JPH0121955B2

JPH0121955B2 -

Info

Publication number: JPH0121955B2
Application number: JP58031388A
Authority: JP
Inventors: Mieko Iwai; Yoshio Tominaga; Katsumi Nakanishi
Original assignee: Daikin Kogyo Co Ltd
Current assignee: Daikin Industries Ltd
Priority date: 1983-02-25
Filing date: 1983-02-25
Publication date: 1989-04-24
Also published as: EP0117553A2; DK102784D0; EP0117553A3; JPS59156282A; US4665029A; DK102784A

Description

【発明の詳細な説明】本発明は、新規耐熱性リパーゼの製造法に関
し、更に詳しくは、リゾパス属に属するリゾパ
ス・キネンシス（Rhizopus chinensis）を培養す
ることによつて耐熱性およびPH安定性の優れた新
規リパーゼを製造する方法に関する。

リパーゼは、脂肪や脂肪酸エステルなどを分解
する酵素であり、従来、動物臓器、微生物などか
ら抽出、製造されている。しかし、これまでに得
られているリパーゼは、一般に熱に対して不安定
であり、PH安定域が狭い為、工業的利用に適して
いない。

たとえば、リゾパス属に属するリゾパス・キネ
ンシスHI−Ｓ株を培養し、培養物からリパーゼ
を採取する方法は知られている（特公昭56−
42266号公報参照）。しかし、この方法で得られる
リパーゼは50℃を越える温度で失活し、また安定
PH領域がPH4.0〜8.0と狭いという欠点を有してい
る。

本発明者は、微生物を生産するリパーゼについ
て研究を行つた結果、リゾパス属に属するリゾパ
ス・キネンシス（IFO 4745）の培養により得ら
れるリパーゼは、耐熱性およびPH安定性に優れて
いることを見い出し、本発明を完成するに至つ
た。

すなわち、本発明の要旨は、30〜80℃の温度で
15分間処理した後少なくとも95％の残存活性を示
すことを特徴とする新規耐熱性リパーゼ、および
リゾパス属に属するリゾパス・キネンシス
（IFO4745）を培養し、培養液中に耐熱性リパー
ゼを生成、蓄積させ、培養液から耐熱性リパーゼ
を採取することを特徴とする耐熱性リパーゼの製
造法に存する。

本発明の耐熱性リパーゼの中でも一定の高温条
件では長時間の熱処理後により高い残存活性を示
すものがより好ましく、また一層高温で高い残存
活性を示すものが好ましいことは言うまでもな
い。たとえば 30〜80℃の温度で15分間処理した後100％の残
存活性を示すもの、 80℃で60分間処理した後少なくとも95％の残存
活性を示すもの、 80℃で120分間処理した後少なくとも80％の残
存活性を示すもの、 90℃で60分間処理した後少なくとも60％の残存
活性を示すもの、さらに 90℃で120分間処理した後少なくとも35％の残
存活性を示すものなどが好ましい本発明の耐熱性
リパーゼである。

本発明で用いるリゾパス・キネンシスは、財団
法人発酵研究所にIFO4745として寄託された公知
菌である。

本発明の製造法においては、リゾパス・キネン
シスを次の様にして培養する。

培地は、液状でも固体でもよく、培養は、静置
培養、振とう培養、通気撹拌培養のいずれでも行
えるが、好ましくは液状培地を用い、振とう培養
または通気撹拌培養により行う。

炭素源としては、グルコース、サツカロース、
マンノース、デキストリン、セルロース、デン
粉、グリセリン、ソルビツト、ふすま、米ぬかな
どが用いられる。

窒素源としては、ペプトン、肉汁エキス、酵母
エキス、乾燥酵母、大豆粉、大豆粕、カゼイン、
グルテン、カザミノ酸、コーンスチープリカー、
尿素、コーンスチープミール、アンモニウム塩、
硝酸塩などが利用される。

無機塩としては、各種リン酸塩、硫酸塩、塩酸
塩などが用いられる。

これらの他に、所望によりビタミン類、核酸な
どを培地に添加してもよい。

通常、菌は前培養を行つた後、主培地に接種す
る。

培養温度は20〜40℃、培養時間は２〜10日であ
り、培地は微酸性ないし中性が好ましい。また通
気は培地１当り0.5〜１／分の量が好ましい。

液体培地の場合、耐熱性リパーゼは、主に培養
液中に蓄積される。従つて、培養物を過または
遠心分離して菌体を除去し、液または上澄液か
らリパーゼを採取する。

耐熱性リパーゼは、既知の分離精製手段により
採取することができる。たとえば、無機塩（たと
えば硫酸アンモニウム、硫酸ナトリウム、塩化ナ
トリウムなど）による塩析、親水性有機溶媒（た
とえばアルコール類、アセトンなど）による分画
沈澱、イオン交換樹脂などによる吸脱着、クロマ
トグラフイ、モレキユラーシーブ法、蛋白沈澱剤
（たとえば核酸、タンニン、リンタングステン酸
など）による沈澱、等電点沈澱法、透析法、電気
透析法、電気泳動法などをリパーゼの分離精製法
として例示することができる。

本発明で得られる耐熱性リパーゼは、次の様な
特異性質を有している。

(1) PH安定性 PH2.5〜11という広い範囲において100％の残
存活性を示し、PH安定性がよい（第１図参照）。

(2) 温度安定性 75℃で15分間の熱処理では全く失活せず、80
℃で120分間の処理後に80％、90℃で60分間の
処理後に60％の残存活性を示し、耐熱性が非常
に高い（第２図および第３図参照）。

(3) 作用最適PH PH6.5ないし中性付近に存在する（第４図参
照）。

(4) 作用最適温度 40〜60℃とやや高温側に広い最適温度範囲が
ある（第５図参照）。

(5) トリグリセリドに対する位置特異性トリグリセリドの１および３位のエステル結
合のみを切断し、２位のエステル結合には作用
しないという位置特異性がある。

(6) 単酸基トリグリセリドに対する脂肪酸特異性
トリオレインに対する分解活性を100とすると、
相対分解活性は、トリカプリンに対して154、
トリラウリンに対して89となる（第６図参照）。

(7) 等電点等電点電気泳動法によれば9.2である。

(8) 分子量 SDS電気泳動法によれば30000である。

これらの性質は次の様にして測定された。

(a) リパーゼ活性測定法オリーブ油１ｇ、Ｍ／20酢酸緩衝液（PH5.6）
＋Ｍ／100CaCl₂5mlを含む反応液を内径4.4cm、
高さ8.2cmのガラス容器に入れ、適宜希釈した
酵素液（0.05〜１ml）を加え、30℃で１時間、
500rpmで撹拌して反応させた後、エタノール
20mlを加えて反応を終了させた。

酵素力価は、遊離する脂肪酸をＮ／20水酸化
カリウムを用いてPH10を終点とする滴定により
求めた。１分間に１マイクロ当量の脂肪酸を遊
離させる酵素量を１単位とした。

(b) 作用最適PH曲線の測定条件オリーブ油１ｇおよびMcIlvaine緩衝液５ml
中に酵素溶液0.5mlを加え、30℃で60分間、
500rpmで撹伴して反応させ、最大活性を100と
して相対活性を求めた。

(c) 温度安定性曲線の測定条件まず、酵素溶液を30、50、60、70、75、80、
90、95および100℃で15分間保つた後、５分間
氷冷し、残存活性を上記(a)のの方法に従つて測
定した。その結果を示したのが第２図である。

一方、酵素溶液を80℃または90℃で、０、
30、60、90および120分間保つた後、５分間氷
冷し、同じく残存活性を測定した。その結果を
示したのが第３図である。

(d) PH安定性曲線の測定条件酵素溶液を、PH２〜４についてはグリシン−
塩酸緩衝液、PH４〜７についてはMcIlvaine緩
衝液、PH７〜12についてはグリシン−水酸化ナ
トリウム緩衝液中に加え、30℃で15時間処理し
た後、残存活性を上記(a)の方法に従つて測定し
た。

(e) 作用最適温度曲線の測定条件オリーブ油１ｇおよびＭ／20酢酸緩衝液（PH
5.6）＋Ｍ／100CaCl₂5ml中に酵素溶液を加え、
30〜80℃の温度で60分間、500rpmで撹拌して
反応させ、最大活性を100として相対活性を求
めた。

本発明の製造法により得られるリパーゼは、上
述の様に耐熱性がよく、PH安定領域も広いから、
工業的に非常に有用である。たとえば、製油時に
用いると高温での作業が可能となり、油の流動性
が向上し、反応が容易になる。また、洗剤用酵
素、消化酵素としても優れたものである。

次に実施例を示し、本発明を具体的に説明す
る。

実施例ペプトン５％、グルコース２％、NaNO₃0.1
％、KH₂PO₄0.1％、MgSO₄・7H₂O0.05％を含む
培地をPH6.0に調整した後、その60mlずつを500ml
容坂口フラスコ50本に分注し、フラスコ１本当り
胞子数10⁵個になるように植菌し、27℃で96時間
振とう培養を行い、40単位／mlの培養液3000ml
を得た。

この液に、最終80％飽和になる様に硫安を加
え、塩析沈澱させた後、SP−Sephadex（商標）
Ｃ−50、Sephadex Ｇ−100、等電点電気泳動の
精製手段により、デイスク電気泳動的に均質なリ
パーゼを得た。回収率60％。

得られたリパーゼの活性は、比活性3000単位／
mgであつた。

【図面の簡単な説明】

第１図は、耐熱性リパーゼのPH安定性曲線、第
２図および第３図は、耐熱性リパーゼの熱安定性
曲線、第４図は、耐熱性リパーゼの作用最適PH曲
線、第５図は、耐熱性リパーゼの作用最適温度曲
線、および第６図は、単酸基トリグリセリドに対
する脂肪酸特異性を示す図である。

Claims

【特許請求の範囲】１ PH2.5〜11において100％の残存活性を示し、
30〜80℃の温度で15分間処理した後少なくとも95
％の残存活性を示し、PH6.5ないし中性付近に作
用最適PHがあり、40〜60℃に最適温度範囲があ
り、トリグリセリドの１および３位のエステル結
合のみを切断し、２位のエステル結合には作用し
ないというトリグリセリドに対する位置特異性が
あり、トリオレインに対する分解活性を100とす
ると、相対分解活性は、トリカプリンに対して
154、トリラウリンに対して89であり、電気泳動
法により測定した等電点は9.2であり、SDS電気
泳動法により測定した分子量は30000であること
を特徴とする新規耐熱性リパーゼ。２ 30〜80℃の温度で15分間処理した後100％の
残存活性を示す特許請求の範囲第１項記載の耐熱
性リパーゼ。３ 80℃で60分間処理した後少なくとも95％の残
存活性を示す特許請求の範囲第１項記載の耐熱性
リパーゼ。４ 80℃で120分間処理した後少なくとも80％の
残存活性を示す特許請求の範囲第１項記載の耐熱
性リパーゼ。５ 90℃で60分間処理した後少なくとも60％の残
存活性を示す特許請求の範囲第１項記載の耐熱性
リパーゼ。６ 90℃で120分間処理した後少なくとも35％の
残存活性を示す特許請求の範囲第１項記載の耐熱
性リパーゼ。７リゾパス属に属するリゾパス・キネンシス
（IFO 4745）（微工研条寄936号）を培養し、培養
液中に耐熱性リパーゼを生成、蓄積させ、培養液
から耐熱性リパーゼを採取することを特徴とする
耐熱性リパーゼの製造法。