このよ
うに発酵槽を用いた通気撹拌培養では、DO制御
によつて菌増殖は勿論、目的とする百日ぜき菌
HA産生量の著しい増大が図れることが判明し
た。 比較例11ならびに実施例６および７ 上述のように、本発明による特定の条件制御下
に培養することにより目的とする百日ぜき菌HA
画分の大量産生が達成されるが、これを従来公知
の静置培養における場合と比較すると第３表に示
すとおりである。なお、表に示す各培養の条件は
下記のとおりである。ただし、菌接種量と培養温
度はそれぞれ1.0IOU／ml、および35℃で共通と
した。 (A) 静置培養（比較例11） 培養容器：ルー瓶、1.5容 培地：実施例１で用いたものと同じ改良培地
0.2 培養時間：120時間 (B) 制御培養（本発明の方法）（実施例６および
７） 培養容器：300容醗酵槽（丸菱理化製） 培地：実施例１で用いたものと同じ改良培地、
200；メチル化β―CD（実施例６）ま
たはメチル化α―CD（実施例７）1.0
ｇ／を添加 DO制御：2.2―2.4ppm 消泡：機械的消泡手段（回転デイスク方式によ
る） PH制御：PH7.3 培養時間：35時間 上記結果を第３表に示す。
【表】
第３表の結果からも明らかなように、本発明方
法によれば従来静置法に比べて菌増殖および
LPF―HA量ともに著しく増大しており、Ｆ―
HA量は同等かそれ以上で、例えば菌数は２〜３
倍、LPF―HA量は10倍以上増大し、培養時間は
120時間から35時間へと大幅に短縮されている。 なお、実施例６および７におけるDO制御下で
の培養の場合の菌数、Ｆ―HA量およびLPF―
HA量の経時的な推移を第３図および、第４
図およびにそれぞれ示した。これらの図から
も明らかなように、本発明によるDO制御下に培
養した場合には菌数の増大とともにＦ―HA量お
よびLPF―HA量も著しく増大される。
法によれば従来静置法に比べて菌増殖および
LPF―HA量ともに著しく増大しており、Ｆ―
HA量は同等かそれ以上で、例えば菌数は２〜３
倍、LPF―HA量は10倍以上増大し、培養時間は
120時間から35時間へと大幅に短縮されている。 なお、実施例６および７におけるDO制御下で
の培養の場合の菌数、Ｆ―HA量およびLPF―
HA量の経時的な推移を第３図および、第４
図およびにそれぞれ示した。これらの図から
も明らかなように、本発明によるDO制御下に培
養した場合には菌数の増大とともにＦ―HA量お
よびLPF―HA量も著しく増大される。
第１図は百日ぜき菌の増殖と培養温度の関係を
示すグラフ、第２図は培養液中のDO制御範囲と
24時間培養後の菌数、Ｆ―HA量およびLPF―
HA量を示すグラフ、第３図およびならびに
第４図およびはDO2.2〜2.4ppmの制御下に
培養した場合の菌数、Ｆ―HA量およびLPF―
HA量の経時的な推移を示すグラフである。
示すグラフ、第２図は培養液中のDO制御範囲と
24時間培養後の菌数、Ｆ―HA量およびLPF―
HA量を示すグラフ、第３図およびならびに
第４図およびはDO2.2〜2.4ppmの制御下に
培養した場合の菌数、Ｆ―HA量およびLPF―
HA量の経時的な推移を示すグラフである。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ 百日ぜき菌をシクロデキストリンまたはその
誘導体を添加した液状培地に接種し、培養温度20
〜37℃で培地の溶存酸素量を0.7〜6.0ppmの範囲
に保ちかつ消泡処理をしながら通気撹拌培養し、
対数増殖期ないし定常期の菌発育段階で感染防御
抗原HA画分を採取することを特徴とする百日ぜ
き菌の感染防御抗原HA画分の製造方法。 ２ 液状培地がカザミノ酸を0.1〜20ｇ／、ア
スコルビン酸を0.01〜１ｇ／、グルタチオンを
0.1〜50ｇ／およびシクロデキストリンまたは
その誘導体を0.001〜５ｇ／含有している前記
第１項の方法。 ３ シクロデキストリンまたはその誘導体がメチ
ル化α―シクロデキストリン、メチル化α―シク
ロデキストリン、メチル化γ―シクロデキストリ
ン、α―シクロデキストリン、β―シクロデキス
トリンおよびγ―シクロデキストリンから選ばれ
る１種または２種以上である前記第１項の方法。 ４ 培養時間を７〜40時間とする前記第１項の方
法。 ５ 消泡処理が、機械的消泡手段、化学的消泡剤
の添加またはそれらの組合わせによる前記第１項
の方法。 ６ PHが6.0〜9.0の範囲である前記第１項の方
法。
Priority Applications (10)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP58054680A JPS59181222A (ja) | 1983-03-30 | 1983-03-30 | 百日ぜき菌の感染防御抗原ｈａ画分の製造方法 |
| CA000450495A CA1213234A (en) | 1983-03-30 | 1984-03-26 | Method for the production of ha fraction containing protective antigens of bordetella pertussis and pertussis vaccine |
| KR1019840001645A KR900007658B1 (ko) | 1983-03-30 | 1984-03-29 | 백일해균 예방항원을 함유하는 ha 유분(留分)과 백일해 왁진의 제조방법 |
| DE8484103504T DE3484778D1 (de) | 1983-03-30 | 1984-03-29 | Verfahren zur herstellung der bordetella-pertussis-schutzantigene enthaltenden ha fraktion und keuchhustenvakzin. |
| AU26230/84A AU564634B2 (en) | 1983-03-30 | 1984-03-29 | Method for production of ha fraction containing protective antigens |
| AT84103504T ATE65028T1 (de) | 1983-03-30 | 1984-03-29 | Verfahren zur herstellung der bordetellapertussis-schutzantigene enthaltenden ha fraktion und keuchhustenvakzin. |
| EP84103504A EP0121249B1 (en) | 1983-03-30 | 1984-03-29 | Method for the production of ha fraction containing protective antigens of bordetella pertussis and pertussis vaccine |
| SU843728854A SU1447266A3 (ru) | 1983-03-30 | 1984-03-29 | Способ получени фракции НА, содержащей защитный антиген ВоRDетеLLа реRтUSSIS |
| ES531112A ES531112A0 (es) | 1983-03-30 | 1984-03-29 | Un metodo para la produccion de una fraccion ha que contiene antigenos protectores de bordetella pertussis |
| US06/874,670 US4687738A (en) | 1983-03-30 | 1986-06-16 | Method for the production of HA fraction containing protective antigens of Bordetella pertussis and pertussis vaccine |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP58054680A JPS59181222A (ja) | 1983-03-30 | 1983-03-30 | 百日ぜき菌の感染防御抗原ｈａ画分の製造方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS59181222A JPS59181222A (ja) | 1984-10-15 |
| JPS64930B2 true JPS64930B2 (ja) | 1989-01-10 |
Family
ID=12977497
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP58054680A Granted JPS59181222A (ja) | 1983-03-30 | 1983-03-30 | 百日ぜき菌の感染防御抗原ｈａ画分の製造方法 |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS59181222A (ja) |
| SU (1) | SU1447266A3 (ja) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2148412C1 (ru) * | 1999-08-06 | 2000-05-10 | Москаленко Екатерина Петровна | Способ получения протективного коклюшного антигена |
| BR112014017898B1 (pt) * | 2012-02-01 | 2021-10-13 | Glaxosmithkline Biologicals S.A. | Processo de fermentação |
-
1983
- 1983-03-30 JP JP58054680A patent/JPS59181222A/ja active Granted
-
1984
- 1984-03-29 SU SU843728854A patent/SU1447266A3/ru active
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS59181222A (ja) | 1984-10-15 |
| SU1447266A3 (ru) | 1988-12-23 |
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